第五章植物細(xì)胞工程,上游工程：細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞的遺傳操作和細(xì)胞的保藏。下游工程：以植物細(xì)胞為基本單位，在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖的過程。包括：基因工程、染色體工程、染色體組工程、細(xì)胞質(zhì)工程、細(xì)胞融合工程。,第一節(jié)基本概念,第二節(jié)植物細(xì)胞工程發(fā)展簡(jiǎn)史,第三節(jié)植物細(xì)胞的形態(tài)及生理特征,第四節(jié)植細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù),第五節(jié)影響植物次級(jí)代謝物累積的因素第六節(jié)植細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器,第七節(jié)進(jìn)展與展望,第一節(jié)基本概念,1植物細(xì)胞的全能性（Totipotency）2植物組織和器官培養(yǎng)3植物的分化胚胎發(fā)生（從精卵結(jié)合到種子）器官發(fā)生（從種子到植物體）4植物的脫分化：已分化為組織器官的細(xì)胞離體條件下變成未分化的細(xì)胞和組織的過程5植物的再分化：脫分化的愈傷組織再分化形成胚狀體或愈傷組織直接分化為胚狀體,6植物無菌培養(yǎng)植物培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)（由外植體脫分化）懸浮培養(yǎng)離體器官的培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)7細(xì)胞培養(yǎng)得到單個(gè)細(xì)胞無性繁殖系,8分生組織培養(yǎng)（生長(zhǎng)錐培養(yǎng)）9外植體10無性繁殖系11突變體12繼代培養(yǎng)（subculture)13初級(jí)代謝物，次級(jí)代謝物和次級(jí)代謝作用,第二節(jié)植物細(xì)胞工程發(fā)展簡(jiǎn)史,一，20世紀(jì)初德國(guó)植物學(xué)家Haderlandt提出植物細(xì)胞的全能性和離體培養(yǎng)的觀點(diǎn)。發(fā)展了植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，包括：植物微繁殖技術(shù)（試管和人工種子）細(xì)胞雜交技術(shù)體細(xì)胞變異和選擇種子保存技術(shù)植物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù),48利用植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)油脂、蔗糖和蛋白質(zhì),二基本的程序,從完整植物體取得植物組織外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)行脫分化建立細(xì)胞株原生質(zhì)體培養(yǎng)液體懸浮培養(yǎng)和深層大規(guī)模培養(yǎng),三已有200余種植物培養(yǎng)細(xì)胞，可生產(chǎn)300多種人們需要的產(chǎn)品,黃連的培養(yǎng)生產(chǎn)小蘗堿紫草的培養(yǎng)生產(chǎn)紫草素人參培養(yǎng)生產(chǎn)人參皂苷黃花蒿培養(yǎng)生產(chǎn)青蒿素紅豆杉培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇,第三節(jié)植物細(xì)胞的形態(tài)及生理特征,一植物細(xì)胞形態(tài)二植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征三植物細(xì)胞的生理活性物質(zhì)酶類、維生素、植物激素、植物殺菌素、生物堿、糖苷、揮發(fā)油、有機(jī)酸,四植物細(xì)胞的生理特征,細(xì)胞團(tuán)的產(chǎn)生抗張力強(qiáng)、抗剪切力弱供氧要控制，必要時(shí)通二氧化碳光照防止泡沫產(chǎn)生，包埋細(xì)胞防細(xì)胞黏附于反應(yīng)器,第四節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù),材料制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)方法選擇,一植物材料的準(zhǔn)備,1外植體的無菌處理2外植體的培養(yǎng),108清潔液的三種配方,二培養(yǎng)基及組成,1無機(jī)鹽：大量元素濃度大于30mg/L的無機(jī)元素微量元素濃度小于30mg/L的無機(jī)元素2碳源：糖類、肌醇、甘油等3植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑生物素、分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯4有機(jī)氮源蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物和各種氨基酸5維生素,三培養(yǎng)方法,1培養(yǎng)方式：原生質(zhì)體培養(yǎng)單倍體細(xì)胞培養(yǎng)固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)固定化培養(yǎng),2植物大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng),（1）成批培養(yǎng)法：一次性將培養(yǎng)基加入反應(yīng)器中，接種培養(yǎng)后收獲細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)。改進(jìn)：氣升式反應(yīng)器,以通氣體代替攪拌兩步培養(yǎng)法：一個(gè)反應(yīng)器用于細(xì)胞量的積累，另一個(gè)反應(yīng)器生產(chǎn)次級(jí)代謝物（2）半連續(xù)培養(yǎng)法在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行交換的培養(yǎng)方法,（3）連續(xù)培養(yǎng)法在投料和接種培養(yǎng)一定時(shí)間后，以一定速度連續(xù)采集細(xì)胞核培養(yǎng)液，并以同樣速度提供新鮮培養(yǎng)液以使細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境保持恒定的方法。改進(jìn)：二階段連續(xù)培養(yǎng)法（4）固定化培養(yǎng)法固定化反應(yīng)器：網(wǎng)狀多孔板，尼龍網(wǎng)套和中孔纖維膜等,第五節(jié)影響植第物次級(jí)代謝物累積的因素,影響因素：生物條件物理?xiàng)l件化學(xué)條件工業(yè)培養(yǎng)條件,2影響培養(yǎng)細(xì)胞次代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的各種因素,一外植體的選擇,不同外植體的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，其最大次級(jí)產(chǎn)物的累積時(shí)間不同,二培養(yǎng)條件的影響,1培養(yǎng)環(huán)境的內(nèi)在因素接種和誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑供氧和pH,2兩步法培養(yǎng)第一步采用適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基生長(zhǎng)培養(yǎng)基第二步采用適合次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基生產(chǎn)培養(yǎng)基,3培養(yǎng)環(huán)境的外部因素溫度攪拌頻率培養(yǎng)容器光照影響,第六節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器,植物細(xì)胞的特性細(xì)胞體積大抗剪切能力差培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)呼吸率低，對(duì)氧要求低,根據(jù)通氣和攪拌類型，生物反應(yīng)器分為：搖瓶反應(yīng)器攪拌型生物反應(yīng)器環(huán)流生物反應(yīng)器和鼓泡塔生物反應(yīng)器,一機(jī)械攪拌生物反應(yīng)器二鼓泡塔生物反應(yīng)器三氣升式生物反應(yīng)器四轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器五固定化生物反應(yīng)器六各種反應(yīng)器性能比較,第七節(jié)進(jìn)展與展望,新技術(shù)和新方法:誘導(dǎo)子前體飼喂兩相培養(yǎng)毛狀根和冠癭瘤組織培養(yǎng)植物生物轉(zhuǎn)化,一誘導(dǎo)子的應(yīng)用,1誘導(dǎo)子（elicitor)的分類（1）定義：指抗病過程中誘導(dǎo)植物在防御過程中產(chǎn)生植物抗毒素和引起植物過敏反應(yīng)的物質(zhì)，包括生物誘導(dǎo)子（生孢子、酶類、細(xì)胞壁碎片、代謝物及培養(yǎng)基中的成分）和非生物誘導(dǎo)子（不是植物的天然成分，又能觸發(fā)形成生物抗毒素信號(hào)的分子）。用來誘導(dǎo)次生代謝物。（2）內(nèi)源性誘導(dǎo)子來自植物細(xì)胞的分子：細(xì)胞壁降解物、雜多糖、糖蛋白、木質(zhì)素（3）外源性誘導(dǎo)子病源微生物在侵入植物體內(nèi)時(shí)自身的降解產(chǎn)物（如真菌誘導(dǎo)子）分為：多糖類，蛋白類，不飽和脂肪酸類。,2誘導(dǎo)子的作用機(jī)制,（1）膜脂過氧化和膜結(jié)構(gòu)功能的改變（2）生成植保素（抗微生物）（3）蛋白酶抑制劑的生成（4）合成和分泌降解微生物細(xì)胞壁的酶,3誘導(dǎo)子在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用,植物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的誘導(dǎo)子：糖蛋白類：糖基化的氧化牛血清的蛋白和氧化溶菌酶（尼克堿）蛋白質(zhì)類：果膠酶、鏈狀蛋白酶多糖類：鐮刀霉菌絲體、乙烯、水楊酸、幾丁質(zhì)、脫乙酰幾丁質(zhì)、病原體的細(xì)胞溶解物微生物類：真菌誘導(dǎo)子（微黃霉素，灰葡萄孢，大麗輪枝孢和融粘帶酶混合培養(yǎng)液）（紫杉醇）,二前體飼喂,1莽草酸（芳香化合物和多酚化合物）2氨基酸（生物堿和肽類抗生素）3乙酸（前列腺素和大環(huán)抗生素）,三兩相培養(yǎng)法,兩相培養(yǎng)法是在培養(yǎng)細(xì)胞外創(chuàng)造一個(gè)次級(jí)代謝物的儲(chǔ)存單元，方法是加入固相或疏水液相，形成兩相組織培養(yǎng)，達(dá)到收集分泌物的目的兩相培養(yǎng)的條件：添加相無毒，易吸附易溶解。兩相易分開，不吸附培養(yǎng)基,四轉(zhuǎn)基因技術(shù)在次級(jí)代謝生產(chǎn)中的應(yīng)用,1冠癭瘤（根瘤農(nóng)桿菌）組織和毛狀根（發(fā)根農(nóng)桿菌）培養(yǎng)技術(shù)2轉(zhuǎn)基因植物和活性成分生產(chǎn)，如：免疫球蛋白的植物表達(dá),五植物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)與生物制藥,1概念（1）定義：生物轉(zhuǎn)化或生物催化生物離體培養(yǎng)細(xì)胞、器官及細(xì)胞器，利用體系中的酶對(duì)外源化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化（結(jié)構(gòu)修飾），獲得有價(jià)值的產(chǎn)物。,（2）生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)離體生產(chǎn)，細(xì)胞無限生長(zhǎng)，生長(zhǎng)循環(huán)期短（3）可用于生物轉(zhuǎn)化的化合物種類：芳香族化合物、類固醇、生物堿、香豆素、萜類（4）植物生物轉(zhuǎn)化的意義產(chǎn)生新化合物，改造已有化合物,2植物細(xì)胞和器官培養(yǎng)物的生物轉(zhuǎn)化,基因工程，細(xì)胞工程，酶工程等方法生物轉(zhuǎn)化的類型：（1）羥基化（2）糖基化（3）醇和酮的氧化還原反應(yīng)（4）水解反應(yīng),（5）環(huán)化反應(yīng)（6）碳-碳雙鏈的還原反應(yīng)（7）羰基還原反應(yīng)（8）硝基還原反應(yīng),A利用固定化細(xì)胞培