基因克隆及轉(zhuǎn)基因1、 基因克隆及轉(zhuǎn)基因過程1、 設(shè)計引物軟件是DNASTAR.Lasergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。一般原則：1、長度：18-25； 2、GC含量：40-60，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），實在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3端結(jié)尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物連續(xù)配對數(shù)小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特異性如何； （如果克隆的話不能滿足條件也沒辦法。）不是必須條件，但可以考慮：多個基因設(shè)計引物時，可盡量使Tm值相似，方便PCR。步驟：一、打開PrimerSelect和EditSeq。二、在EditSeq中輸入你的序列。引物有一對F和R1、對于F是從5到3，在序列的前部分選擇長度為18-25bp的堿基，如果你是要驗證就隨便選，如果你是要克隆就在最開始選，不符合原則就只能在你選的后邊增或減堿基。2、將選擇的F引物輸入到PrimerSelect中，在File中選擇EnterNewPrimer，復(fù)制，OK，然后可以看到引物的情況，看看長度、Tm、GC含量是不是符合標(biāo)準(zhǔn)，不符合就繼續(xù)選。3、對于R是從3到5，選中序列，在EditSeq的Goodies中選擇第一個“反向互補”，此時序列已反向互補，按照前面F的方法搜索R的引物。、4、注意你想要的目的帶的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出來800大小的目的帶，那就要看看F和R之間的長度在你想要的范圍內(nèi)?？梢詫反向互補，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中選擇Search，點擊第一個Find，開始搜尋。5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中選擇前兩個查看二聚體情況。6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特異性如何。7、因為是克隆，所以引物要有酶切位點，酶切位點的加入主要考慮所用到的表達(dá)載體，在NEBcutter網(wǎng)站中輸入總序列查看可用的酶切位點。在引物上游加入酶切位點，注意加入時載體的表達(dá)的方向，前面的酶切位點在引物F上，后面的酶切位點在引物R上。一般在引物上游還要加上兩個保護堿基。2、 提取醋栗DNA3、 PCR擴增與目的基因回收PCR先找合適的退火溫度，找到后回收時就可以多PCR幾管，一般我們用20ul的體系，PCR5管就可以回收，就是瓊脂糖凝膠回收，將目的基因用刀片切下來，用試劑盒回收?；厥胀昕梢栽倥茈娪緳z測一遍。PCR：20ul體系：滅菌水13.8ul，若模板為質(zhì)粒滅菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul； 10乘Taq buffer2.0ul； 引物F、R各0.5ul； 模板1ul；若為質(zhì)粒0.5ul就夠； 最后加入Taq酶0.2ul，Taq酶現(xiàn)用現(xiàn)拿。過程：我們用的是預(yù)變性943min； 然后進入循環(huán)（要進行克隆的話循環(huán)數(shù)最好不要超過30個），循環(huán)過程：變性9430s，退火 退火溫度下30s，延伸72時間根據(jù)目的基因長度和酶而定，一般Taq酶30s可以延伸1kb； 循環(huán)完成后， 此時尚有正處于合成過程中的dna鏈,為了保證充分的得率,所以再增加7分鐘的72延伸； 最后4保存待用。 4、雙酶切回收沒問題就將回收的目的基因和表達(dá)載體質(zhì)粒進行雙酶切。目的基因回收完可以直接用試劑盒提純，因為就切下來很少的幾個堿基，試劑盒柱上掛不住。表達(dá)載體質(zhì)粒酶切完要瓊脂糖凝膠回收，回收大的片段?；厥胀隀z測一遍。4、 連接5、 大腸桿菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)用的是DH5。步驟：（1） 打開42水浴鍋。（2） 把感受態(tài)放在冰上化，不能放太久，將質(zhì)粒（連接產(chǎn)物）加感受態(tài)細(xì)胞50ul，指尖混勻。（3） 在冰上放3040min。（4） 90s嚴(yán)格計時，放入水浴鍋熱激（42），之后立即放冰上12min，之后加入500ul純凈LB液體培養(yǎng)基（37最好），混勻。（5） 放入37搖菌箱，45min1h（180200rpm）（這一步的目的是菌恢復(fù)活性）。（6） 離心（12000rpm，1min），然后只留100ul，用槍頭吸打混勻，涂板（LB卡那抗生素的固體培養(yǎng)基）。（7） 放入37培養(yǎng)箱，倒置。 涂板、打開離心管和感受態(tài)離心管的過程都在超凈工作臺里進行。7、 挑菌及搖菌長出單菌落后，超凈工作臺里挑菌，將菌挑在20ul的滅菌水中作為模板進行菌落PCR。將檢測沒問題的菌進行搖菌。搖菌步驟：把菌液分別倒入搖菌管中（10ml的搖菌管），再加入4mlLB液體培養(yǎng)基，加入4ul卡那（始濃度50mg/ml，終濃度50mg/L），放入搖床中（37）過夜搖菌。8、 保菌及提質(zhì)粒將搖的菌在超凈工作臺里分為三部分：（1） 保菌：500ul菌+500ul 50甘油，混勻，放入-80超低溫冰箱保存，備用；（2） 測序：1ml菌用于測序；（3） 提質(zhì)粒：剩下的菌用試劑盒提質(zhì)粒。有時也送一部分提的質(zhì)粒去測序。9、 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化沒問題的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞（EHA105），步驟：（1） 打開37水浴鍋；（2） 取2ul質(zhì)粒+50ul或100ul感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30min；（3） 液氮中冷凍1min；（4） 37水浴溶化細(xì)胞；（5） 加500ul1ml純凈LB液體培養(yǎng)基，混勻；28搖床培養(yǎng)2h（180200rpm）；（6） 離心（12000rpm，1min），然后只留100ul，用槍頭吸打混勻，涂板（LB卡那抗生素+Rif抗生素的固體培養(yǎng)基）。（7） 放入28培養(yǎng)箱，倒置，培養(yǎng)23天。 涂板、打開離心管和感受態(tài)離心管的過程都在超凈工作臺里進行。10、挑菌及搖菌挑菌及菌落PCR同7。搖菌時加4ml LB液體培養(yǎng)基，4ul Kan，8ul Rif。搖菌大約40多小時。（此步為小搖）11、 保菌將搖的菌取500ul+500ul 50的甘油保菌。再用大三角瓶進行大搖，搖菌取1ml菌液+100ml LB液體培養(yǎng)基+100ul Kan+200ul Rif，過夜搖菌。12、 配侵染液侵染步驟參考論文優(yōu)化而來。 （1）配侵染液200ml：5蔗糖，0.02%L-77（有劇毒），有點難溶；（2）大搖后的菌液測OD，要在0.81.0之間，高于這個值時死菌過多，侵染成功率低；（3）將菌液倒入大點的離心管離心；（4）倒掉上清，用槍把殘余的上清吸凈，加入少許（4、5ml）侵染液，用槍把菌打散打勻，倒入瓶中。13、侵染鐵托蓋上報紙，潤濕，需用到黑塑料袋，戴上手套。選擇花骨朵多的擬南芥，不是花開的多的，要沒開的多的擬南芥，用于侵染的擬南芥一般是四株長在一個小花盆中。將所有花全泡到侵染液中，所有花均需沾濕，漏在外面的花用戴手套的手弄濕，泡2min即可（注意不要沾到土，否則植物會死）。然后將植株迅速平躺放到鐵托中，用黑報紙蓋住。最后暗處理24h，第二天拿出來后正常培養(yǎng)。注意：用于侵染的液體有菌和毒，避免碰到身上。 用于搖菌的瓶子，侵染的瓶子都要高溫滅菌；用于裝侵染液的瓶子最好用84消毒，要不用洗潔劑也行。到這時就完成整個轉(zhuǎn)基因過程了。14、 收種子侵染后的植株看做T0代，侵染后1個月收種子，侵染后40天收第二批種子，但第一批最主要。是將種子收到1.5ml離心管中，曬干710d才能種。15、 篩選T1代將種子鋪到加入抗生素卡那和頭孢的MS固體培養(yǎng)基中。步驟： （1）將種子放入中等EP管（10ml）中。加滿消毒液（0.5%SDS，0.8%NaClO3），手搖振蕩15min。（2） 在超凈工作臺中倒掉消毒液，加滿滅菌水，振蕩洗滌，將種子完全打散。（3） 大離心機離心（3000g for 2min at 20），要