書書書中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)犌犅食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)天經(jīng)口毒性試驗(yàn)（報批稿）發(fā)布實(shí)施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會發(fā)布書書書犌犅食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)天經(jīng)口毒性試驗(yàn)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動物天經(jīng)口毒性試驗(yàn)的基本試驗(yàn)方法和技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于評價受試物的短期毒性作用。術(shù)語和定義重復(fù)劑量天經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)動物連續(xù)天經(jīng)口接觸受試物后引起的健康損害效應(yīng)。未觀察到有害作用劑量通過動物試驗(yàn)，以現(xiàn)有的技術(shù)手段和檢測指標(biāo)未觀察到任何與受試物有關(guān)的毒性作用的最大劑量。最小觀察到有害作用劑量在規(guī)定的條件下，受試物引起實(shí)驗(yàn)動物組織形態(tài)、功能、生長發(fā)育等有害效應(yīng)的最小作用劑量。靶器官實(shí)驗(yàn)動物出現(xiàn)由受試物引起明顯毒性作用的器官。衛(wèi)星組在毒性研究設(shè)計(jì)和實(shí)施中外加的動物組，其處理和飼養(yǎng)條件與主要研究的動物相似，用于試驗(yàn)中期或試驗(yàn)結(jié)束恢復(fù)期觀察和檢測，也可用于不包括在主要研究內(nèi)的其他指標(biāo)及參數(shù)的觀察和檢測。試驗(yàn)?zāi)康暮驮泶_定在天內(nèi)經(jīng)口連續(xù)接觸受試物后引起的毒性效應(yīng)，了解受試物劑量反應(yīng)關(guān)系和毒作用靶器官，確定天經(jīng)口最小觀察到有害作用劑量（）和未觀察到有害作用劑量（），初步評價受試物經(jīng)口的安全性，并為下一步較長期毒性和慢性毒性試驗(yàn)劑量、觀察指標(biāo)、毒性終點(diǎn)的選擇提供依據(jù)。儀器和試劑儀器器械實(shí)驗(yàn)室常用解剖器械、電子天平、生物顯微鏡、檢眼鏡、生化分析儀、血球分析儀、凝血分析儀、尿液分析儀、離心機(jī)、石蠟切片機(jī)等。犌犅試劑甲醛、二甲苯、乙醇、蘇木素、伊紅、石蠟、血球分析儀稀釋劑、生化分析試劑、凝血分析試劑、尿液分析試劑等。試驗(yàn)方法受試物受試物應(yīng)使用原始樣品，若不能使用原始樣品，應(yīng)按照受試物處理原則對受試物進(jìn)行適當(dāng)處理。將受試物摻入飼料、飲用水或灌胃給予。實(shí)驗(yàn)動物動物選擇實(shí)驗(yàn)動物的選擇應(yīng)符合和的有關(guān)規(guī)定。選擇已有資料證明對受試物敏感的物種和品系，一般嚙齒類動物首選大鼠，非嚙齒類動物首選犬（通常選用犬）。大鼠周齡推薦不超過周，體重。試驗(yàn)開始時每個性別動物體重的差異不應(yīng)超過平均體重的。每組動物數(shù)不少于只，雌雄各半；若計(jì)劃試驗(yàn)結(jié)束做恢復(fù)期的觀察，應(yīng)增加動物數(shù)（對照和高劑量增加衛(wèi)星組，每組只，雌雄各半）。犬應(yīng)選用個月個月幼犬，試驗(yàn)開始時每個性別動物體重差異不應(yīng)超過平均體重的，每組動物數(shù)不少于只，雌雄各半；若計(jì)劃試驗(yàn)結(jié)束做恢復(fù)期的觀察，應(yīng)增加動物數(shù)（對照和高劑量增加衛(wèi)星組，每組只，雌雄各半）。對照組動物性別和數(shù)量應(yīng)與受試物組相同。動物準(zhǔn)備試驗(yàn)前大鼠在實(shí)驗(yàn)動物房至少應(yīng)進(jìn)行（犬）環(huán)境適應(yīng)和檢疫觀察。動物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)條件應(yīng)符合、飲用水應(yīng)符合、飼料應(yīng)符合的有關(guān)規(guī)定。試驗(yàn)期間動物自由飲水和攝食，推薦單籠飼養(yǎng)，大鼠也可按組分性別分籠群飼，每籠動物數(shù)（一般不超過只）應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)動物最低需要的空間，以不影響動物自由活動和觀察動物的體征為宜。試驗(yàn)期間每組動物非試驗(yàn)因素死亡率應(yīng)小于，瀕死動物應(yīng)盡可能進(jìn)行血液生化指標(biāo)檢測、大體解剖以及病理組織學(xué)檢查，每組生物標(biāo)本損失率應(yīng)小于。劑量分組試驗(yàn)至少設(shè)個受試物劑量組，個陰性（溶媒）對照組，必要時增設(shè)未處理對照組。若試驗(yàn)結(jié)束做恢復(fù)期觀察，對照和高劑量需增設(shè)衛(wèi)星組。對照組除不給受試物外，其余處理均同受試物劑量組。劑量設(shè)計(jì)原則上高劑量應(yīng)使部分動物出現(xiàn)比較明顯的毒性反應(yīng)，但不引起死亡；低劑量不宜出現(xiàn)任何觀察到毒效應(yīng)（相當(dāng)于），且高于人的實(shí)際接觸水平；中劑量介于兩者之間，可出現(xiàn)輕度的毒性效應(yīng)，以得出。一般遞減劑量的組間距以倍倍為宜，如受試物劑量總跨度過大，可加設(shè)劑量組。試驗(yàn)劑量的設(shè)計(jì)參考急性毒性劑量和人體實(shí)際攝入量進(jìn)行。犌犅能求出的受試物，以的作為天經(jīng)口毒性試驗(yàn)的最高劑量組，此百分比的選擇主要參考劑量反應(yīng)曲線的斜率。然后在此劑量下設(shè)幾個劑量組，最低劑量組至少是人體預(yù)期攝入量的倍。求不出的受試物，試驗(yàn)劑量應(yīng)盡可能涵蓋人體預(yù)期攝入量倍的劑量，在不影響動物攝食及營養(yǎng)平衡前提下應(yīng)盡量提高高劑量組的劑量。對于人體擬攝入量較大的受試物，高劑量組亦可以按最大給予量設(shè)計(jì)。試驗(yàn)步驟和觀察指標(biāo)受試物給予根據(jù)受試物的特性和試驗(yàn)?zāi)康?，選擇受試物摻入飼料、飲水或灌胃方式給予。若受試物影響動物適口性，應(yīng)灌胃給予。受試物應(yīng)連續(xù)給予天。受試物灌胃給予，要將受試物溶解或懸浮于合適的溶媒中，首選溶媒為水、不溶于水的受試物可使用植物油（如橄欖油、玉米油等），不溶于水或油的受試物亦可使用羧甲基纖維素、淀粉等配成混懸液或糊狀物等。受試物應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，有資料表明其溶液或混懸液儲存穩(wěn)定者除外。應(yīng)每日在同一時段灌胃次，每周稱體重次，根據(jù)體重調(diào)整灌胃體積。灌胃體積一般不超過體重，如為水溶液時，最大灌胃體積大鼠可達(dá)體重，犬體重；如為油性液體，灌胃體積應(yīng)不超過體重；各組灌胃體積一致。受試物摻入飼料或飲水給予，要將受試物與飼料（或飲水）充分混勻并保證該受試物配制的穩(wěn)定性和均一性，以不影響動物攝食、營養(yǎng)平衡和飲水量為原則，受試物摻入飼料比例一般小于質(zhì)量分?jǐn)?shù)，若超過時（最大不應(yīng)超過），調(diào)整對照組飼料營養(yǎng)素水平（若受試物無熱量或營養(yǎng)成分，且添加比例大于時，對照組飼料應(yīng)填充甲基纖維素等，摻入量等同高劑量），使其與受試物組飼料營養(yǎng)素水平保持一致，同時增設(shè)未處理對照組；亦可視受試物熱量或營養(yǎng)成分的狀況調(diào)整受試物劑量組飼料營養(yǎng)素水平，使其與對照組飼料營養(yǎng)素水平保持一致。受試物劑量單位是每千克體重所攝入受試物的毫克（或克）數(shù)，即體重（或體重），當(dāng)受試物摻入飼料其劑量單位亦可表示為（或）飼料，摻入飲水則表示為水。受試物摻入飼料時，需將受試物劑量（體重）按動物每體重的攝食量折算為受試物飼料濃度（飼料），一般天經(jīng)口毒性試驗(yàn)大鼠每日攝食量按體重折算。一般臨床觀察觀察期限為，若設(shè)恢復(fù)期觀察，動物應(yīng)停止給予受試物后繼續(xù)觀察，以觀察受試物毒性的可逆性、持續(xù)性和遲發(fā)效應(yīng)。試驗(yàn)期間至少每天觀察一次動物的一般臨床表現(xiàn)，并記錄動物出現(xiàn)中毒的體征、程度和持續(xù)時間及死亡情況。觀察內(nèi)容包括被毛、皮膚、眼、黏膜、分泌物、排泄物、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、自主活動（如：流淚、豎毛反應(yīng)、瞳孔大小、異常呼吸）及行為表現(xiàn)（如：步態(tài)、姿勢、對處理的反應(yīng)、有無強(qiáng)直性或陣攣性活動、刻板反應(yīng)、反常行為等）。對體質(zhì)弱的動物應(yīng)隔離，瀕死和死亡動物應(yīng)及時解剖。體重和攝食及飲水消耗量每周記錄體重、攝食量，計(jì)算食物利用率；試驗(yàn)結(jié)束時，計(jì)算動物體重增長量、總攝食量、總食物利用率。受試物經(jīng)飲水給予，應(yīng)每日記錄飲水量。如受試物經(jīng)摻入飼料或飲水給予，應(yīng)計(jì)算和報告受試物各劑量組實(shí)際攝入劑量。眼部檢查試驗(yàn)前和試驗(yàn)結(jié)束時，至少對高劑量組和對照組實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行眼部（角膜、球結(jié)膜、虹膜）檢查，犬用犌犅熒光素鈉進(jìn)行檢查，若發(fā)現(xiàn)高劑量組動物有眼部變化，則應(yīng)對所有動物進(jìn)行檢查。血液學(xué)檢查大鼠試驗(yàn)結(jié)束、恢復(fù)期結(jié)束（衛(wèi)星組）進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)測定；犬試驗(yàn)前、試驗(yàn)結(jié)束、恢復(fù)期結(jié)束（衛(wèi)星組）進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)測定。推薦指標(biāo)為白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類（至少三分類）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、血小板計(jì)數(shù)、凝血酶原時間（）、活化部分凝血活酶時間（）等。如果對血液系統(tǒng)有影響，應(yīng)加測網(wǎng)織紅細(xì)胞、骨髓涂片細(xì)胞學(xué)檢查。血生化檢查大鼠試驗(yàn)結(jié)束、恢復(fù)期結(jié)束（衛(wèi)星組）進(jìn)行血液生化指標(biāo)測定；犬試驗(yàn)前、試驗(yàn)結(jié)束、恢復(fù)期結(jié)束（衛(wèi)星組）進(jìn)行血液生化指標(biāo)測定，應(yīng)空腹采血。測定指標(biāo)應(yīng)包括電解質(zhì)平衡、糖、脂和蛋白質(zhì)代謝、肝（細(xì)胞、膽管）腎功能等方面。至少包含丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（）、堿性磷酸酶（）、尿素（）、肌酐（）、血糖（）、總蛋白（）、白蛋白（）、總膽固醇（）、甘油三酯（）、氯、鉀、鈉指標(biāo)。必要時可檢測鈣、磷、尿酸（）、膽堿酯酶、山梨醇脫氫酶、總膽汁酸（）、高鐵血紅蛋白、激素等指標(biāo)。應(yīng)根據(jù)受試物的毒作用特點(diǎn)或構(gòu)效關(guān)系增加檢測內(nèi)容。尿液檢查大鼠在試驗(yàn)結(jié)束、恢復(fù)期結(jié)束（衛(wèi)星組）時進(jìn)行尿液常規(guī)檢查，犬試驗(yàn)前、試驗(yàn)結(jié)束、恢復(fù)期結(jié)束（衛(wèi)星組）進(jìn)行尿液常規(guī)檢查。包括尿蛋白、相對密度、葡萄糖和潛血等。若預(yù)期有毒反應(yīng)指征，應(yīng)增加尿液檢查的有關(guān)項(xiàng)目如尿沉渣鏡檢、細(xì)胞分析等。體溫、心電圖檢查犬試驗(yàn)前、試驗(yàn)結(jié)束、恢復(fù)期結(jié)束（衛(wèi)星組）應(yīng)進(jìn)行體溫、心電圖檢查。病理檢查大體解剖試驗(yàn)結(jié)束時必須對所有動物進(jìn)行大體檢查，包括體表、顱、胸、腹腔及其臟器，并稱心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、睪丸的絕對重量，計(jì)算相對重量（臟體比值）。組織病理學(xué)檢查可以先對最高劑量組和對照組動物進(jìn)行以下臟器組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對較低劑量組相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查。檢測臟器應(yīng)包括腦、甲狀腺、胸腺、心臟、肝、脾、腎、腎上腺、胃、十二指腸、結(jié)腸、胰、腸系膜淋巴結(jié)、卵巢、睪丸、膀胱，必要時可加測脊髓（頸、胸、腰）、垂體、食道、空腸、回腸、直腸、唾液腺、頸淋巴結(jié)、氣管、肺、動脈、子宮、乳腺、附睪、前列腺、骨和骨髓、坐骨神經(jīng)和肌肉、皮膚和眼球等組織器官。對肉眼可見的病變或可疑病變組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，出具組織病理學(xué)檢查報告，病變組織給出病理組織學(xué)照片。其他指標(biāo)必要時，根據(jù)受試物的性質(zhì)及所觀察的毒性反應(yīng)，增加其他指標(biāo)（如神經(jīng)毒性、免疫毒性、內(nèi)分泌毒性指標(biāo)）。犌犅數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價數(shù)據(jù)處理應(yīng)將所有的數(shù)據(jù)和結(jié)果以表格形式進(jìn)行總結(jié)，列出各組開始前的動物數(shù)、試驗(yàn)期間動物死亡數(shù)及死亡時間、出現(xiàn)毒性反應(yīng)的動物數(shù)，列出所見的毒性反應(yīng)，包括出現(xiàn)毒效應(yīng)的時間、持續(xù)時間及程度。對計(jì)量資料給出均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差。對動物體重、攝食量、飲水量（受試物經(jīng)飲水給予）、食物利用率、血液學(xué)檢查、血生化檢查、尿液檢查、臟器重量和臟體比值、病理檢查等結(jié)果應(yīng)以適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。一般情況，計(jì)量資料采用方差分析，進(jìn)行多個試驗(yàn)組與對照組之間均數(shù)比較，分類資料采用精確分布檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)，等級資料采用分析、秩和檢驗(yàn)等。結(jié)果評價應(yīng)將臨床觀察、生長發(fā)育情況、血液學(xué)檢查、血生化檢查、尿液檢查、大體解剖、臟器重量和臟體比值、病理組織學(xué)檢查等各項(xiàng)結(jié)果，結(jié)合統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，初步判斷受試物毒作用特點(diǎn)、程度、靶器官、劑量效應(yīng)、劑量反應(yīng)關(guān)系，如設(shè)有恢復(fù)期衛(wèi)星組，還可判斷受試物毒作用的可逆性。在綜合分析的基礎(chǔ)得出天經(jīng)口毒性和（或）。初步評價受試物經(jīng)口的安全性，并為進(jìn)一步的毒性試驗(yàn)提供依據(jù)。試驗(yàn)報告試驗(yàn)名稱、試驗(yàn)單位名稱和聯(lián)系方式、報告編號。試驗(yàn)委托單位名稱和聯(lián)系方式、樣品受理日期。試驗(yàn)開始和結(jié)束日期、試驗(yàn)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、試驗(yàn)單位技術(shù)負(fù)責(zé)人、簽發(fā)日期。試驗(yàn)摘要。受試物：名稱、批號、劑型、狀態(tài)（包括感官、性狀、包裝完整性、標(biāo)識）、數(shù)量、前處理方法、溶媒。實(shí)驗(yàn)動物：物種、品系、級別、數(shù)量、體重、性別、來源（供應(yīng)商名稱、實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號），動物檢疫、適應(yīng)情況，飼養(yǎng)環(huán)境（溫度、相對濕度、實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施使用許可證號），飼料來源（供應(yīng)商名稱、實(shí)驗(yàn)動物飼料生產(chǎn)許可證號）。試驗(yàn)方法：試驗(yàn)分組、每組動物數(shù)、劑量選擇依據(jù)、受試物給予途徑及期限、觀察指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。試驗(yàn)結(jié)果：動物生長活動情況、毒性反應(yīng)特征（包括出現(xiàn)的時間和轉(zhuǎn)歸）、體重增長、攝食量、