中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)010中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布 2010布 2010施食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定 of in 010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替 幼兒配方食品和乳粉 葉酸（葉酸鹽活性）測定 。 本標(biāo)準(zhǔn)與 要變化如下： 對磷酸鹽緩沖液作了調(diào)整； 增加了米粉的處理方法； 增加了光密度法測定步驟。 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： 413 010 1 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定。 2 規(guī)范性引用文件 本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 3 原理 利用干酪乳桿菌（ 469 對葉酸的特異性，在含有葉酸的樣品中生長產(chǎn)生的酸度和形成的光密度來測定葉酸的含量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 6682 規(guī)定的二級水。 胰腺： 稱取 100 燥的雞胰腺， 加 20 餾水， 攪拌 15 離心 10 3000 轉(zhuǎn) /分鐘） ，取上清液，臨用前配制。 生理鹽水：稱取 9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 中，分裝于具塞試管中，每管 10 121滅菌 15 周準(zhǔn)備一次。 酸鹽緩沖液 酸鹽緩沖液（ ）：稱取 g 磷酸二氫鉀， g 磷酸氫二鉀，用 1000 溶解。臨用前按 0.5 g/100 入抗壞血酸。 酸鹽緩沖液（用于谷物及谷物制品前處理）：稱取 14.2 g 磷酸氫二鈉，用 1000 溶解。臨用前按 1.0 g/100 入抗壞血酸，用氫氧化鈉溶液 A（ 酸鹽緩沖液 于谷物及谷物制品測試）：稱取 14.2 g 磷酸氫二鈉，用 1000 溶解。臨用前按 1.0 g/100 入抗壞血酸，用氫氧化鈉溶液 A（ 酸鹽緩沖液（ 0.1 ）（用于谷物及谷物制品標(biāo)準(zhǔn)溶液制備）：溶解 g 磷酸二氫鉀于水中稀釋到 1000 氫氧化鉀溶液（ 酸標(biāo)準(zhǔn)品。 水（ ）。 苯（ 壞血酸（ 株：干酪乳桿菌（ 469。 010 2 養(yǎng)基 酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：胨化乳 15 g，酵母浸膏 5 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 酸二氫鉀2 g，聚山梨糖單油酸酯 1 g，瓊 脂 10 g，加蒸餾水至 1000 20 25 ）。 121高壓滅菌 15用。 酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：胨化乳 15 g，酵母浸膏 5 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 酸二氫鉀2 g，聚山梨糖單油酸酯 1 g，加蒸餾水至 1000 20 25 ）。 121高壓滅菌 15用。 酸測定用培養(yǎng)基：酪蛋白胨 10 g，葡萄糖 40 g，乙酸鈉 40 g，磷酸氫二鉀 1 g，磷酸二氫鉀 1 g， .2 g， .6 g， .5 g，硫酸腺嘌呤 10 酸鳥嘌呤 10 嘧啶 10 嘌呤 20 山梨糖 0.1 g，谷光甘肽 5 酸鎂 0.4 g，氯化鈉 20 酸亞鐵 20 酸錳 15 黃素 1 生素 酸硫胺素 400 g，泛酸鈣 800 g，煙酸 800 g，生物素 20 g，加蒸餾水至 1000 20 25 ）。 注： 市售商業(yè)化合成培養(yǎng)基效果更穩(wěn)定。 氧化鉀溶液（ 4 ）：稱取 224 g 氫氧化鉀于 1000 杯中，用 400 溶解，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至 1000 量瓶中，用水定容。 瓜蛋白酶溶液： 1 g 蛋白酶（活力 6000 U/ 40 ）溶于 100 酸鹽緩沖液（ 。臨用前配制。 1 g ）溶于 100 酸鹽緩沖液（ 。臨用前配制。 m 滅菌濾膜。 準(zhǔn)溶液的制備 酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（ 500 g/稱取 55 56 確至 0.1 酸標(biāo)準(zhǔn)品（ 用50 餾水轉(zhuǎn)入 100 量瓶中，加 2 水（ 溶液制備后，按式（ 1）計算溶液的體積，要求貯備液中葉酸鹽的濃度為 500 g/ 貯備液體積（ =5001001000 貯備液體積（ =50 ( 1) 式中： m葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，單位為毫克（ ； c葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度，單位為克每百克（ g/100 g） 。 用水稀釋溶液至刻度，用吸管加水至計算要求的體積，充分混合，放入棕色試劑瓶中 2 4 冰箱冷藏，保存期為 4 個月。 酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（ 50 g/吸取 10 酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（ 100 色容量瓶中，用水定容至刻度，充分混勻， 2 4 冰箱冷藏，保存期為 1 個月。 酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（ ng/0.1 ng/吸取 1 酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（ 100 水定容至刻度，混合。再吸該液 1 100 色容量瓶中，定容，混合。 從上液中分別吸取 5 250 500 色容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（ 容到刻度，混勻，即為高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液（ 0.1 ng/低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液（ ng/臨用前配制。 酸（ 1 ）：量取 83.0 酸溶于水中，冷卻后定容至 1000 010 3 氧化鈉溶液 A（ 4 ）：稱取 160 g 氫氧化鈉于 1000 杯中，用 400 溶解，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至 1000 量瓶中，用水定容。 氧化鈉溶液 B（ 0.1 ）：吸取 2.5 氧化鈉溶液 A（ 移至 100 量瓶中用水定容。 氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（ 0.1 ）：稱取 4 g（精確至 g）氫氧化鈉用水稀釋至 1000 鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定。保存此溶液的容器要密封，以防二氧化碳滲入。 氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定：稱取約 g（精確至 g）于 105 110 烘至恒重的鄰苯二甲酸氫鉀，用 50 二氧化碳的水溶于錐形瓶中，加兩滴 5 g/L 的酚酞指示劑，用配好的氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色，同時作空白實驗。按式（ 2）計算氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度： c=( 2) 式中： c氫氧化鈉的濃度，單位為摩爾每升（ ） ； m稱取的鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量，單位為克（ g） ； 氫氧化鈉溶液的用量，單位為毫升（ ； 空白試驗氫氧化鈉溶液的用量，單位為毫升（ 。 酞溶液：取 0.5 g 酚酞溶于 75 積分?jǐn)?shù)為 95 %的乙醇中，加入 20 ，再加入氫氧化鈉溶液（ 直至加入一滴立即變成粉紅色，再用水定容至 100 麝香草酚藍指示劑：稱取 0.1 g 溴麝香草酚藍于研缽中，加入 1.6 氧化鈉溶液 B（ 磨，加少許水至完全溶解，轉(zhuǎn)移至 250 量瓶中用水定容。 5 儀器和設(shè)備 5.1 ：精度為 心機：轉(zhuǎn)速 2000 轉(zhuǎn) /分鐘。 光光度儀。 平：感量為 0.1 化培養(yǎng)箱： 36 1 定管：分刻度值為 0.1 渦旋振蕩器。 6 分析步驟 試菌液的制備 酪乳桿菌 （ 469 凍干菌粉轉(zhuǎn)入乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基 （ 中， 36 1 培養(yǎng) 24 h 后，轉(zhuǎn)接至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（ 管中，再 36 1 培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)好的乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（ 管的培養(yǎng)物作為貯備菌種。 010 4 貯備菌種培養(yǎng)基上分別轉(zhuǎn)接到三個乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 （ 試管中， 放入培養(yǎng)箱中 36 1 培養(yǎng) 24 h。每月轉(zhuǎn)接一次，作為月接種管貯于冰箱中。每月定期從月接種管中重新接種 3 個轉(zhuǎn)接管保存新菌株。 月接種的培養(yǎng)管中的一支再接種一支乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 （ 試管， 36 1 培養(yǎng) 24 h，作為日接種管每日測定用。 日接種管中接種一管乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（ 36 1 培養(yǎng) 24 h。在無菌條件下離心該培養(yǎng)液 10 2000 轉(zhuǎn) /分鐘），棄去上清液。用 10 理鹽水（ 蕩洗滌菌體，離心 10 2000 轉(zhuǎn) /分鐘），棄去上清液，用 10 理鹽水（ 蕩清洗。如前離心操作，棄去上清液。再加 10 理鹽水（ 混勻。吸 1 菌懸液于 10 理鹽水（ ，混勻制成測試菌液。 生理鹽水（ 對照，用分光光度計，于 550 長下，測測試菌液（ 光密度值，此值應(yīng)在 60 % 80 %之間。 樣的制備 制品 稱取 2 g（精確至 g）試樣（約含葉酸 5 g）于 100 杯中，用 25 30 復(fù)原樣品，轉(zhuǎn)入 100 量瓶中，用水定容至刻度，溶液中葉酸的質(zhì)量濃度大約為 g/取 1 胰腺（ 一個 180 5 帶螺旋蓋的試管中，充分混合。加 18 抗壞血酸的磷酸緩沖液（ ，再加 1 苯（ 。同時制備 空白對照管，吸 1 餾水和 1 空白管中，加 18 抗壞血酸的磷酸緩沖液（ 1 苯（ 。在 37 下，樣品管和空白管保溫 16 h 后，于 100 水浴加熱 5 磷酸鹽緩沖液（ 適當(dāng)稀釋，得到濃度約為 0.1 ng/葉酸鹽溶液。 若確定樣品中強化葉酸與原生葉酸相比所占比例很大，則可以用 1 液加 19 抗壞血酸的磷酸緩沖液（ 100 水浴加熱 5 用磷酸鹽緩沖液（ 釋，得到濃度約為 0.1 ng/葉酸鹽溶液。 物及谷物制品 稱取大約含 1 g 葉酸的試樣于 150 角燒瓶中。加 20 mL 酸緩沖溶液（ ，混勻后加 50 和 1.0 苯（ 。加蓋后 121 15 菌，然后迅速冷卻。加 1 瓜蛋白酶溶液（ ，于 36 1 保溫 3h 后 100 加熱 3 卻。加 1 ， 36 1 保溫 2 h 后加 4 胰腺 （ ， 加蓋， 36 1保溫 16 h 后 100 加熱 3 冷卻。 用 1 鹽酸（ 水稀釋定容到 100 濾得到澄清濾液，然后吸取 1 清濾液用磷酸鹽緩沖液 容至 100 到濃度約為 0.1 ng/葉酸鹽溶液。 若確定樣品中強化葉酸與原生葉酸相比所占比例很大則可以直接在樣品中加 20 含抗壞血酸的磷酸緩沖液（ 50 ，于 121 滅菌 15 后吸取 1清濾液， 磷酸鹽緩沖液 釋，得到濃度約為 0.1 ng/葉酸鹽溶液。 準(zhǔn)曲線管的制作 按表 1 順序加入蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)工作液（ （測定谷物及谷物制品的標(biāo)準(zhǔn)溶液用磷酸鹽緩沖液（ 替磷酸鹽緩沖液（ ）和葉酸測定用培養(yǎng)基（ 培養(yǎng)管中。表 1 中每一編號需制作 3 管。試管 ，相當(dāng)葉酸含量為 010 5 表 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制作 試管號 2 4 6 8 10 蒸餾水（ 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 標(biāo)準(zhǔn)溶液（ 0 0 1 2 3 4 5 3 4 5 培養(yǎng)基（ 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 注1： 試管 加低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。 注2： 試管 加高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。 樣管的制作 按表 2 順序加入蒸餾水、試樣和葉酸測定用培養(yǎng)基于試管中，表中每一編號需制作 3 管。 表 2 試樣管的制作 試管號 1 2 3 4 蒸餾水（ 4 3 2 1 樣 品（ 1 2 3 4 培養(yǎng)基（ 5 5 5 5 菌 將標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管 121 滅菌 5 速冷卻到室溫（商品化培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進行滅菌 )。 注 ：保證加熱和冷卻過程中條件均勻，滅菌管數(shù)過多或距離太近，在滅菌鍋中都可產(chǎn)生不良影響。 種 無菌條件下每管中均加入一滴（約 50 L）菌懸液（ ，加蓋，充分振蕩混勻所有試管（標(biāo)準(zhǔn)曲線未接種空白管 外） 。 養(yǎng) 度法： 36 1 培養(yǎng) 72 h。對每支試管進行目測檢查，未接種管內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管中培養(yǎng)液的濁度應(yīng)有梯度。未接種管中若出現(xiàn)混濁，則測定無效。 密度法：在 36 1 ，培養(yǎng) 16 h 24 h。其他同 定 度法 10 將未接種空白管 接種空白管 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至三角燒瓶中，以溴麝香草酚藍（ 指示劑，或用 以 滴定終點用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（ 定標(biāo)準(zhǔn)曲線未接種空白管 S 1 和接種空白管 S 2。記錄下消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積。 注： 如果接種空白滴定反應(yīng)消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積數(shù)等于或高于未接種空白水平的 1.5 測定結(jié)果無效。 10 將標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至三角燒瓶中，以溴麝香草酚藍（ 指示劑，或用 以 滴定終點用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（ 定標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管的培養(yǎng)物。記錄下消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積。 注： 通常標(biāo)準(zhǔn)曲線管 耗的 0.1 的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積數(shù)在 8 12 間。 密度法 010 6 以接種空白管（表 1 中試管號 S 2）作對照，取出最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線管 蕩 5 s，在波長 550 回重新培養(yǎng)。 2 h 后同等條件重新測該管的光密度，如果兩次光密度的絕對差結(jié)果 2 %，則取出全部檢驗管測定標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣的光密度。 準(zhǔn)曲線的繪制 以標(biāo)準(zhǔn)曲線管葉酸含量作橫坐標(biāo)， 以消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)或光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣管中葉酸含量的計算 按照 個試樣管測定的消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)或光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得對應(yīng)的葉酸含量。每一編號的三個試樣管應(yīng)計算管中每毫升測定液葉酸的含量，并與其平均值相比較。相對偏差小于 15 %的試管為有效試管，無效試樣管應(yīng)舍去，有效試樣管總數(shù)應(yīng)大于所有試樣管總數(shù)的2/3。重新計算每一編號的有效試樣管中每毫升測定液葉酸含量的平均值，以此平均值計算全部編號試樣管的總平均值 注： 樣品管