精品文檔2016全新精品資料全新公文范文全程指導(dǎo)寫作獨(dú)家原創(chuàng)1/9惡性黑素瘤細(xì)胞株細(xì)胞間粘附分子1的改變及臨床意義【摘要】目的探討細(xì)胞間粘附分子1ICAM1在惡性黑素瘤細(xì)胞株的表達(dá)及臨床意義。方法用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，觀察惡性黑素瘤細(xì)胞株MM81在溫?zé)峒澳承┘?xì)胞因子刺激下，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖能力及ICAM1的基因水平變化。結(jié)果溫?zé)?、干擾素、腫瘤壞死因子可使細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞增殖能力下降、ICAM1的表達(dá)增加，白介素2未能影響細(xì)胞形態(tài)及增殖能力，也未能使ICAM1明顯改變。結(jié)論惡性黑素瘤細(xì)胞株ICAM1的表達(dá)與細(xì)胞被破壞有關(guān)，同時為溫?zé)?、干擾素、腫瘤壞死因子作為治療惡性黑素瘤的輔助手段提供了理論依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】黑素瘤細(xì)胞因子細(xì)胞間粘附分子1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)THEEXPRESSIONOFINTERCELLULARADHESIONMOLECULE1INHUMANMALIGNANTMELANOMACELLLINESANDITSCLINICALSIGNIFICANCEXIAJIANXIN，JNAKAYAMA，KURABE，ETALDEPARTMENTOFDERMATOLOGY，SECONDHOSPITAL,NORMANBETHUNEMEDICALUNIVERSITY，CHANGCHUN130041精品文檔2016全新精品資料全新公文范文全程指導(dǎo)寫作獨(dú)家原創(chuàng)2/9【ABSTRACT】OBJECTIVETOINVESTIGATETHEEXPRESSIONOFICAM1INHUMANMALIGNANTMELANOMA（MM）CELLLINESANDITSCLINICALSIGNIFICANCEMETHODSHUMANMMCELLLINESWERECULTUREDANDANALYZEDBYREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTION（RTPCR）,THECELLSHAPE，CELLGROWTHABILITYANDICAM1BYMRNAEXPRESSIONUNDERTHESTIMULATIONOFHYPERTHERMIAORCYTOKINESWEREOBSERVEDRESULTSHYPERTHERMIA、IFNANDTNFCOULDCHANGECELLSHAPE，REDUCECELLGROWTHABILITYANDINCREASETHEEXPRESSIONOFICAM1IL2COULDNOTINFLUENCETHECELLSHAPEANDTHEEXPRESSIONOFICAM1CONCLUSIONTHEEXPRESSIONOFICAM1INMMCELLLINESMAYBECORRELATEDWITHTHECELLDESTRUCTION，WHICHPROVIDESTHEORETICALBASISOFSUPPLEMENTARYTHERAPYFORMMWITHHYPERTHERMIA、IFNANDTNF【KEYWORDS】MELANOMACYTOKINEINTERCELLULARADHESIONMOLECULE1REVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTION人惡性黑素瘤MM細(xì)胞細(xì)胞間粘附分子1ICAM1的發(fā)現(xiàn)在國外有多家報道1，認(rèn)為MM患者血清中可溶性精品文檔2016全新精品資料全新公文范文全程指導(dǎo)寫作獨(dú)家原創(chuàng)3/9ICAM1的濃度與腫瘤進(jìn)展程度呈正相關(guān)。作為MM的輔助治療手段有溫?zé)岑煼凹?xì)胞因子等。以前曾觀察到培養(yǎng)人MM細(xì)胞株在體外進(jìn)行溫?zé)峒案蓴_素IFN、腫瘤壞死因子TNF處理后，細(xì)胞表面ICAM1的表達(dá)及培養(yǎng)液中ICAM1的釋放增加2。為探求在溫?zé)峒凹?xì)胞因子刺激下MM細(xì)胞株ICAM1的表達(dá)發(fā)生改變的機(jī)理，我們將人MM細(xì)胞株在溫?zé)峒澳承┘?xì)胞因子刺激下，觀察細(xì)胞形態(tài)和增殖能力及ICAM1的基因水平變化，現(xiàn)報道如下。材料與方法一、材料1培養(yǎng)細(xì)胞惡性黑素瘤細(xì)胞株MM81是從惡性黑素瘤患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶分離培養(yǎng)而確立起來的，保存于日本九州大學(xué)醫(yī)學(xué)部皮膚科教室，細(xì)胞培養(yǎng)采用文獻(xiàn)3的方法進(jìn)行。2細(xì)胞因子及試劑IFN、TNF和白介素2IL2均由大日本制藥株式會社提供，ICAM1引物由日本九州大學(xué)醫(yī)學(xué)部皮膚科教室提供，ICAM15為AATGCCCAGACATCTGTG，ICAM13為GCGTAGGGTAAGGTTCTT，提取RNA及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RTPCR試劑均為日本寶酒造株式會社生物事業(yè)部門提供，此對引物擴(kuò)增片段為327BP。精品文檔2016全新精品資料全新公文范文全程指導(dǎo)寫作獨(dú)家原創(chuàng)4/9二、方法1溫?zé)釋?shí)驗將人MM細(xì)胞配成濃度為1104個/ML，取2ML放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24H貼壁，更換培養(yǎng)液后分別置入37C、41C、43C含5CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3H和6H后觀察細(xì)胞形態(tài)，停止溫?zé)崽幚?，重新放?7C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過約3D恢復(fù)后，觀察細(xì)胞形態(tài)，計數(shù)，41C6H、43C6H及對照組做RNA的提取及RTPCR。表1溫?zé)峒澳承┘?xì)胞因子刺激下惡性黑素瘤細(xì)胞增殖能力的改變不同處理細(xì)胞株數(shù)細(xì)胞數(shù)1105與對照組比較T值P值組間比較T值P值對照組3416H3436H3IFN100U/ML3TNF100U/ML3IL2100U/ML3IFNTNF10U/ML3IFNTNF100U/ML32細(xì)胞因子刺激實(shí)驗將上述細(xì)胞同時做細(xì)胞因子刺激實(shí)驗，濃度為1104個/ML，貼壁培養(yǎng)24H，更換培養(yǎng)液后分別加入10U/ML、100UML的IFN、TNF、IL2及精品文檔2016全新精品資料全新公文范文全程指導(dǎo)寫作獨(dú)家原創(chuàng)5/9IFNTNF，37C培養(yǎng)72H后觀察細(xì)胞形態(tài)，計數(shù)，收集IFN、TNF、IL2組細(xì)胞濃度均為100U/ML，做RNA的提取及RTPCR。3RNA的提取將細(xì)胞剝離用胰蛋白酶EDTA，放入15CM的離心管中2000R/MIN5MIN離心，棄上清液；放入表面活性劑CATRIMOX14TM1ML溶解細(xì)胞，并將此溶液移回原試管中；1000R/MIN5MIN，棄上清液；加入鋰試劑1ML，振動，15000R/MIN5MIN，棄上清液；加入冷的70乙醇1ML洗沉淀物，吸凈乙醇，干燥10MIN；放入50LDEPC水溶液，溶解沉淀物，70C保存。4ICAM1的RTPCR逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前先將標(biāo)本90C5MIN處理后再置于冰上急劇冷卻。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑為3引物1L終濃度MOL/L，10RNAPCR緩沖液2L，MGCL24L終濃度5MMOL/L，DNTPS8L終濃度1MMOL/L，核苷酸酶抑制劑L1U/L，逆轉(zhuǎn)錄酶1L025UL，樣本2L，RNA酶自由水L。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件42C30MIN，99C5MIN，5C5MIN，此時已合成CDNA。PCR反應(yīng)試劑為MGCL26L終濃度25MMOL/L，5引物1L終濃度02MOL/L，RNAPCR緩沖液8L，TAQ酶L，加DEPC水補(bǔ)至100L，TAQ酶于98C預(yù)變性5MIN后加入。反應(yīng)條件精品文檔2016全新精品資料全新公文范文全程指導(dǎo)寫作獨(dú)家原創(chuàng)6/994C30S，55C30S，72，共35個循環(huán)，末次置72C7MIN，反應(yīng)結(jié)束后，取10L反應(yīng)產(chǎn)物在含溴化乙錠EB的15瓊脂糖凝膠中電泳30MIN，紫外燈下觀察結(jié)果。為了避免各標(biāo)本中總RNA的差異，用肌動蛋白測各標(biāo)本中總RNA量。5ICAM1CDNA量的測定4及結(jié)果分析電泳后，用CCDCHARGECOUPLEDDEVICE影像系統(tǒng)測定每條帶的EB熒光密度，將ICAM1CDNA的EB熒光密度除以肌動蛋白的EB熒光密度得出ICAM1MRNA專用單位。因肌動蛋白MRNA在同一種細(xì)胞的含量是一致的，其量與總RNA的量成正比，其意義在于消除加樣不均所致的每一樣本MRNA量的不一致。表2各樣本的ICAM1MRNA熒光密度及其相對值MRNA對照TNFIFNIL2416H436HICAM1242825390352484200532262833874肌動蛋白275901990321580353183540225106ICAM1/肌動蛋白結(jié)果1細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變溫?zé)峒癐FN、TNF均可改變細(xì)胞形態(tài)，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞膜不清，大小不等，溫度越高，熱處理時間越長，細(xì)胞形態(tài)變化越明顯。細(xì)胞因子中尤以TNF與IFN合用細(xì)胞形態(tài)改變最明精品文檔2016全新精品資料全新公文范文全程指導(dǎo)寫作獨(dú)家原創(chuàng)7/9顯。2細(xì)胞增殖能力的改變?nèi)绫?，數(shù)據(jù)處理采用T檢驗。1CDNA量的測定如表2，從中可以看出TNF100U/ML使ICAM1增加倍/，IFN100U/ML使ICAM1增加倍/，436H使ICAM1增加倍/，IL2及416H未能使ICAM1增加。討論目前對于腫瘤的治療除了手術(shù)、放療、化療以外，還有細(xì)胞因子及溫?zé)岑煼ǖ?，某些?xì)胞因子常被應(yīng)用于腫瘤的輔助治療如干擾素及腫瘤壞死因子等，本實(shí)驗中，用IFN、TNF及IL2在體外作用于MM細(xì)胞，結(jié)果觀察到IFN、TNF可破壞細(xì)胞，使細(xì)胞增殖能力下降，體外實(shí)驗證實(shí)了IFN、TNF的抗腫瘤作用，IL2未能改變細(xì)胞形態(tài)，也未能影響細(xì)胞的增殖能力。日本九州大學(xué)醫(yī)學(xué)部皮膚科采用局部溫?zé)峁嗔鳢煼ㄖ委熯M(jìn)行期的四肢MM，通過超聲波觀察可見腫瘤體積縮小，取得了較好的臨床效果5，本實(shí)驗中，采用41及43處理3H和6H，從中觀察到，溫?zé)崽幚砗?，隨著溫度的增高，熱處理時間的延長，細(xì)胞形態(tài)變化越明顯，細(xì)胞增殖能力下降越明顯，與對照組比較及組間比較P作者單位夏建新精品文檔2016全新精品資料全新公文范文全程指導(dǎo)寫作獨(dú)家原創(chuàng)8/9130041長春，白求恩醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院皮膚科；中山樹一郎，占部和敬日本九州大學(xué)醫(yī)學(xué)部皮膚科教室；母義明北京解放軍第三零一醫(yī)院內(nèi)分泌科參考文獻(xiàn)1江口弘晃，堀越貴志，高橋誠，他惡性黑色腫ICAM1發(fā)現(xiàn)日皮會，1992，1028078142管曉春，中山樹一郎，中島學(xué)，他惡性黑色腫細(xì)胞ICAM1發(fā)現(xiàn)可溶性ICAM1放出變動關(guān)研究日皮會，1997，1077477533NAKAYAMAJ，MOROIY，TOSHITANIA,ETALRESPONSESOFB16MELANOMACELLLINES,F1ANDF10,TOHYPERTHERMIALYMPHOKINEACTIVATEDKILLERCELLSANDACOMBINATIONOFBOTHINVITROBRJDERMATOL，1992，1261311364YOKOIH，NATSUYAMAS，IWAIM，ETALNONRADIOISOTOPICQUANTITATIVERTPCRTODETECTCHANGESINMRNALEVELSDURINGEARLYMOUSEEMBRYODEVELOPMENTBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN，1993，1957697755NAKAYAMAJ，TAKEUCHIM，NAGAES，ETALHYPERTHERMICISOLATEDLIMBPERFUSIONWITHINTRA精品文檔2016全新精品資料全新公文范文全程指導(dǎo)寫作獨(dú)家原創(chuàng)9/9ARTERIALADMINISTRATIONOFCARBOPLATINANDORINTERFERONFORTHETR