N Y 412 227生物肥料的基礎(chǔ)上，對其中的磷細(xì)菌肥料部分進(jìn)行修改主要修改內(nèi)容如下:增加術(shù)語、抽樣和判定規(guī)則部分;一增加菌種部分，包括菌種有效性、菌體特性特征、菌落形態(tài);刪除成品無害化指標(biāo)。因為磷細(xì)菌肥料一般以草炭為載體，不存在重金屬的危害草炭經(jīng)高溫滅菌后，大腸菌群和蛔蟲卵不再存在本標(biāo)準(zhǔn)自實施之日起，同時代替 227標(biāo)準(zhǔn)的附錄A,附錄B,附錄C,附錄標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:農(nóng)業(yè)部微生物肥料質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:梁紹芬、姜瑞波、葛誠、李俊、沈德龍中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)N Y 412 2000磷細(xì)菌肥料術(shù)要求、抽樣、檢驗方法、檢驗規(guī)則、包裝、標(biāo)識、運(yùn)輸和貯存等本標(biāo)準(zhǔn)適用于含有益磷細(xì)菌微生物，能分解土壤中的難溶性磷化物，改善作物磷素營養(yǎng)狀況，又能分泌刺激素刺激作物生長發(fā)育的活體微生物制品。2引用標(biāo)準(zhǔn)下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文，通過在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版時，所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會被修訂，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性能分泌激素刺激作物生長的活體微生物制品。4產(chǎn)品分類4，按劑型不同分為:液體磷細(xì)菌肥料、機(jī)磷細(xì)菌肥料、無機(jī)磷細(xì)菌肥料。4. 2. 1有機(jī)磷細(xì)菌肥料能在土壤中分解有機(jī)態(tài)磷化物(卵磷脂、核酸和植素等)的有益微生物經(jīng)發(fā)酵iG+解有機(jī)態(tài)磷化物的細(xì)菌有芽胞桿菌屬中的種(、類芽胞桿菌屬中的種(把土壤中難溶性的不能被作物直接吸收利用的無機(jī)態(tài)磷化物溶解轉(zhuǎn)化為作物可以吸收利用的有效態(tài)磷化物。分解無機(jī)態(tài)磷化物的細(xì)菌有假單胞菌屬中的種(v ),產(chǎn)堿菌屬中的種()硫桿菌屬中的種(且必須為非致病菌菌株5技術(shù)要求5，飛須是從國家菌種中心或國家科研單位引進(jìn)的并經(jīng)過鑒定對動物和植物均無致病作用的非致病菌菌株;這些菌株在含有卵磷脂或磷酸三鈣的瓊脂平板觀察到明中華人民共和國農(nóng)業(yè)部200012酵培養(yǎng)后解磷量與不接菌對照比較有顯著差異(p胞桿菌屬的細(xì)菌為革蘭氏染色s0 能產(chǎn)生抗熱的芽胞，為橢圓形或柱形周生或側(cè)牛鞭毛，能運(yùn)動，能產(chǎn)生接觸酶。單胞菌屬中的細(xì)菌為革狡氏染色陰性桿菌，屬中的部分菌株為致病菌，必須進(jìn)行嚴(yán)格的菌種鑒定后才能用于生產(chǎn)。運(yùn)動，革蘭氏染色呈陰性，接觸酶陽性。硫桿菌屬的菌為革蘭氏染色陰性小桿菌，單根極生鞭毛，味淺黃或灰白色棍濁液體，稍有沉淀，微臭或無臭味有效活菌數(shù)億個/無機(jī)磷細(xì)菌肥料%徑)通過孔徑。0%65. 2. 3固體(顆粒)磷細(xì)菌肥料技術(shù)指標(biāo)見表30表3固體(顆粒)磷細(xì)菌肥料技術(shù)指標(biāo)項目指標(biāo)外觀、氣味水分，%松散、黑色或灰色顆粒，微臭蕊10有效活菌數(shù)億個/ 412)一.。一一一有效期月I 批抽樣檢驗。抽樣過程要嚴(yán)格避免雜菌污染6門抽樣工具及用品抽樣前預(yù)先準(zhǔn)備好無菌塑料袋(或塑料瓶)、金屬勺、剪刀、封口機(jī)、牛皮紙封樣袋、標(biāo)簽、抽樣封條和膠水62抽樣數(shù)量及抽樣方法在成品庫抽樣，可按“:.:，形分層設(shè)點(diǎn)抽取，抽樣以件為單位，小包裝產(chǎn)品以一包裝箱為一件大包裝(3050 品以一袋(或一桶)為一件抽樣件數(shù)由樣品基數(shù)的大小確定。10件以內(nèi)全部抽樣:1120。件抽樣10件;201品基數(shù)大于400件者，按超過部分的2%增加抽樣件數(shù)卜但總件數(shù)不要超過40件。每件小包裝產(chǎn)品抽取一小袋，在無菌條件下每袋取樣200 g。然后將所有樣品棍勻，按四分法縮到2 000 g，分裝4袋，然后封口。每2袋為一份裝人牛皮封樣袋最后貼上抽樣標(biāo)簽和抽樣封條(液體肥料小包裝亦參照此法進(jìn)行)。所抽樣品一份留存被抽樣單位，一份交檢測中心檢測。溫千燥箱;恒溫?fù)u床;高速離心機(jī);生物顯微鏡(0o);高壓滅菌鍋;酸度計;扭力天平(分度值0,01 g) ;菌落計數(shù)器;無菌室或超凈工作臺;培養(yǎng)皿:直徑9 角瓶:500 00 杯:500 筒:100 菌吸管:0.0 璃刮刀;濾紙;酒精燈;標(biāo)準(zhǔn)篩:孔徑(). 5 . 0 12離子水;無菌水了附錄n)附錄有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基(見附錄D2)附錄手煽動包裝口處的空氣，嗅其氣味。于白色搪瓷盤中，液體肥料搖勻，在明亮的光線下進(jìn)行觀察。供檢菌液于50 三次測定結(jié)果的平均值固體磷細(xì)菌肥分度值。g,置于500 杯中，用量筒量取30. 0 磁力攪拌或手搖動1 后靜止30 酸度計測其復(fù)3次，取其算術(shù)平均值。份20. 00 g，精確到0. 01 g，放入已稱恒重的鋁盒中，置105 至干燥器內(nèi)，冷卻后稱重。取三個樣品測定數(shù)的平均值平行樣品絕對偏差應(yīng)低于1%0含水量按式(1)計算含水量%，一塑蓋考X 100一)式中:。;一烘干后樣品質(zhì)量，5吸附劑顆粒細(xì)度測定準(zhǔn)確稱取10. 0 于孔徑。水沖洗，用毛筆輕刷至樣品不再通過為止將篩余物置105重篩余物百分含量按式(2)計算:篩余物(%)一篩余物重一(1一樣品含水量百分?jǐn)?shù))樣品質(zhì)量火100一(2)顆粒肥料的粒徑稱樣后直接過2. 5 5 磷細(xì)菌肥料有效活菌數(shù)及雜菌率的測定采用平板計數(shù)法測定有效活菌數(shù)和雜菌率。6門制作肉湯培養(yǎng)基平板和馬丁培養(yǎng)基平板(配方見附錄n)確到。g),裝人帶玻璃珠及100 供檢樣品為液12取10 置轉(zhuǎn)速為200 r/后靜置20 液體樣品稀釋至10 )從最后三個濃度懸液中各取。. 1 玻璃刮刀將菌液涂勻。每個稀釋度重復(fù)3次。28溫度下培養(yǎng)2-5 d。在馬丁培養(yǎng)基上加人10-附錄A)或芽胞染色(見附錄B)，在顯微鏡下觀察，取菌落20300的平板計數(shù)。計算出三個重復(fù)的有效磷細(xì)菌菌落平均數(shù)。有效磷細(xì)菌菌落以外的其他細(xì)菌菌落為細(xì)菌雜菌菌落數(shù)在馬丁培養(yǎng)基上計出霉菌菌落數(shù)。有效磷細(xì)菌活菌數(shù)按式(3)計算:有效磷細(xì)菌活菌數(shù)(個/9)=有效菌落平均數(shù)樣量娘)L).(3雜菌數(shù)為馬丁培養(yǎng)基上的霉菌數(shù)與選擇培養(yǎng)基上出現(xiàn)的雜菌數(shù)之和。雜菌數(shù)按式(4)計算.(4)雜菌數(shù)(個/9)=雜菌菌落平均數(shù))計算:母液體積(品量(g) 菌率(%)=菌菌落平均數(shù)又100。(5)將有機(jī)磷細(xì)菌或無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基融化后冷卻至45 皿約15 固后培養(yǎng)基表面無冷凝水后待用。待測菌種活化后加人適量無菌水，刮下菌苔，制成均勻的菌懸液。用滅菌滴管滴人備用的平板上，每皿可均勻地分別滴四個點(diǎn)。待滴人的菌懸液干后才可反轉(zhuǎn)置于28恒溫箱中培養(yǎng)，2菌落周圍有透明圈為有溶磷或解磷作用，無透明圈的為不溶磷、少溶磷，或不解磷、搖床(200 r/保溫30上清液傾出待測用鋁銻抗比色法測定有效磷含量(見附錄B)了. 菌數(shù)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求的即為有效期合格。8檢驗規(guī)則(判定規(guī)則)產(chǎn)品型式檢驗新產(chǎn)品鑒定或國家質(zhì)檢機(jī)構(gòu)質(zhì)量監(jiān)督檢驗。2. 廠檢驗不檢有效期。一切微生物肥料的產(chǎn)品必須達(dá)到的指標(biāo)。所規(guī)定的外觀、水分、細(xì)度、有機(jī)質(zhì)、產(chǎn)品是否合格作如下規(guī)定:12一2000。)有效活菌數(shù)不合格時該產(chǎn)品判定為不合格產(chǎn)品;b)有效活菌數(shù)合格，雜菌率合格，參考指標(biāo)四項(包含四項)以卜不合格，該產(chǎn)品判定為不合格品;。)產(chǎn)品判定為合格產(chǎn)品;參考指標(biāo)有兩項以上(含兩項)不合格者，該產(chǎn)品判定為不合格;d)有效活菌數(shù)合格，雜菌率大于5. 2. 3所規(guī)定的2倍;或者微生物肥料霉菌數(shù)大于或等于6. (拌種劑霉菌數(shù)大于等于3. 0 X 10個/g (該產(chǎn)品判為不合格產(chǎn)品。其他各項符合，可判為合格產(chǎn)品。9包裝、標(biāo)識、包裝用塑料桶。固體肥料用不透明聚乙烯塑料袋包裝。顆粒磷細(xì)菌肥料亦可用編織袋包裝。箱質(zhì)量應(yīng)符合 6543的要求。)產(chǎn)品中附有產(chǎn)品合格證和使用說明書，在使用說明中標(biāo)明使用方法、用量及注意事項。輸和貯存磷細(xì)菌肥料的標(biāo)識、運(yùn)輸和貯存按112,Y 412準(zhǔn)的附錄)革蘭氏染色染色荊1結(jié)品紫液赫克爾(配方甲液:結(jié)晶紫29乙醇(95010) 20酸錢。89蒸餾水80 兩液相混，靜置48 染液較穩(wěn)定，在不透氣的暗色瓶中可儲存數(shù)月。2盧哥(氏碘液碘(1,)片19碘化鉀( 2 -5 餾水溶解碘化鉀，再投人碘片，待碘全溶后，加水至300 乙醇液。4復(fù)染液。5%酒精溶液2。3在無油跡的干凈載片上注明日期、片號。在載片上滴加無菌水一小滴，用接種環(huán)挑取少許菌苔，于水滴邊緣輕涂幾下自然風(fēng)干或微熱促其快干，干后在火焰上通過2固定涂片。染色步驟滴加結(jié)晶紫液，援蓋約1 以碘液沖去殘水，再加碘液覆蓋約1 片上水甩凈或用濾紙吸干。將片傾斜，并襯以白背景，流滴95%酒精液約20s，立即用水沖凈酒精。用番紅液染1更多)水洗凈番紅，用濾紙吸干表面水或風(fēng)干。備鏡檢，二微鏡油鏡直接在載玻片匕觀查。紅色為革蘭氏染色陰性，藍(lán)紫色為革蘭氏染色陽性觀察細(xì)閑,r，12一2000的個體形狀、排列、大小、是否有芽胞及形狀、大小和著生位置等氏染色的配方很多，但染色成功與否很大程度卜取決于經(jīng)驗。在沒有把握時，最好在同一載玻片卜，用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為革蘭氏染色陰性和染色陽性的對照菌。涂片和脫色兩步最為重要。涂片切不可過于濃厚。對于易于乳化的細(xì)菌將沾有菌苔的接種環(huán)在水滴邊緣輕輕涂一二下即可。鏡檢時，以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。對純細(xì)菌的涂片，以95%乙醇易于掌握。乙醇中含有更多的水分，則脫色力加強(qiáng)，易形成假陰性因此要盡量減少載玻片甩凈或用乙醇沖去殘水，以脫色20 濾紙吸凈殘水，可用乙醇脫色近30 載玻片不燙手為宜過熱會使染色反應(yīng)不正確實際上對斜面純細(xì)菌涂片，風(fēng)干后不經(jīng)火焰固定即可染色。5%番紅液，比一般文獻(xiàn)上的濃度濃一倍，常不易脫色，出現(xiàn)假陽性。遇到這種情況，將染劑稀釋后使用。試用的龍膽紫稀釋成十分之一的濃度可以使用，但顏色仍然不如結(jié)晶紫。6對一般容易生長的異養(yǎng)細(xì)菌，以檢查培養(yǎng)1824 蘭氏染色陽性細(xì)菌的染色反應(yīng)，有的受菌齡的影響:較幼的細(xì)胞，培養(yǎng)18陽性反應(yīng);較老的細(xì)胞，培養(yǎng)24 部分或全部細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮苑磻?yīng)。在區(qū)分革蘭氏染色反應(yīng)時應(yīng)注意附錄B(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)7. 6%孔雀綠孔雀綠蒸餾水7. 6 酒精液蒸餾水法同3染色a)用孔雀綠染液染滴于載片L 10 果加熱使冒水蒸氣則效果更好b)用自來水沖洗;。)用。d)川水沖洗后吸千、鏡檢胞呈綠色，菌體和芽胞囊呈微紅色。但菌體中有異染粒時，也可是現(xiàn)綠色。12準(zhǔn)的附錄),6一二硝基酚C,H,),指示劑:g 2,6一二硝基酚溶于100 和液)。 5 24 h。在布氏漏斗上抽氣過濾，每次用少量蒸餾水淋洗多次，直至檢查濾液無磷為止，然后烘干裝瓶待用。鹽酸(泡過夜，用蒸餾水沖洗多次后再用。. 5 浸泡處理。2(分析純)153 拌、冷卻。析純)溶于約60的300 卻。然后將硫酸溶液緩緩滴人鋁酸餒溶液中，再加人100 石酸銻鉀溶液K (,H,O,告H,0分析純:，最后用水稀釋至:工，盛于棕色瓶中。1. 5 ,H,O,，左旋比旋光度+2122 0溶于100 液隨配隨用，有效期1 d,5 磷標(biāo)準(zhǔn)液:稱取在105烘箱中烘2H,析純)0. 439 人5 ,)，轉(zhuǎn)人11容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度即為100 磷標(biāo)準(zhǔn)液，可長期保存?zhèn)溆?。取此溶液?zhǔn)確稀釋20倍即為5 磷標(biāo)準(zhǔn)液，此溶液不宜久放。酸(H,10氫氧化鈉(,1將發(fā)酵液加人適量活性炭脫色，離心，吸取上清液2550 水稀釋至20 2,6一二硝基酚指示劑2滴，用10 d、心緩加，邊加邊搖，防止產(chǎn)生的二氧化碳把溶液噴出瓶口)，然后加人鑰銻抗顯色劑5 勻，定容至刻度。在室溫20 下放置30 00 色濾光片)比色，以空白試驗溶液為參比液調(diào)零點(diǎn)。讀取數(shù)值，在工作曲線上查出顯色液磷的讀數(shù)。磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。,2,3,4,5,6 水稀釋至約20 人鉑銻抗顯色劑5勻定容，即得0,0. 1,0. 2,. 6 磷標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，與待測溶液同時比色，讀出數(shù)值。在方格坐標(biāo)紙上以測得數(shù)值為縱坐標(biāo)，磷數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制成工作曲線1)計算有效磷(%)=09x 100。(中:顯色液磷(尸)讀數(shù)從工作曲線上查得顯色液磷的讀數(shù);顯色液體積取倍數(shù)發(fā)酵液體積(三角瓶)(吸取發(fā)酵液(12酵液中加人有機(jī)或無機(jī)磷化物物質(zhì)的質(zhì)量(指每個三角瓶)，9;105將算成，只;兩次平行測定結(jié)果允許誤差為5%附錄D(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)測定磷細(xì)菌活菌數(shù)及雜菌含磷細(xì)菌菌數(shù))蛋白陳牛肉膏氯化鈉(瓊脂蒸餾水磷細(xì)菌解磷效能)葡萄糖硫酸錢C(2母粉氯化鈉(氯化鉀(酸鎂(7H,0)硫酸鐵(7酸錳(4磷脂碳酸鈣()瓊脂蒸餾水磷細(xì)菌解磷效能)葡萄糖硫酸餒