學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。論文中除特別標(biāo)注的內(nèi)容外，不包含任何其他個(gè)人或機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。對(duì)本研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在論文中作了明確的聲明并表示了謝意。本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。作者簽名日期復(fù)旦大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解復(fù)旦大學(xué)有關(guān)收藏和利用博士、碩士學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)收藏、使用并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的印刷本和電子版本；允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存論文。涉密學(xué)位論文在解密后遵守此規(guī)定。作者簽名導(dǎo)師簽名日期目錄縮略詞表1中文摘要2英文摘要3前言5正文7國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀7材料與方法13結(jié)果17結(jié)論與討論32參考文獻(xiàn)39全文小結(jié)43附錄44后記及致謝56縮略詞表ABBREVIATION英文縮略詞英文全稱中文譯名ONFHOSTEONECROSISOFFEMORALHEAD股骨頭壞死OAOSTEOARTHRITIS骨關(guān)節(jié)炎BMSCBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLS骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞VEGFVASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTOR血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子MIRNAMIRCORIBONUCLEICACID微小核糖核酸CBFCPROMOTERBINDINGFACTORC啟動(dòng)子結(jié)合因子SVSLOWVIRUS慢病毒中文摘要目的研究MIRNA210調(diào)控NOTCH信號(hào)通路在激素性骨壞死的病理作用機(jī)理，探索臨床激素性骨壞死防治的新方向。材料與方法選取60只10周齡的雌性SD大鼠，隨機(jī)均分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組30只，采用甲強(qiáng)龍連續(xù)肌注3次建立大鼠ONFH模型。于造模結(jié)束后4周（A組）、8周（B組）、12周（C組）將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的大鼠各處死1/3（10只），取雙層股骨頭，一側(cè)用于病理切片制作，另一側(cè)進(jìn)行MIRNA210和NOTCH信號(hào)通路表達(dá)的檢測(cè)，并驗(yàn)證MIRNA210和NOTCH表達(dá)量的相關(guān)性。結(jié)果（1）HE染色切片A組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均未見(jiàn)明顯骨壞死；B組可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組的骨壞死率明顯高于對(duì)照組；C組實(shí)驗(yàn)組的骨壞死率高于對(duì)照組，且介入A組和B組之間。（2）NOTCH1免疫組化染色A組和B組的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均未見(jiàn)明顯NOTCH1染色團(tuán)塊；C組對(duì)照組未見(jiàn)明顯NOTCH1染色團(tuán)塊，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)較為明顯的NOTCH1染色團(tuán)塊。（3）MIRNA210表達(dá)檢測(cè)A組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間MIRNA210的表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P005）；B組和C組實(shí)驗(yàn)組組與對(duì)照組之間MIRNA210的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P005）。（4）NOTCH信號(hào)通路表達(dá)檢測(cè)A組和B組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照之間NOTCH信號(hào)通路的表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P005）；C組實(shí)驗(yàn)組組與對(duì)照組之間NOTCH信號(hào)通路的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P005）。（5）相關(guān)性檢測(cè)A組和B組NOTCH通路中各個(gè)組分的表達(dá)量與MIRNA210均未見(jiàn)明顯相關(guān)性（R08）；C組中NOTCH1以及HES1的表達(dá)量與MIRNA210有明顯相關(guān)性（R08）；RBPJK的表達(dá)量與MIRNA210無(wú)明顯相關(guān)性（R08）。結(jié)論通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，證明MIRNA210和NOTCH信號(hào)通路在激素性骨壞死中晚期表達(dá)量增高，可能與骨壞死的修復(fù)相關(guān)。關(guān)鍵詞激素性骨壞死；MIRNA210；NOTCH信號(hào)通路中圖分類號(hào)R3ABSTRACTINTRODUCTIONANDOBJECTIVESTHISPAPERSTUDIESTHERELATIONSHIPBETWEENSIGNALINGNOTCHCONTROLLEDBYMIRNA210ANDTHEREPAIROFONFH,ANDESTABLISHSOMENEWWAYSOFPREVENTIONANDTREATMENTMATERIALSANDMETHODSTHISPROJECTWASDONEWITH60SDRATS,FEMALE,10WEEKS60RATSWASRANDOMLYDIVIDEDINTOTWOGROUPSTHEEXPERIMENTALGROUPANDTHECONTROLGROUP,EACHGROUPHAS30RATSTHEONFHMODELWASESTABLISHEDBYINJECTIONOFPREDNISOLONE3TIMESAT4WEEKSGROUPA,8WEEKSGROUPB,12WEEK3GROUPCAFTERTHEMODELWASESTABLISHED,EXECUTED1/3OFBOTHTHEEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPANDTOOKOUTFEMORALHEADS,ONESIDEWASFORPATHOLOGICALSECTION,ANDANOTHERWASFORTHEEXPRESSIONOFMIRNA210ANDSIGNALINGNOTCHRESULTS1HESECTIONGROUPATHEREWASNOOBVIOUSOSTEONECROSISINBOTHEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPGROUPBTHENECROSISRATEOFEXPERIMENTALGROUPISHIGHERTHANCONTROLGROUPGROUPCTHENECROSISRATEOFEXPERIMENTALGROUPISHIGHERTHANCONTROLGROUPANDWASBETWEENGROUPAANDGROUPB2NOTCH1SECTIONGROUPAANDGROUPBTHEREWASNOOBVIOUSDYEINGMASSINBOTHEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPGROUPCTHEREWASNOOBVIOUSDYEINGMASSINCONTROLGROUP,BUTTHEREWASOBVIOUSDYEINGMASSINEXPERIMENTALGROUP3THEEXPRESSIONOFMIRNA210GROUPATHEREWASNOSIGNIFICANTDIFFERENCEOFTHEEXPRESSIONBETWEENEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPP005GROUPBTHEREWASASIGNIFICANTDIFFERENCEBETWEENEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPP005GROUPBTHEREWASNOSIGNIFICANTDIFFERENCEBETWEENEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPP005GROUPCTHEREWASASIGNIFICANTDIFFERENCEBETWEENEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPP08THEEXPRESSIONOFRBPJKISNOTRELATIVETOTHEEXPRESSIONOFMIRNA210R08CONCLUSIONTHEEXPRESSIONOFMIRNA210ANDSIGNALINGNOTCHWASRAISEDINTHELATESTAGEOFONFHANDTHEYMAYBEINRELATIONSHIPWITHTHEREPAIROFONFHKEYWORDSSTEROIDINDUCEDOSTEONECROSIS,MIRNA210,SIGNALINGNOTCHCHINESELIBRARYCLASSIFICATIONR3前言糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的股骨頭壞死（OSTEONECROSISOFFEMORALHEAD,ONFH）是臨床最為常見(jiàn)的骨科疾病之一，多始發(fā)于青壯年，我國(guó)的平均發(fā)病年齡約為42歲，總發(fā)病率占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死總發(fā)病率的469左右，是非創(chuàng)傷骨壞死的首要病因1。其臨床表現(xiàn)早起以髖關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、活動(dòng)受限等，晚期常導(dǎo)致股骨頭塌陷，髖關(guān)節(jié)面破壞，關(guān)節(jié)間隙狹窄等致殘性改變。目前臨床治療激素性骨壞死的方案很多，但尚無(wú)意見(jiàn)一致的理想方法，而且由于早起疾病難以發(fā)現(xiàn)，往往導(dǎo)致患者錯(cuò)過(guò)最佳就診時(shí)機(jī)，延誤治療，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。另一方面，相對(duì)于其高發(fā)病率和危險(xiǎn)性，骨壞死的發(fā)病機(jī)制仍然尚不明確，因此探索其發(fā)病機(jī)制，尋找早起有效的預(yù)防、治療措施一直是國(guó)內(nèi)外對(duì)于ONFH研究是重點(diǎn)和難點(diǎn)所在。目前對(duì)于激素性骨壞死發(fā)病機(jī)制的主流觀點(diǎn)包括骨代謝異常、脂代謝異常、骨細(xì)胞分化障礙、細(xì)胞凋亡等幾個(gè)方面24，每一種學(xué)說(shuō)均有其支持和反對(duì)的依據(jù)，尚無(wú)統(tǒng)一理論能涵蓋以上所有學(xué)說(shuō)。近幾年許多研究表明，糖皮質(zhì)激素會(huì)作用于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，從而影響其成骨和成脂分化的平衡，進(jìn)一步造成成骨和破骨代謝的失衡，大量骨質(zhì)丟失，是激素性骨壞死的主要病理機(jī)制56。然而奇怪的是，一些臨床上抑制破骨的藥物，如二磷酸鹽等，使用后也會(huì)產(chǎn)生下頜骨缺血性壞死的并發(fā)癥7，似乎與之前成、破骨代謝失衡導(dǎo)致骨壞死的理論相違背。之后的一些研究發(fā)現(xiàn)，這些藥物在抑制破骨細(xì)胞功能的同時(shí)，也會(huì)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的成血管作用，造成局部微血管新生障礙，破壞微循環(huán)，導(dǎo)致缺血性骨壞死的發(fā)生89。綜上所述，微循環(huán)的破壞合并成骨成脂代謝障礙可能是激素性骨壞死的主要發(fā)生機(jī)理，因此防止微循環(huán)的破壞、促進(jìn)血管新生將會(huì)是早起預(yù)防和治療ONFH的重要方向之一，具有重要的理論和臨床意義。另一方面，MIRNA210是低氧低血供誘導(dǎo)表達(dá)的眾多MIRNA之一，并且在其中占有重要的主導(dǎo)地位，調(diào)控下游VEGF、NOTCH等多個(gè)信號(hào)通路的表達(dá)10。目前已經(jīng)有多項(xiàng)研究表明MIRNA210控制的信號(hào)通路在心、腎、腦等器官的血管新生中具有十分重要的作用；而抑制MIRNA210的表達(dá)將使血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)缺血缺氧等刺激條件的反應(yīng)性大幅下降，進(jìn)一步影響其在缺血性疾病后期的修復(fù)過(guò)程11。但是在骨骼缺血性壞死的病理過(guò)程中，MIRNA210的作用并沒(méi)有得到足夠的研究和闡明，若是能夠明確MIRNA210在骨壞死血管新生中作用，將會(huì)是對(duì)其預(yù)防和治療的一大突破。參考文獻(xiàn)1ZHAOFC,ZHUANGQY,GUOKJCLINICALANALYSISOFOSTEONECROSISOFTHEFEMORALHEADINDUCEDBYSTEROIDJORTHOPSURG2012,4128342GONGLL,FANGLH,WANGHY,ETALGENETICRISKFACTORSFORGLUCOCORTICOIDINDUCEDOSTEONECROSISAMETAANALYSISJSTEROID2013,2521243PAKOSCHD,PAPADIMASD,MUNDINGJ,ETALOSTEONECROSISOFTHEMANDIBLEDUETOANTIANGIOGENICAGENTJORALMAXILLOFACSURG2012,1645494WANGYS,WANGYH,ZHAOGO,ETALOSTEOGENICPOTENTIALOFHUMANCALCITONINGENERELATEDPEPTIDEALPHAGENEMODIFIEDBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSJCHINMEDJ2011,12423376815TANG,KANGPD,PEIFXGLUCOCORTICOIDAFFECTTHEMETABOLISMOFBONEMARROWSTROMALCELLANDLEADTOOSTEONECROSISOFFEMORALHEADJCHINMEDJ2012,125113496FANGUSAROJ,GURURANGANS,JAKACKIRI,ETALBEVACIZUMABINDUCEDOSTEONECROSISOFWRISTANDKNEEINTHREEPEDIATRICPATIENTSWITHCURRENTCNSTUMORSJJCLINONCOL2013,3122477VINCENZIB,NAPOLITANOA,ZOCCOLIA,ETALSERUMVEGFLEVELSASPREDICTIVEMARKERSOFBISPHOSPHONATERELATEDOSTEONECROSISOFJAWJJHEMATOLONCOL2012,175568LIUY,BERENDSENAD,JIAD,ETALINTRACELLULARVEGFREGULATESTHEBALANCEBETWEENOSTEOBLASTANDADIPOCYTEDIFFERENTIATIONJJCLININVEST2012,1229101139MALANJ,ETTINGERK,NAUMANNE,ETALTHERELATIONSHIPOFDENOSUMABPHARMACOLOGYANDOSTEONECROSISOFJAWJORALSURGORALMEDORALPATHOLORALRADIOL2012,1146671610CAPORALIA,EMANEULICMICRORNASINPOSTISCHEMICVASCULARREPAIRJCARDIOLRESPRACT2013,33219320011HUANGF,ZHUX,HUXQ,ETALMESENCHYMALSTEMCELLSMODIFIEDWITHMIRNA126RELEASEANGIOGENICFACTORSANDACTIVATENOTCHLIGANDDELTALIKE4,ENHANCINGISCHEMICANGIOGENESISANDCELLSURVIVALJINTJMOLMED2013,31248492正文激素性骨壞死是骨科臨床最為常見(jiàn)和主要的疾病之一，但是對(duì)于激素性骨壞死的發(fā)病機(jī)制仍然不甚清楚，各種理論還不能得到統(tǒng)一。然而無(wú)論是哪種理論，骨局部血供的減少、微循環(huán)的破壞都是導(dǎo)致骨壞死發(fā)生的直接原因之一。因此減少血供的破壞以及促進(jìn)血管新生無(wú)疑將會(huì)是骨壞死后期修復(fù)的主要途徑。而經(jīng)由MIRNA210調(diào)控的NOTCH信號(hào)通路已被證實(shí)在其他器官的血管新生中能發(fā)揮重要作用，如果能明確其在骨壞死后期修復(fù)中的作用的話，將會(huì)對(duì)臨床激素性骨壞死的防治產(chǎn)生重要的幫助。國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀11血管新生與NOTCH信號(hào)通路目前對(duì)于血管新生（ANGIOGENESIS）的定義為從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管，主要包括激活期血管基底膜降解血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移重建形成新的血管和血管網(wǎng)，是一個(gè)涉及多種細(xì)胞的多種分子的復(fù)雜過(guò)程。血管新生是促血管形成因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜過(guò)程，正常情況下二者處于平衡狀態(tài)，一旦此平衡打破就會(huì)激活血管系統(tǒng)，使血管生成過(guò)度或抑制血管系統(tǒng)使血管退化。CARLIER等的研究證實(shí)，血管新生與傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)的血管生成不同，是通過(guò)出芽的方式完成的1。整個(gè)過(guò)程起始于缺血后低氧環(huán)境對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激，VEGF表達(dá)量上升，使端細(xì)胞（TIPCELL）選擇性激活，依據(jù)VEGF濃度梯度趨化生長(zhǎng)，然后NOTCH信號(hào)通路被激活，促使內(nèi)皮中的柄細(xì)胞STALKCELL增殖遷移，形成管腔。兩個(gè)或多個(gè)部位形成的管腔連接在一起，完成血管新生的過(guò)程2。血管生成過(guò)程中需要血管內(nèi)皮細(xì)胞EC與細(xì)胞外基質(zhì)間、EC與EC間及EC與其他周圍細(xì)胞間的相互作用。無(wú)疑血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管新生過(guò)程中發(fā)揮主要作用的細(xì)胞，而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）則是這個(gè)過(guò)程中調(diào)控血管發(fā)育的最主要的信號(hào)通路，目前發(fā)現(xiàn)的VEGF家族共有5個(gè)受體和5個(gè)配體，它的表達(dá)受缺血缺氧環(huán)境、機(jī)械應(yīng)力、脂肪代謝等多個(gè)因素影響，并在內(nèi)皮細(xì)胞激活、增殖遷移、出芽等多個(gè)血管新生的重要方面都發(fā)揮著調(diào)控作用34。但是，另一方面，VEGF并不能單獨(dú)控制整個(gè)血管新生的過(guò)程，有許多與它相互影響的信號(hào)通路共同參與對(duì)血管新生的調(diào)節(jié)，其中NOTCH信號(hào)通路就是最為常見(jiàn)和重要的信號(hào)通路。血管新生的具體信號(hào)通路見(jiàn)圖111。圖111血管新生相關(guān)信號(hào)通路。NOTCH信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路，最早于1919年由科學(xué)家MORGAN在果蠅身上發(fā)現(xiàn)5，能夠影響細(xì)胞正常形態(tài)發(fā)生的多個(gè)過(guò)程，包括多能祖細(xì)胞的分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及細(xì)胞邊界的形成。哺乳動(dòng)物的NOTCH信號(hào)通路由4個(gè)受體（NOTCH14）和5個(gè)配體（DELTALIKE1，2，3以及JAGGED1,2）組成。NOTCH信號(hào)通路的激活方式主要分為兩種經(jīng)典的CSL依賴通路和CSL非依賴通路，其中CSL是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，它能在NOTCH信號(hào)通路的表達(dá)中其關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。這兩者的區(qū)別在于前者NOTCH受體與配體結(jié)合后，釋放出的信使通過(guò)與CSL結(jié)合的方式，激活信號(hào)通路的表達(dá)，是較為主要的表達(dá)方式；而后者則是與細(xì)胞內(nèi)的鋅指蛋白等物質(zhì)結(jié)合，通過(guò)調(diào)控其他的轉(zhuǎn)錄抑制因子從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)通路的表達(dá)。然后，借由激活下游靶分子，如HES1、HES5等，發(fā)揮自身的作用67。NOTCH信號(hào)通路的具體組成見(jiàn)圖112。圖112NOTCH信號(hào)通路組成。目前，NOTCH信號(hào)通路已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于心臟、腦、腎臟等多個(gè)組織器官中，尤其是NOTCH1受體，在心肌中大量表達(dá)，LAWSON等的實(shí)驗(yàn)表明，如果在胚胎期NOTCH1發(fā)生突變，會(huì)導(dǎo)致心血管系統(tǒng)發(fā)育異常而使小鼠死亡8。而NOTCH3則主要表達(dá)表達(dá)于平滑肌細(xì)胞，如果NOTCH3發(fā)生突變，臨床上會(huì)引起大腦常染色體顯性動(dòng)脈病，常伴有血管平滑肌的退化造成中風(fēng)和癡呆9；而DOMENGA等的研究則發(fā)現(xiàn)，NOTCH3敲除后，血管平滑肌標(biāo)志物之一的SMOOTHELIN的表達(dá)量會(huì)明顯下調(diào)，而大鼠則會(huì)出現(xiàn)血管發(fā)育障礙的癥狀，如肢端壞死等10。另一方面，THURSTON和MORROW等則發(fā)現(xiàn)了NOTCH通路的配體，如DLL4和JEGGED1等，在腫瘤新生血管中占有重要的地位，并且不同受體的不同表達(dá)量可能同時(shí)在血管新生的促進(jìn)和抑制兩方面發(fā)揮作用1112。另外也有學(xué)者認(rèn)為，NOTCH信號(hào)通路可能是VEGF通路的一種負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制，VEGF負(fù)責(zé)血管的新生，而NOTCH則能促進(jìn)新生血管的成熟，防止血管增生過(guò)度13。無(wú)論如何，NOTCH通路在血管新生的調(diào)控中占有不可忽視的地位，這一點(diǎn)都是毋庸置疑的，這種調(diào)控作用可能會(huì)影響到一些外源性的因子對(duì)血管的治療作用。12MIRNA210對(duì)NOTCH信號(hào)通路的調(diào)控MIRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約2025個(gè)核苷酸。成熟的MIRNAS是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶MRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶MRNA或者阻遏靶MRNA的翻譯。最近的研究表明MIRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等14。國(guó)內(nèi)外均有研究證明在VEGF和NOTCH信號(hào)通路的上游存在多種MIRNA發(fā)揮調(diào)控作用，影響體內(nèi)各個(gè)器官的血管新生過(guò)程。SUAREZ等的研究表明，如果將血管內(nèi)皮細(xì)胞中調(diào)節(jié)MIRNA生成的DICER基因敲除，造成MIRNA生成障礙的話，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)缺血缺氧等環(huán)境刺激失去應(yīng)激性，VEGF的生成量明顯受到抑制；而相對(duì)的，如果將MIRNA轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒導(dǎo)入基因敲除的內(nèi)皮細(xì)胞中，則可以觀察到失去應(yīng)激性的內(nèi)皮細(xì)胞重新恢復(fù)了對(duì)環(huán)境刺激的應(yīng)激性，VEGF和NOTCH的表達(dá)量也上升至正常值15。HUANGF等人的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)MIRNA在NOTCH信號(hào)通路調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)發(fā)育的過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，尤其是對(duì)DLL1受體的表達(dá)至關(guān)重要16。而楊陽(yáng)等人則發(fā)現(xiàn)在腎癌模型中，MIRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)NOTCH1和HES1的表達(dá)進(jìn)一步控制腎癌中血管的形成和破壞，這對(duì)于腎癌的病理分級(jí)有著極大的影響17，從而證明了MIRNA在血管新生中確實(shí)的對(duì)VEGF和NOTCH等信號(hào)通路存在調(diào)控作用。缺血缺氧環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)的MIRNA有多種，包括MIRNA100，MIRNA126，MIRNA210，MIRNA503等，其中MIRNA126和MIRNA210是關(guān)鍵的調(diào)控基因。MIRNA126是內(nèi)皮細(xì)胞和血液干細(xì)胞特異表達(dá)的一種MIRNA，通過(guò)對(duì)VEGF和NOTCH的調(diào)節(jié)來(lái)影響血管新生過(guò)程；而MIRNA210是缺氧特異性MIRNA，在低氧環(huán)境中表達(dá)量會(huì)大幅上升，調(diào)控VEGF和NOTCH通路從而在血管再生和內(nèi)皮細(xì)胞功能的穩(wěn)定中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)于MIRNA210的研究國(guó)內(nèi)外并不少見(jiàn)，ZHANGXJ的研究發(fā)現(xiàn)MIRNA210在胃癌的高轉(zhuǎn)移株和低轉(zhuǎn)移株之間差異性表達(dá)，認(rèn)為MIRNA210可能通過(guò)調(diào)節(jié)胃癌新生血管來(lái)影響其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特性18；劉亞明等人則在腎積水的模型中發(fā)現(xiàn)，在缺血缺氧的狀態(tài)下，MIRNA210能夠誘導(dǎo)HIF1和VEGF的表達(dá)，從而增加血管新生，調(diào)節(jié)腎積水后對(duì)缺血缺氧環(huán)境的適應(yīng)力19；而張倍源等人的實(shí)驗(yàn)則表明，MIRNA210在骨質(zhì)疏松模型中可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）的成骨分化，確認(rèn)了MIRNA210在骨骼系統(tǒng)的分化平衡中也發(fā)揮著作用20；NIE等人的研究則發(fā)現(xiàn)了MIRNA210的表達(dá)能在缺氧狀態(tài)下顯著提高M(jìn)SC的存活能力，抑制凋亡反應(yīng)的發(fā)生21。換句話說(shuō)，MIRNA210在體內(nèi)多個(gè)組織器官的多種血管新生相關(guān)的生理病理過(guò)程中都占據(jù)著重要的一席之地，對(duì)很多情況下的血管新生起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。MIRNA210結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖12。圖121MIRNA210結(jié)構(gòu)圖。另一方面，激素性骨壞死也可以歸為缺血性疾病之一，骨骼局部小血管的破壞引起的微循環(huán)障礙是其發(fā)生的主要原因，因此可以預(yù)見(jiàn)到血管新生將會(huì)是骨壞死晚期修復(fù)過(guò)程中的一個(gè)重要因素。YAMASAKI等人的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MIRNA210的表達(dá)量增高并且分布于壞死病灶周圍22；張長(zhǎng)青等人也證實(shí)了骨壞死患者血漿中的MIRNA210含量要明顯高于普通人23。但是MIRNA210在骨壞死修復(fù)中的作用仍然沒(méi)有明確的研究能夠確認(rèn)。我們的前期工作中觀察到在骨壞死過(guò)程中VEGF和NOTCH信號(hào)通路有激活反應(yīng)，可是在ONFH不同時(shí)間段的表達(dá)規(guī)律以及這些信號(hào)通路的激活與骨壞死修復(fù)的具體關(guān)系仍然不甚明了；除此以外，MIRNA210在骨壞死中是否也如同其他器官一樣發(fā)揮著對(duì)VEGF和NOTCH通路的調(diào)控作用也依然是個(gè)未知數(shù)，如果等闡明這些問(wèn)題，想必能夠?qū)εR床ONFH的防治提供一條新的思路。13激素性骨壞死與血管新生股骨頭壞死的血供主要由以下三條動(dòng)脈供應(yīng)（1）股骨頭圓韌帶動(dòng)脈起源于閉孔動(dòng)脈的一條分支，主要為股骨頭凹陷附近骨質(zhì)供血，老年人次動(dòng)脈多已經(jīng)閉塞。（2）支持帶動(dòng)脈從旋股內(nèi)和旋股外動(dòng)脈發(fā)出，在股骨頸基底處呈環(huán)狀吻合構(gòu)成基底動(dòng)脈環(huán)，再分別發(fā)出數(shù)條頸升動(dòng)脈，分布至股骨頭，提供股骨頭和股骨頸的絕大部分血供。（3）股骨干滋養(yǎng)動(dòng)脈來(lái)自股骨干髓腔的滋養(yǎng)動(dòng)脈，沿股骨干上升至股骨頸出，一般不與股骨頭內(nèi)部的血管產(chǎn)生吻合，供血量較少。這其中支持帶動(dòng)脈是主要的供血?jiǎng)用}，損傷后將影響股骨頭大部分血供，所以當(dāng)股骨頸骨折等情況造成支持帶動(dòng)脈損傷時(shí)，即使骨骼愈合完好依然容易導(dǎo)致骨壞死的發(fā)生。而激素性骨壞死造成股骨頭內(nèi)缺血的原因很多，包括高凝狀態(tài)、脂肪栓塞，內(nèi)部機(jī)械壓力增高造成的血管閉塞等，目前尚不能確定哪一種原因是造成缺血發(fā)生的主要機(jī)制。正是因?yàn)閾碛衅茐难┑倪@種作用，激素以前就被用于類似于腫瘤等富血供疾病的治療，如GREENBEGER等就發(fā)現(xiàn)地塞米松能通過(guò)影響血管瘤干細(xì)胞功能，減少血管瘤在小鼠體內(nèi)的血管形成24；而LOGIE的實(shí)驗(yàn)則證實(shí)了地塞米松能作用于人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，影響其出芽功能，從而造成管狀結(jié)構(gòu)的缺陷，抑制血管新生25。股骨頭的具體血供見(jiàn)圖131圖131股骨頭血供示意圖。在激素性骨壞死的晚期過(guò)程中，骨內(nèi)血管新生與骨質(zhì)的修復(fù)是密不可分的，新生的血管能為骨質(zhì)帶來(lái)必須的氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和前體細(xì)胞等，而骨質(zhì)的修復(fù)、塑形則可以為血管提供支持和保護(hù)，并影響血管的出芽、遷移、粘附等過(guò)程。對(duì)于骨壞死中的血供破壞和修復(fù)已經(jīng)不乏研究，程少華等人通過(guò)觀察VEGF在高壓氧治療骨壞死過(guò)程的表達(dá)規(guī)律證實(shí)在骨壞死修復(fù)過(guò)程中血管新生是必要步驟26；FANM等人的研究則證明了有促進(jìn)成骨活動(dòng)和血管新生作用的唑來(lái)膦酸能在骨壞死股骨頭塌陷的預(yù)防中起到很好的作用27；WANGHM等人和王靈松等人都發(fā)現(xiàn)了通過(guò)股動(dòng)脈內(nèi)基質(zhì)干細(xì)胞或者單個(gè)核細(xì)胞移植，增強(qiáng)其成血管能力，對(duì)于激素性骨壞死的治療發(fā)揮了良好的效果2829；而最為直接的證據(jù)，作為目前治療骨壞死療效最為肯定是手術(shù)術(shù)式之一，帶血管蒂腓骨或髂骨瓣移植，也是通過(guò)改善股骨頭血供和來(lái)治療骨壞死的30。值得一提的是，也有研究認(rèn)為血管新生不止與骨質(zhì)形成有關(guān)，破骨反應(yīng)對(duì)于血管新生也十分重要。CACKOWSKI等的研究表示，破骨細(xì)胞能夠通過(guò)分泌MMP9來(lái)調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)缺血區(qū)域的血管再生，可以認(rèn)為是缺血性骨壞死的一種自限機(jī)制31。綜上所述，血管新生在骨壞死后期修復(fù)過(guò)程中有著十分重要的地位，在明確骨壞死中血管新生的作用機(jī)理后，預(yù)防血供破壞和促進(jìn)血管新生一定會(huì)是將來(lái)骨壞死防治中的主要方向。材料與方法21實(shí)驗(yàn)材料211實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取健康清潔級(jí)SD雌性大鼠60只，10周齡，體重250G左右，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。60只大鼠隨機(jī)均分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組30只，相同條件下采用輻照飼料飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件見(jiàn)圖211。212實(shí)驗(yàn)藥劑注射用甲強(qiáng)龍500MG/瓶4瓶，注射用慶大霉素8萬(wàn)U/瓶60瓶，生理鹽水若干，5葡萄糖水若干，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科提供。石蠟，二甲苯I溶液，二甲苯II溶液，100乙醇，95乙醇，80乙醇，75乙醇，蘇木精染液，伊紅染液，1鹽酸，1氨水，中性樹(shù)脂，二甲苯石碳酸，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病理教研中心提供。分析純大腸桿菌內(nèi)毒素1MG，EDTA10中性甲醛脫鈣液400ML，5福爾馬林緩沖固定液500ML，由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供。液氮，反應(yīng)緩沖液，TAQDNA聚合酶，4DTNP，引物U6、MIR2103PRAT，引物GAPDH（RAT）、NOTCH1、HES1、RBPJ，004MOL/LTRIS乙酸，0001MOL/LEDTA，10MG/L，無(wú)菌水，溴化乙錠溶液由上海捷易生物科技有限公司提供。213實(shí)驗(yàn)儀器病理切片機(jī)（REICHERTHISTOSTATROTARYMIRCOTOME820）FUNGLYNFTC3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（加拿大楓嶺生物）；核酸蛋白測(cè)定儀（BIOTECH）；微量高速離心機(jī)（OHAUS）；米歐微孔板離心機(jī)（MINIP2500）；MIX3000混勻小精靈（杭州米歐儀器有限公司）；海爾冰箱（中國(guó)海爾）；EPPENDORFRESEARCHPLUS（德國(guó)艾本德公司）單孔槍，量程包含25UL、10UL、200UL、1ML；奧豪斯（OHAUS）的單孔槍，量程包含25UL、10UL、20UL、200UL、1ML；電動(dòng)單道移液器（THERMO）；EPPENDORF5415D離心機(jī)；研缽；22實(shí)驗(yàn)方法221激素性骨壞死模型建立SD大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射大腸桿菌內(nèi)毒素10G/KG體重一次；對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。腹腔注射完成后24H，實(shí)驗(yàn)組臀肌注射甲強(qiáng)龍40MG/KG體重3次，每天1次，兩次間隔24H；對(duì)照組每次臀肌注射等量5葡萄糖水。甲強(qiáng)龍肌注完成后24H，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射慶大霉素8萬(wàn)U一次，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。222大鼠股骨頭標(biāo)本取材骨壞死模型建立完畢后，常規(guī)飼養(yǎng)。在4周（記為A組）、8周（記為B組）和12周（記為C組）的時(shí)候?qū)?shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的大鼠各以頸椎脫位法處死10只，每次處死20只大鼠。切開(kāi)雙側(cè)髖關(guān)節(jié)囊，用醫(yī)用剪刀于股骨頭下方23MM處切斷股骨頸，獲得大鼠雙側(cè)股骨頭標(biāo)本，一側(cè)標(biāo)本使用5福爾馬林緩沖固定液固定，用于HE染色切片的制作；另一側(cè)標(biāo)本放置于凍存管中與80凍存，用于MIRNA210和NOTCH信號(hào)通路表達(dá)的檢測(cè)。223HE染色切片制作（1）取下的大鼠股骨頭標(biāo)本浸泡于5福爾馬林緩沖固定液中固定48小時(shí)后取出，在流水下沖洗至無(wú)福爾馬林殘留。（2）將股骨頭標(biāo)本至于EDTA10中性甲醛脫鈣液中脫鈣，每48小時(shí)更換一次脫鈣液，共脫鈣至大頭針可以輕松穿入股骨頭。（3）將股骨頭標(biāo)本從脫鈣液中取出，在流水下沖洗至無(wú)EDTA脫鈣液殘留，常規(guī)石蠟包埋，用切片機(jī)4M切片。（4）用二甲苯I和二甲苯II依次浸泡10MIN脫蠟，然后100、95、80和75濃度的乙醇依次浸泡5MIN洗脫二甲苯，最后用蒸餾水清洗35MIN取出，用吸水紙將蒸餾水吸干。（5）將切片放入蘇木精染液中染色5MIN，取出，流水洗去多余染液。（6）1鹽酸乙醇分化3S，流水沖洗約30S。（7）1稀氨水反藍(lán)30S，取出，流水沖洗10MIN，再用蒸餾水過(guò)洗3S。（8）將切片放入酒精伊紅染液中染色3MIN，取出，用蒸餾水洗去多余染液。（9）再脫水依次用80、95、95、100、100乙醇浸泡5MIN脫水。（10）透明化依次用二甲苯石碳酸（31）、二甲苯I和二甲苯II浸泡5MIN。（11）中性樹(shù)脂封片，光鏡下觀察切片。224信號(hào)通路表達(dá)檢測(cè)QPCR檢測(cè)方法（1）RNA抽提I、大鼠股骨頭樣本的處理。（1）將干凈的研缽和杵用液氮預(yù)冷，大鼠股骨樣本用液氮預(yù)冷。（2）將大鼠股骨樣本置于研缽中，加液氮沒(méi)過(guò)樣本。用杵輕搗樣本，至樣本碎裂，研磨成粉末。過(guò)程中不斷補(bǔ)充液氮，始終沒(méi)過(guò)樣本。（3）將樣本粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)先加過(guò)1MLTRIREAGENT的15ML離心管中，混勻，20過(guò)夜。II、處理好的大鼠股骨樣本，用ZYMORESEARCH的DIRECTZOLRNAMINIPREP試劑盒進(jìn)行抽提RNA。操作中離心步驟的離心速度可以為10,00016,000XG。（1）將樣本TRIREAGENT的混合液從20取出，室溫放置10MIN。（2）混合液12,000XG離心1MIN，將上清轉(zhuǎn)移到去RNA酶的離心管中；（3）在處理過(guò)的樣品中加入相同體積的乙醇95100（11），渦旋混勻，將混合液加到ZYMOSPINIICCOLUMN，然后放到收集管上，離心1MIN，轉(zhuǎn)移柱子到新的收集管上，丟棄原來(lái)的收集管；（4）在ZYMOSPINIICCOLUMN中加入400UL的RNA預(yù)洗脫液（DIRECTZOLRNAPREWASH），離心1MIN，丟棄收集管中液體，重復(fù)這個(gè)步驟，在柱中加入700UL的RNA洗脫液（RNAWASHBUFFER），離心1MIN，丟棄收集管中液體，為了確保完全的清除洗脫液，將柱子再離心2MIN。仔細(xì)的將柱子轉(zhuǎn)移到去RNA酶的離心管上；（5）在柱子中直接加入30UL的DNASE/RNASEFREEWATER，最大離心速度離心1MIN，純化的RNA可以立即使用或者儲(chǔ)存在70。（二）引物設(shè)計(jì)引物共計(jì)8種13個(gè)（由上海捷易生物科技有限公司委托設(shè)計(jì)，見(jiàn)下表格），先將引物干粉離心數(shù)秒，按照說(shuō)明加入適量RNASEFREEH2O，引物工作液濃度10M；GENENAMEPRIMERSEQUENCE5TO3AMPLICONSIZEBPU6FCTCGCTTCGGCAGCACAU6RAACGCTTCACGAATTTGCGT95RNOMIR2103PRTGAGTAGACCAATGGGTTCATTTCTGGGTCTTATTCTATTCCATTGGTCTACTCTCAGCCRNOMIR2103PFCGCTGTGCGTGTGACAGCRNOMIR2103PRTGGGTTCATTTCTGGGTCTT66注U6RT引物就為反向定量引物。（三）PCR步驟方法（1）、將RNA模板和5ALLINONERTMASTERMIX放置于冰上；（2）、在冰上準(zhǔn)備反應(yīng)液RT組分加入體積（UL）5ALLINONERTMASTERMIX4RNATEMPLATEVARIABLENUCLEASEFREEH2OUPTO20（3）、反應(yīng)液混合均勻，短暫離心后，25孵育10MIN；（4）、42逆轉(zhuǎn)錄50MIN；（5）、85滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5MIN，得到的CDNA于20保存，使用時(shí)稀釋到工作濃度10NG/UL。（6）PCR體系20LPCR反應(yīng)組分每個(gè)體系加入量LKAPASYBRFASTQPCRMASTERMIX210上游引物FP（10UM）04下游引物RP（10UM）04CDNA10NG/L2RNASEFREEH2O72（7）PCR反應(yīng)程序TEMPERATURETIMECYCLE95PREDEGENERATION3MIN195（DENATURE）5S40GENENAMEPRIMERSEQUENCE5TO3AMPLICONSIZEBPGAPDHFACTTTGGCATCGTGGAAGGGGAPDHRTGCAGGGATGATGTTCTGGG128NOTCH1FGCTTGCAGTAGCAAGGAAGCNOTCH1RGCATGCTTGAGCTGTCCAAC91HES1FGCACAGAAAGTCATCAAAGCCTHES1RTGCCGGGAGCTATCTTTCTT117RBPJFCACTCCCAAGACTGATAATTAGGAARBPJRGGACATGGAGTGGCCTGAAA16960（PRIMERANNEALING，EXTENSION）20S7230S9490S603MINMELTING（熔解曲線）9410S1（8）配制2的AGAROSE凝膠取06GAGAROSE放入三角燒瓶中，加入30MLTAE溶液，微波爐中加熱至完全溶解，冷卻至50時(shí)加入溴化乙錠溶液（10MG/ML）15ML，終濃度為05G/ML。澆板，水平放置，帶冷卻至室溫（約30MIN）。（9）上樣電泳取10LPCR樣品上樣電泳，另取1LPEGM3ZFHAEIIIMARKERS05G/L作為DNA片段大小對(duì)照。75V電壓下電泳，紫外燈下觀察條帶分布。23數(shù)據(jù)處理本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件處理，計(jì)算各個(gè)數(shù)據(jù)的95可信區(qū)間以及同組數(shù)據(jù)之間的T檢驗(yàn)P值、R值。其中P值以005作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，R值以08作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果31大體標(biāo)本最終大鼠死亡三只，取得股骨頭標(biāo)本572114個(gè)。取得的股骨頭大體標(biāo)本如圖311及312所示，所有的股骨頭標(biāo)本形態(tài)均較為規(guī)整，未見(jiàn)明顯的塌陷發(fā)生。圖311手術(shù)區(qū)大鼠股骨頭標(biāo)本。在髖部切開(kāi)肌肉和關(guān)節(jié)囊，紅圈處即為大鼠股骨頭。圖312取下的大鼠股骨頭標(biāo)本。箭頭所指為切斷的股骨頭韌帶（圓韌帶）。32HE切片結(jié)果321A組（4周）結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組切片中均未見(jiàn)明顯骨壞死表現(xiàn)，3個(gè)隨機(jī)視野中空骨陷凹率均50，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均未發(fā)生骨壞死。圖321A和B分別為對(duì)照組在低倍鏡和高倍鏡下的視野，可見(jiàn)骨陷凹中基本都有骨細(xì)胞填充，骨小梁結(jié)構(gòu)正常。C和D分別為實(shí)驗(yàn)組在低倍鏡和高倍鏡下的視野，可見(jiàn)結(jié)果與對(duì)照組相似，偶爾可見(jiàn)散在的空骨陷凹（箭頭所示），沒(méi)有實(shí)際意義。322B組（8周）結(jié)果對(duì)照組結(jié)果與A組相似，3個(gè)隨機(jī)視野中空骨陷凹率均50，可認(rèn)為對(duì)照組組未發(fā)生骨壞死；實(shí)驗(yàn)組多個(gè)視野中均可見(jiàn)骨細(xì)胞缺失，空骨陷凹率50，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組有較為明顯的骨壞死發(fā)生。圖322A和B分別為對(duì)照組在低倍鏡和高倍鏡下的視野，可見(jiàn)骨陷凹中基本都有骨細(xì)胞填充，骨小梁結(jié)構(gòu)正常。C和D分別為實(shí)驗(yàn)組在低倍鏡和高倍鏡下的視野，可見(jiàn)視野中骨細(xì)胞大片缺失，存在大量空骨陷凹（箭頭所示），散在的和聚集成團(tuán)的均可見(jiàn)，骨小梁結(jié)構(gòu)不良。323C組（12周）結(jié)果對(duì)照組結(jié)果與A組相似，3個(gè)隨機(jī)視野中空骨陷凹率均50，可認(rèn)為對(duì)照組組未發(fā)生骨壞死；實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組多個(gè)視野中均可見(jiàn)骨細(xì)胞缺失，空骨陷凹率50，但發(fā)生率較B組的實(shí)驗(yàn)組低，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組有骨壞死發(fā)生率較B組低，或已經(jīng)進(jìn)入骨壞死后期修復(fù)過(guò)程。圖323A和B分別為對(duì)照組在低倍鏡和高倍鏡下的視野，可見(jiàn)骨陷凹中基本都有骨細(xì)胞填充，骨小梁結(jié)構(gòu)正常。C和D分別為實(shí)驗(yàn)組在低倍鏡和高倍鏡下的視野，可見(jiàn)多數(shù)骨陷凹中存在骨細(xì)胞填充，但也有少數(shù)聚集成團(tuán)的空骨陷凹存在（箭頭所示），空骨陷凹率相比圖322中明顯減少。33NOTCH1受體染色切片結(jié)果331A組（4周）結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組切片中均未見(jiàn)到明顯的NOTCH1染色團(tuán)塊，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中NOTCH1受體均沒(méi)有明顯的表達(dá)。圖331A和B分別為對(duì)照組的陰性染色區(qū)和陽(yáng)性染色區(qū)，可見(jiàn)陽(yáng)性染色多位于軟骨下骨區(qū)域，呈散在分布（箭頭所示）。C和D為實(shí)驗(yàn)組的陰性染色區(qū)和陽(yáng)性染色區(qū)，可見(jiàn)染色與對(duì)照組相近，并無(wú)明顯差異。332B組（8周）結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組切片中均與A組相似，未見(jiàn)到明顯的NOTCH1染色團(tuán)塊，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中NOTCH1受體均沒(méi)有明顯的表達(dá)。圖332A和B分別為對(duì)照組的陰性染色區(qū)和陽(yáng)性染色區(qū)，可見(jiàn)陽(yáng)性染色多位于軟骨下骨區(qū)域，呈散在分布（箭頭所示）。C和D為實(shí)驗(yàn)組的陰性染色區(qū)和陽(yáng)性染色區(qū)，可見(jiàn)染色與對(duì)照組相近，并無(wú)明顯差異。333C組（12周）結(jié)果對(duì)照組與A組相似，未見(jiàn)到明顯的NOTCH1染色團(tuán)塊，可認(rèn)為對(duì)照組中NOTCH1受體沒(méi)有明顯的表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組中可見(jiàn)較為明顯的NOTCH1染色團(tuán)塊，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組中NOTCH1受體有明顯表達(dá)。圖333A和B分別為對(duì)照組的陰性染色區(qū)和陽(yáng)性染色區(qū)，可見(jiàn)陽(yáng)性染色多位于軟骨下骨區(qū)域，呈散在分布（箭頭所示）。C和D為實(shí)驗(yàn)組的陰性染色區(qū)和陽(yáng)性染色區(qū)，與對(duì)照組不同，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)大片成團(tuán)塊狀的陽(yáng)性染色區(qū)域（箭頭所示），對(duì)比度較為明顯。34MIRNA210表達(dá)檢測(cè)結(jié)果341A組（4周）結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間MIRNA210表達(dá)量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值005。圖341本圖為A組中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MIRNA210的表達(dá)量，T檢驗(yàn)P值為0233，大于005，故認(rèn)為兩組之間表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。342B組（8周）結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間MIRNA210表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，P值005。圖342本圖為B組中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MIRNA210的表達(dá)量，T檢驗(yàn)P值為0035，小于005，故認(rèn)為兩組之間表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。343C組（12周）結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間MIRNA210表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，P值005。圖342本圖為C組中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MIRNA210的表達(dá)量，T檢驗(yàn)P值為0020，小于005，故認(rèn)為兩組之間表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。35NOTCH信號(hào)通路表達(dá)檢測(cè)結(jié)果351A組（4周）結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間NOTCH信號(hào)通路表達(dá)量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值005。圖351本圖為A組中NOTCH1、HES1和RBPJK的表達(dá)量，T檢驗(yàn)P值分別為0065、0968和0223，均大于005，故認(rèn)為兩組之間表達(dá)量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。352B組（8周）結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間NOTCH信號(hào)通路表達(dá)量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值005。圖352本圖為B組中NOTCH1、HES1和RBPJK的表達(dá)量，T檢驗(yàn)P值分別為0202、0165和0632，均大于005，故認(rèn)為兩組之間表達(dá)量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。353C組（12周）結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間NOTCH信號(hào)通路表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，P值005。圖353本圖為C組中NOTCH1、HES1和RBPJK的表達(dá)量，T檢驗(yàn)P值分別為0003、0005和0004，均小于005，故認(rèn)為兩組之間表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。36相關(guān)性檢測(cè)361A組（4周）結(jié)果實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中MIRNA210表達(dá)量和NOTCH信號(hào)通路中各個(gè)組分表達(dá)量無(wú)明顯相關(guān)性（R08）。圖361本圖為A組中NOTCH1、HES1和RBPJK的表達(dá)量與MIRNA210的相關(guān)系數(shù)，R值分別為0314、0019和0081，均小于08，故認(rèn)為兩者之間不存在線性相關(guān)。362B組（8周）結(jié)果實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中MIRNA210表達(dá)量和NOTCH信號(hào)通路中各個(gè)組分表達(dá)量無(wú)明顯相關(guān)性（R08）。圖362本圖為B組中NOTCH1、HES1和RBPJK的表達(dá)量與MIRNA210的相關(guān)系數(shù)，R值分別為0328、0150和0026，均小于08，故認(rèn)為兩者之間不存在線性相關(guān)。363C組（12周）結(jié)果對(duì)照組中MIRNA210表達(dá)量和NOTCH信號(hào)通路中各個(gè)組分表達(dá)量無(wú)明顯相關(guān)性（R08）。實(shí)驗(yàn)組中NOTCH1以及HES1的表達(dá)量與MIRNA210有明顯相關(guān)性（R08）；RBPJK的表達(dá)量與MIRNA210無(wú)明顯相關(guān)性（R08）。圖362本圖為B組中NOTCH1、HES1和RBPJK的表達(dá)量與MIRNA210的相關(guān)系數(shù)，R值分別為0851、0879和0645，其中NOTCH1、HES1的R值大于08R，故認(rèn)為兩者之間存在線性相關(guān)；RBPJK的R值小于08，故認(rèn)為兩者之間不存在線性相關(guān)。討論激素性骨壞死是骨科臨床重要疾病之一，探索骨壞死修復(fù)機(jī)制無(wú)疑能對(duì)臨床骨壞死的治療起到至關(guān)重要的推動(dòng)作用。盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)于骨壞死的修復(fù)已經(jīng)不乏研究，但是對(duì)于修復(fù)的機(jī)制各個(gè)研究各執(zhí)一詞，也仍然沒(méi)有統(tǒng)一的理論能夠完整說(shuō)明修復(fù)的病理生理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)LPS加強(qiáng)應(yīng)急狀態(tài)后肌注甲強(qiáng)龍建立大鼠激素性骨壞死模型，取不同時(shí)間段的股骨頭標(biāo)本檢測(cè)骨壞死率、MIRNA210及NOTCH通路的表達(dá)量，試圖明確MIRNA210和NOTCH在骨壞死不同階段中的表達(dá)規(guī)律以及它們的表達(dá)與骨壞死發(fā)生和修復(fù)的關(guān)系，提供骨壞死修復(fù)的一種可能的病理機(jī)制。在初期的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，我們從血管新生相關(guān)的MIRNA中篩選了數(shù)個(gè)與骨壞死的修復(fù)機(jī)制可能有關(guān)聯(lián)的種類，包括MIRNA92A，MIRNA100，MIRNA210等3233，其中作為低氧應(yīng)急反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)控基因的MIRNA210最終被選為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。預(yù)期結(jié)果中，我們認(rèn)為骨壞死在某種意義上是一個(gè)自限性的疾病，其最終結(jié)局無(wú)非兩種自我修復(fù)，或者完全壞死導(dǎo)致股骨頭塌陷。而在不同時(shí)間點(diǎn)取得的股骨頭大體標(biāo)本上，我們均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任一標(biāo)本發(fā)生股骨頭塌陷的表現(xiàn)，因此我們預(yù)測(cè)在本次實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷墓菈乃劳砥谥校瑧?yīng)該存在修復(fù)機(jī)制發(fā)生著作用，使疾病自限在某一階段，防止了股骨頭塌陷的產(chǎn)生。而從病理切片的HE染色上來(lái)看，以通常標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)三個(gè)視野中空骨陷凹率超過(guò)50作為骨壞死發(fā)生的標(biāo)志。在實(shí)驗(yàn)早期（A組）中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均沒(méi)有或極少發(fā)現(xiàn)符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本（見(jiàn)圖321），即使偶爾能在實(shí)驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)個(gè)別空的骨陷凹，也并沒(méi)有什么意義。我們猜想在4周的時(shí)間點(diǎn)，骨壞死尚未發(fā)生，或者已經(jīng)發(fā)生早期骨壞死但仍然沒(méi)有產(chǎn)生明顯的骨細(xì)胞缺失，故而沒(méi)有觀察到足夠的空骨陷凹率。而在實(shí)驗(yàn)中期（B組），如同預(yù)期結(jié)果實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的HE切片中產(chǎn)生了較為明顯的差異，對(duì)照組同早期一樣未見(jiàn)明顯的骨壞死跡象，但實(shí)驗(yàn)組中可見(jiàn)到大量的空骨陷凹存在，分布范圍較廣，散在的空骨陷凹和聚集成塊的空骨陷凹均可在切片中發(fā)現(xiàn)，骨壞死的現(xiàn)象十分顯著（見(jiàn)圖322），因此可認(rèn)為在8周的時(shí)候，骨壞死已經(jīng)明顯發(fā)生，骨小梁中骨細(xì)胞死亡后脫失，產(chǎn)生視野中大量的空骨陷凹，依據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，這個(gè)時(shí)間點(diǎn)可作為骨壞死的高發(fā)階段，若沒(méi)有自限性機(jī)制，接下來(lái)應(yīng)該會(huì)導(dǎo)致所有骨細(xì)胞死亡，股骨頭失去承重能力而發(fā)生塌陷?？墒窃趯?shí)驗(yàn)后期（C組）的切片中，我們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)骨壞死有進(jìn)一步的發(fā)展，盡管對(duì)照組依舊如同之前的切片一樣沒(méi)有明顯的骨壞死跡象，但實(shí)驗(yàn)組的切片中我們卻沒(méi)有看見(jiàn)如同8周時(shí)一樣大量的空骨陷凹（見(jiàn)圖323），雖然與對(duì)照組對(duì)比就可以發(fā)現(xiàn)，骨壞死的現(xiàn)象依舊存在，不過(guò)空骨陷凹的出現(xiàn)率比起8周的切片中要明顯減少，而且值得注意的一點(diǎn)，這些空骨陷凹多為聚集在某一區(qū)域的，而并非散在分布，就如同周圍的部分重新生成了骨細(xì)胞填充骨陷凹，而這一部分還尚未修復(fù)一樣，為何會(huì)產(chǎn)生這樣的現(xiàn)象，我們沒(méi)有在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到相關(guān)的文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)中也沒(méi)有相應(yīng)的部分，故而目前未能給出解答，期望在以后的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中能得到響應(yīng)的結(jié)果。綜合以上HE切片的結(jié)果，對(duì)此我們猜測(cè)在8至12周的這段時(shí)間內(nèi)，有某種修復(fù)機(jī)制發(fā)揮了作用，抑制的骨細(xì)胞的死亡發(fā)生，進(jìn)一步促進(jìn)了成骨分化，產(chǎn)生了新的骨細(xì)胞