1、臨床基因組學(xué)第七章Sanger測序及高通量測序技術(shù),主要內(nèi)容,第一節(jié) 核酸測序技術(shù)的發(fā)展 第二節(jié) Sanger測序技術(shù) 第三節(jié) 高通量測序技術(shù)及其應(yīng)用,第三節(jié) 高通量測序技術(shù)及其應(yīng)用重點,高通量測序的發(fā)展,二代測序的基本原理及操作流程,三代測序的基本原理,高通量測序的臨床應(yīng)用,高通量測序的發(fā)展,人類基因組約含4萬到10萬個基因，由約30億個堿基對組成，分布在細(xì)胞核的23對染色體中。 1990年，被譽為生命“登月計劃”的國際人類基因組計劃啟動。 1999年9月，中國加入這一研究計劃，負(fù)責(zé)測定人類基因組全部序列的1。 2003年完成，比預(yù)計提前2年。 六國（美、日、英、法、德、中）科學(xué)家歷經(jīng)了13

2、年花費了27億美元才完成的草圖。,盡管第一代測序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測序方法。,優(yōu)勢：能同時對無數(shù)條DNA分子進(jìn)行序列測定，效率極高 技術(shù)特點：每次測很短的片段（讀長較短），但是可以通過超大量的平行測序，獲得大量的序列。,“下一代”測序技術(shù) Next-generation sequencing , NGS,高通量測序的常用名詞,高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing，HTS）是對傳統(tǒng)Sanger測序（稱為一代測序技術(shù)）革命性的改變, 一次對幾十萬到幾百萬條核酸分

3、子進(jìn)行序列測定, 因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS )足見其劃時代的改變, 同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能, 所以又被稱為深度測序(Deep sequencing) 基因組重測序（Genome Re-sequencing） 是對基因組序列已知的個體進(jìn)行基因組測序，并在個體或群體水平上進(jìn)行差異性分析的方法。,de novo測序 也稱為從頭測序：其不需要任何現(xiàn)有的序列資料就可以對某個物種進(jìn)行測序，利用生物信息學(xué)分析手段對序列進(jìn)行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。 外顯子測序（whole

4、exon sequencing） 指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測序的基因組分析方法。 Reads 又稱讀長，高通量測序中一個反應(yīng)獲得的測序序列或測序出來的一條條序列 。 測序深度 是指測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。假設(shè)一個基因大小為2M，測序深度為10X，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M。 覆蓋度 是指測序獲得的序列占整個基因組的比例。,Contig 拼接軟件基于reads之間的overlap區(qū)，拼接獲得的序列稱為Contig（重疊群）。 Scaffold 基因組de novo測序，通過reads拼接獲得Contigs后，往往還需要構(gòu)建454 Pai

5、red-end庫或Illumina Mate-pair庫，以獲得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）兩端的序列。基于這些序列，可以確定一些Contig之間的順序關(guān)系，這些先后順序已知的Contigs組成Scaffold。,高通量測序平臺,Life Ion PGM; Ion proton,Illumina MiSeq,NextSeq 500,Roche 454 Genome Sequencer FLX,Roche 454 Genome Sequencer,GS FLX GS Junior System,GS FLX的基本原理,文庫構(gòu)建,擴增測序模板,焦磷酸測序,數(shù)據(jù)分析,樣本,文

6、庫構(gòu)建,擴增測序模板,焦磷酸測序,數(shù)據(jù)分析,樣本,(DNA)n + dNTP,polymerase,(DNA)n +1 +PPi,Sulfurylase,ATP APS+PPi,ATP + luciferin oxyluciferin,Lucifetase,dNTP,Apyrase,dNDP + dNMP + phosphate,ATP,Apyrase,ADP + AMP + phosphate,文庫構(gòu)建,擴增測序模板,焦磷酸測序,數(shù)據(jù)分析,樣本,序列是什么呢？,CGTAAGGTGATGTATAGGGG.,Life Technology Ion平臺,Ion PGM 系統(tǒng),Ion Proton系

7、統(tǒng),Ion S5 系統(tǒng),Ion Chef 系統(tǒng),Ion torrent PGM的基本原理,Prepare Library,Clonal Amplification,DNA / RNA,Data Analysis,Library Preparation,DNA Sequencing*,Isolate Positive Ion Sphere Particles,Data Analysis,Load Chip and Sequence,Template Preparation*,Sequencing: Flows,Ion Sphere -Primer- A G T C A A G C G T C C

8、 C A T G,Sequence of Interest,Key Sequence,Flows 1-4,9-12,Flows 5-8, etc.,Flows 1-4,.-Ion Sphere Particle,A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step The flow order repeats with pattern: TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC,A “cycle” is f

9、our consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle,A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step The flow order repeats with pattern: TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC,Sequencing: Flows,Ion Sphere -Primer- A G T C A A G C G T C

10、C C A T G,Sequence of Interest,Key Sequence,Flows 1-4,9-12,Flows 5-8, etc.,Flows 5-8,.-Ion Sphere Particle,A “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle,Ion Sphere -Primer- A G T C A A G C G T C C C A T G,Sequence of Interest,Key Sequence,Flows 1-4,9-12,Flows 5-8, etc.,Fl

11、ows 9+,.-Ion Sphere Particle,A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step The flow order repeats with pattern: TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC,A “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle,Sequencing: Flows

12、,Ion Sphere -Primer- A G T C A A G C G T C C C A T G,Sequence of Interest,Key Sequence,Flows 1-4,9-12,Flows 5-8, etc.,And so on,.-Ion Sphere Particle,A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step The flow order repeats with pattern: TAC

13、GTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC,A “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle,Sequencing: Flows,大家知道接下來的序列是什么嗎?,AATCTTCTGAATTTCTGCAACTGTG,例一：阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease, AD）,是老年癡呆中最常見的一種 漸進(jìn)性的神經(jīng)功能退化 整體認(rèn)知能力的下降 早發(fā)性AD主要是由-淀粉樣前體蛋白(APP)基因和早老素基因突變引起， 與晚發(fā)性AD發(fā)病明顯相關(guān)的只有載脂蛋白E-4(APOE-4)等位基

14、因 對與AD關(guān)聯(lián)的4個基因(APOE+ APP+ PSEN1+PSEN2)進(jìn)行全基因測序，有助于發(fā)現(xiàn)更多的AD患者的遺傳變異。,阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD) 通過Ion-Torrent-PGM技術(shù)，對PSEN1、PSEN2、APP、APOE基因的外顯子區(qū)（編碼區(qū)）序列進(jìn)行直接測序，與參考序列進(jìn)行比較，從而發(fā)現(xiàn)可能存在的基因突變。,早發(fā)性AD的家系,舉例:AD相關(guān)基因NGS測序,PSEN1基因突變 早發(fā)型AD 常顯遺傳,Illumina 平臺,Illumina Miseq的基本原理,測序的時候，測序引物匹配于模板，反應(yīng)體系里加入4種不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的Fl-NTPs，

15、整合到新合成鏈的Fl-NTPs會發(fā)出相應(yīng)的熒光，并被相機拍下，終止反應(yīng)，將熒光基團(tuán)切除即可進(jìn)入下一輪合成過程。如此往復(fù)直到測完設(shè)定的循環(huán)數(shù)。,MiSeq Control Software 圖片處理 Base calling 質(zhì)量評分,MiSeq Reporter 數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)化 比對序列到參考序列 得到變異信息,質(zhì)量Q30的數(shù)據(jù)達(dá)到95%以上,測序照片,二、數(shù)據(jù)分析,NextSeq 500特色Two Channel SBS,GGT, ATT, CAA, GCA,TCA, ATG, CGT, GGC,（A/T;A/C）,帕金森?。≒arkinsons disease，PD）,是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變

16、性疾病， 老年人多見，平均發(fā)病年齡為60歲左右，40歲以下起病的青年帕金森病較少見。 最主要的病理改變:中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，由此而引起紋狀體DA含量顯著性減少而致病。 癥狀體征不對稱、靜止性震顫、對左旋多巴制劑治療敏感多提示原發(fā)性帕金森病。,各測序技術(shù)的比較,數(shù)據(jù)來源：Liu JT, et al. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:871272.,第三代測序,基于單個分子信號檢測的DNA測序被稱為單分子測序 (single molecule sequencing, SMS)，或第三代測序 (third generation sequencing, TG

17、S)。 主要包括Helicos的tSMS，PacBio的SMRT，Oxford的Nanopore 。,tSMS（ture single molecule sequencing ）,該技術(shù)的關(guān)鍵是采用高分辨率的相機直接讀取單分子熒光信號，不需要依賴PCR擴增以放大信號。 首先將待測核酸樣本隨機打斷成小片段，在每個小片段的末端加上poly-dA； 再將小片段DNA模板與固定在檢測芯片上的poly-dT引物進(jìn)行雜交并精確定位，并逐一加入經(jīng)過熒光物質(zhì)修飾的dNTP。 tSMS技術(shù)使用的dNTP也是僅能摻入新合成鏈而不能直接作為下一個dNTP分子摻入新鏈的3端，必須將其熒光基團(tuán)切除之后才可允許下一個dN

18、TP分子的摻入。 在dNTP摻入新鏈成像之后，切除熒光基團(tuán)，加帽，允許下一個核苷酸的摻入。,tSMS（ture single molecule sequencing ）,SMRT（single molecule Real-Time）sequencing,該方法采用四色熒光標(biāo)記的dNTP和被稱為零級波導(dǎo) (zero-mode waveguides, ZMW) 的納米結(jié)構(gòu)對單個DNA分子進(jìn)行測序。當(dāng)DNA合成進(jìn)行時，連接上的dNTP由于在ZMW底部停留的時間較長 (約200ms)，其熒光信號能夠與本底噪音區(qū)分開來，從而被識別。熒光基團(tuán)被連接在dNTP的磷酸基團(tuán)上，因此在延伸下一個堿基時，上一個dNTP的熒光基團(tuán)被切除，從而保證了檢測的連續(xù)性，提高了檢測速度。,Nanopore,當(dāng)單鏈DNA或RNA分子通過納米級的小孔時，由于堿基形狀大小不同，引起孔內(nèi)電阻變化，在小孔兩端保持一個恒定的電壓，則能夠檢測到通過小孔的電流變化情況，通過測到這些特征電流，就能夠識別出通過小孔的DNA分子上