1、上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄1四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學1第十五章第十五章 吸光光度法吸光光度法上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄2四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學15.1概述概述 利用溶液顏色的深淺來測定溶液中有色利用溶液顏色的深淺來測定溶液中有色物質的濃度，這種測定方法稱為比色法。物質的濃度，這種測定方法稱為比色法。 用儀器測定溶液對特定波長光吸收程度用儀器測定溶液對特定波長光吸收程度, ,以此確定溶液濃度的方法稱為吸光光度法。以此確定溶液濃度的方法稱為吸光光度法。吸光光度法吸光光度法紫外吸光光度法紫外吸光光度法紅外吸光光度法紅外吸光光度法可見吸光光度法可見吸光光度法上一頁上一頁下一頁下一

2、頁主目錄主目錄3四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學化學分析化學分析：常量組分：常量組分(1%), Er 0.1%0.2% 依據化學反應依據化學反應, 使用玻璃儀器使用玻璃儀器 化學分析與儀器分析方法比較化學分析與儀器分析方法比較儀器分析儀器分析：微量組分：微量組分(1%), Er 1%5% 依據物理或物理化學性質依據物理或物理化學性質, 需要特殊的儀器需要特殊的儀器例例: 含含F(xiàn)e約約0.05%的樣品的樣品, 稱稱0.2g, 則則m(Fe)0.1mg重量法重量法 m(Fe2O3)0.14mg, 稱不準稱不準容量法容量法 V(K2Cr2O7)0.02mL, 測不準測不準光度法光度法 結果結果0.048%0

3、.052%, 滿足要求滿足要求準確度高準確度高靈敏度高靈敏度高上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄4四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學2. 準確度較高，相對誤差為準確度較高，相對誤差為2% 5%。3. 快速快速簡便簡便。4. 應用廣泛應用廣泛。一、光的基本性質一、光的基本性質 光具有波粒二象性，即波動性光具有波粒二象性，即波動性，粒子性粒子性.吸光光度法的特點：吸光光度法的特點：1. 靈敏度高，下限為靈敏度高，下限為10-5 10-6 molL-1。適。適 用于微量分析。用于微量分析。上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄5四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學三者間關系為：三者間關系為： c /粒子性：光是由光子組成

4、的，光子的能量粒子性：光是由光子組成的，光子的能量 （E）決定于光的頻率或波長：）決定于光的頻率或波長： chhE 描述其波動性的主要參數是：描述其波動性的主要參數是： 波長波長，頻率，頻率 ，光速光速 c上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄6四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學根據波長的不同，可分為：根據波長的不同，可分為： 紫外光區(qū)：紫外光區(qū)：10nm 400nm 可見光區(qū)：可見光區(qū)：400nm 750nm 紅外光區(qū)：紅外光區(qū)：750nm 1000m1m106m109nm 同一波長的光稱為同一波長的光稱為單色光單色光, ,不同波長組不同波長組成的光稱為成的光稱為復合光。復合光。上一頁上一頁下一頁下一頁

5、主目錄主目錄7四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學 白光（如日光）是復合光，由白光（如日光）是復合光，由400nm 750nm 混合而成?；旌隙伞?. 光的互補光的互補二、物質對光的選擇性吸收二、物質對光的選擇性吸收 兩種顏色的光按適當比例混合，也可形兩種顏色的光按適當比例混合，也可形成白光，這兩種顏色稱為成白光，這兩種顏色稱為互補色互補色。上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄8四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學白光白光綠藍綠藍藍綠藍綠黃綠黃綠黃黃橙橙紅紅紫紫藍藍對角線為互補色光對角線為互補色光 上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄9四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學2. 物質對光選擇性吸收物質對光選擇性吸收 當白光通過溶

6、液時，溶液吸收某些波當白光通過溶液時，溶液吸收某些波長的光，其余波長的光則透過。溶液呈現(xiàn)長的光，其余波長的光則透過。溶液呈現(xiàn)的顏色正是透過這部分的光。的顏色正是透過這部分的光。例例：KMnO4吸收吸收黃綠黃綠色光，因此色光，因此KMnO4溶溶 液呈現(xiàn)液呈現(xiàn)紫紫色。色。CuSO4吸收吸收黃黃色光而其溶液呈色光而其溶液呈藍藍色。色。各種物質對不同波長的光吸收程度不同各種物質對不同波長的光吸收程度不同.上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄10四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學三、吸收曲線三、吸收曲線 1. 透光率透光率T與吸光度與吸光度A 一束平行單色光照射溶液時，光部分被一束平行單色光照射溶液時，光部分被吸

7、收，部分透過溶液，部分被器皿反射。吸收，部分透過溶液，部分被器皿反射。 若入射光強度為若入射光強度為Io，吸收光的強度為，吸收光的強度為Ia ,透過光強度為透過光強度為It，反射光的強度為，反射光的強度為Ir，它們的，它們的關系是：關系是：Io = Ia + It + Ir上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄11四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學 吸光光度法中，采用同質同型比色皿，吸光光度法中，采用同質同型比色皿，反射相同而抵消反射相同而抵消: : Io = Ia + It 透過光強度透過光強度It與入射光強度與入射光強度Io之比稱為之比稱為透光度透光度或或透光率透光率。用用T 表示：表示：toITI上

8、一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄12四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學吸光度吸光度：toIITAlg1lg 光全部透過：光全部透過：Io= It ，A = 0， T = 100%若全部吸收：若全部吸收：It = 0 ， A = ， T = 0 2. 吸收曲線吸收曲線 將不同波長的光透過某一定的溶液，測將不同波長的光透過某一定的溶液，測定不同波長下溶液對光的吸光度。以吸光度定不同波長下溶液對光的吸光度。以吸光度對波長作圖可得一曲線，稱為吸收曲線。對波長作圖可得一曲線，稱為吸收曲線。上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄13四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學KMnO4溶液的吸收曲線溶液的吸收曲線400480560 6

9、40720 nm0.40.81.21.6ADCBA A、B、C、D代表代表不同濃度下的吸收曲線。不同濃度下的吸收曲線。 最大最大 = 525 nm動畫動畫上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄14四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學15.2 溶液對光的吸收定律溶液對光的吸收定律 實驗證明：若保持入射光的波長不變實驗證明：若保持入射光的波長不變,溶液對光吸收的程度與溶液對光吸收的程度與溶液的濃度溶液的濃度、液層液層厚度厚度有關。有關。一、朗伯一、朗伯-比爾比爾(Lambert-Beer)定律定律 1. 1.朗伯定律朗伯定律：當：當 、c、溫度、溫度 一定時，一定時，溶液的吸光度與液層的厚度成正比。溶液的吸光度

10、與液層的厚度成正比。(動畫動畫)上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄15四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學2. 比爾定律比爾定律：當當 、b 和溫度一定時，溶液和溫度一定時，溶液 的吸光度與溶液的濃度成正比。的吸光度與溶液的濃度成正比。(動畫動畫) 其數學表達式：其數學表達式：A = K2 c3. 光吸收定律（朗伯光吸收定律（朗伯比爾定律）比爾定律） 其數學表達式其數學表達式： A = Kcb 其數學表達式：其數學表達式： A = K1b K1：比例系數，：比例系數，與與 、c、溫度、溫度有關。有關。 b：溶液厚度：溶液厚度上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄16四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學 朗伯朗伯比爾定

11、律比爾定律：一束平行一束平行單色光單色光通過通過溶液，當溶液，當波長和溫度波長和溫度一定時，其吸光度與溶一定時，其吸光度與溶液的濃度和液層厚度成正比。液的濃度和液層厚度成正比。4. 吸光系數與摩爾吸光系數吸光系數與摩爾吸光系數 吸光系數吸光系數(a)：c用用gL-1表示，表示，b用用cm表表示時，示時，K用用a表示，表示， a稱為吸光系數，其量稱為吸光系數，其量綱為綱為Lg-1cm-1，朗伯，朗伯比爾定律為：比爾定律為：A = a b c上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄17四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學吸光度與光程的關系吸光度與光程的關系 A = bc 光源光源檢測器檢測器0.00吸光度吸光度檢

12、測器檢測器b樣品樣品光源光源0.22吸光度吸光度光源光源檢測器檢測器0.44吸光度吸光度b樣品樣品b樣品樣品上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄18四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學吸光度與濃度的關系吸光度與濃度的關系 A = bc 吸光度吸光度0.00光源光源檢測器檢測器 吸光度吸光度0.22光源光源檢測器檢測器b 吸光度吸光度0.42光源光源檢測器檢測器b上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄19四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學 摩爾吸光系數摩爾吸光系數:c用用molL-1表示，表示，b用用cm表示時，表示時，K用用表示，表示， 稱為摩爾吸光系稱為摩爾吸光系數，其量綱為數，其量綱為Lmol-1cm-1。則：。

13、則：A =b c當當 c = 1molL-1，b = 1cm 時時, A = 是有色物質在一定波長下的特征常數是有色物質在一定波長下的特征常數,用它衡量物質吸光的靈敏度。用它衡量物質吸光的靈敏度。值越大，吸值越大，吸收能力愈強，顯色反應愈靈敏。收能力愈強，顯色反應愈靈敏。上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄20四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學最大最大 5104 , 靈敏的顯色反應靈敏的顯色反應 在吸收曲線上，與最大吸收波長相對應的在吸收曲線上，與最大吸收波長相對應的摩爾吸光系數用摩爾吸光系數用最大最大 表示。表示。例：例：Fe2+濃度為濃度為500 gL-1的溶液，與鄰的溶液，與鄰二二氮氮菲反應菲反應

14、, 生成橙紅色配合物，在波生成橙紅色配合物，在波長長510nm,比色皿厚度為比色皿厚度為2cm時測得吸光度為時測得吸光度為0.19，計，計算三算三鄰鄰二二氮菲氮菲合合鐵鐵()在此波長在此波長的的 。上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄21四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學解：解： Fe 的原子量為的原子量為55.85 c(Fe2+) = 50010-6 / 55.85 = 8.9510-6 molL-1 根據根據 A =b c)cmmolL(101 . 11095. 8219. 01146 上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄22四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學因為因為cbTA 1lg 在吸光光度法中，在吸光光

15、度法中，b一定時，一定時，c與與A成正成正比，而不與比，而不與T 成正比。成正比。cA上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄23四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學吸光度吸光度A、透光率、透光率T與濃度與濃度c的關系的關系ATc-kbcT = 10A=kbc上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄24四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學二、二、對朗伯對朗伯- -比爾定律的偏離比爾定律的偏離 1. 物理因素物理因素 cA標準工作曲線圖標準工作曲線圖正誤差正誤差負誤差負誤差 單色光不純，導致負偏差單色光不純，導致負偏差.上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄25四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學散射光的影響，膠體、乳濁液或懸濁液由散射光的

16、影響，膠體、乳濁液或懸濁液由 于散射的作用使吸光度增大，或入射光不于散射的作用使吸光度增大，或入射光不 是垂直通過比色皿產生正偏差。是垂直通過比色皿產生正偏差。朗伯朗伯-比爾比爾 定律只適用于均勻體系。定律只適用于均勻體系。2. 化學因素：化學因素：吸光質點的相互作用，濃度較大時，產生吸光質點的相互作用，濃度較大時，產生 負偏差，負偏差， 朗伯朗伯-比爾定律只適合于稀溶液比爾定律只適合于稀溶液 (c 上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄43四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學(%)cc 0.20.40.60.81.002468T(2) T = 36.8%(A = 0.434)，相對誤差最小相對誤差最小。(

17、1) T在在65%20% (A= 0.2 0.7)范圍，相對范圍，相對 誤差較小。誤差較小。上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄44四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學2. 控制吸光度在適宜的范圍內控制吸光度在適宜的范圍內(A= 0.2 0.7). (1) 控制溶液濃度?？刂迫芤簼舛?。 (2) 選擇不同厚度的比色皿。選擇不同厚度的比色皿。15.5 比色分析和吸光度的測量比色分析和吸光度的測量 一、一、單一組分的測定單一組分的測定 1. 目視比色法目視比色法：用眼睛比較溶液顏色深：用眼睛比較溶液顏色深 淺以確定物質含量淺以確定物質含量.上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄45四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學系列標準

18、溶液系列標準溶液待測溶液待測溶液觀察方向觀察方向方便、靈敏，準確度差。常用于限界分析。方便、靈敏，準確度差。常用于限界分析。上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄46四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學目視比色法的優(yōu)點：目視比色法的優(yōu)點：1. 儀器簡單，操作簡便。儀器簡單，操作簡便。2. 膠體溶液也可進行測定。膠體溶液也可進行測定。3. 復合光復合光(白光白光)下進行測定，野外也可操作下進行測定，野外也可操作.目視比色法的缺點是：目視比色法的缺點是： 依靠人的眼睛來觀察顏色深淺，相對誤依靠人的眼睛來觀察顏色深淺，相對誤差較大，可達差較大，可達520%。 上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄47四川農業(yè)大學四

19、川農業(yè)大學 2. 吸光光度法吸光光度法 原理：原理：光電池產生光電流的大小與照射光電池產生光電流的大小與照射光的強度成正比。光的強度成正比。 當一束單色光通過一定厚度的溶液時，當一束單色光通過一定厚度的溶液時，溶液濃度越大，吸光度越大，透光度越小，溶液濃度越大，吸光度越大，透光度越小，光電流越小。光電流越小。 通過檢測光電流的大小來確定溶液的吸通過檢測光電流的大小來確定溶液的吸光度，根據朗伯光度，根據朗伯比爾定律得出其濃度比爾定律得出其濃度.上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄48四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學測量方法：測量方法：(1) 工作曲線法工作曲線法 步驟：步驟： 配制系列標準有色溶液配制系

20、列標準有色溶液 c1、c2 、 c3、c4、 c5 。測其吸光度，因為。測其吸光度，因為A=bc，以，以 A對對c 作圖得一直線，稱為標準工作曲線作圖得一直線，稱為標準工作曲線. 相同條件下測未知液的吸光度相同條件下測未知液的吸光度Ax. 在工作曲線圖上找到在工作曲線圖上找到Ax所對應的濃度所對應的濃度cx.上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄49四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學Axcxc濃度的單位可以是濃度的單位可以是（ mg/mL ）或）或mol/L 0 1 2 3 4 mg/mlA。 。 。 。*0.80.60.40.20上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄50四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學(2) (

21、2) 標準比較法標準比較法 同條件下分別測定未知液與標準溶液的同條件下分別測定未知液與標準溶液的吸光度吸光度 Ax和和 A標標，根據朗伯，根據朗伯-比爾定律，應有比爾定律，應有下式：下式：xxcbA 標標標標cbA 標標標標ccAAxx/ 標標標標cAAcxx 上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄51四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學例例：以：以MnO4- 形式測定合金中的錳。溶解形式測定合金中的錳。溶解0.500g 合金并將錳全部氧化為合金并將錳全部氧化為MnO4- 后，后，將溶液稀釋至將溶液稀釋至500ml，用，用1cm比色皿在比色皿在525nm處測得該溶液的處測得該溶液的A=0.400; 而濃度為

22、而濃度為1.00 10-4 molL-1KMnO4溶液在相同條件下測溶液在相同條件下測A= 0.585。設。設KMnO4溶液在此范圍內服從溶液在此范圍內服從光的吸收定律光的吸收定律, 求合金中求合金中Mn的質量分數的質量分數.上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄52四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學解解：根據：根據標標標標cAAcxx )Lmol(1084.61000.1585.0400.0-154 xcsmMVcw1000)%Mn(MnMnOMnO44 上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄53四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學%376. 000376. 0 500. 010009 .545001084. 65

23、二、高含量組分測定二、高含量組分測定示差法示差法 1. 1. 原理原理 參比溶液參比溶液：濃度稍低的標準溶液濃度稍低的標準溶液 cs。上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄54四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學 用用cs 調節(jié)調節(jié)T%為為100（A = 0.00），若被），若被測溶液的濃度為測溶液的濃度為 cx ，測其，測其Ax。 ssbcA xxbcA A = Ax As = Ax=cb 結論：結論：兩溶液的吸光度差兩溶液的吸光度差A與濃度差與濃度差 c成正比。成正比。上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄55四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學2. 測定方法測定方法 (1) 工作曲線法工作曲線法 標準溶液標準溶液c

24、s、c1、c2c5。以。以cs作參比，作參比，調調A=0. 測測c1、c2c5的的A，A對對c作圖作圖. 同條件下測同條件下測Ax，從示差工作曲線中，從示差工作曲線中查出查出cx， cx = cx + cs上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄56四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學AcAxcx示差工作曲線示差工作曲線上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄57四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學(2) 比較法比較法 以以cs作參比，調作參比，調A = 0，測另一標準溶液，測另一標準溶液 c1 的的A1，再測未知液再測未知液 cx 的的Ax 。 11ccAAxx 11AAccxx xsxccc 11cbA xxcbA 上一

25、頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄58四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學 一、分光光度計的主要部件一、分光光度計的主要部件 1. 光源光源：應有足夠的發(fā)射強度而且穩(wěn)定，：應有足夠的發(fā)射強度而且穩(wěn)定，常用鎢燈或碘鎢燈。常用鎢燈或碘鎢燈。TA1lg T = 100% A = 0 T = 0 A = 15.6 分光光度計分光光度計上一頁上一頁下一頁下一頁主目錄主目錄59四川農業(yè)大學四川農業(yè)大學 2. 單色器單色器：分光系統(tǒng)，一般由狹縫、透鏡、：分光系統(tǒng)，一般由狹縫、透鏡、 分光元件組成，常用的分光元件分光元件組成，常用的分光元件 有棱鏡或光柵獲得單色光。有棱鏡或光柵獲得單色光。 3. 吸收池吸收池：又稱比色皿，厚度有：