1、實驗二 培養(yǎng)基制備和滅菌技術一、實驗目的1學習一般培養(yǎng)基的制備方法。2掌握高壓蒸汽滅菌技術，了解幾種常用的滅菌方法。二、實驗原理（一）培養(yǎng)基培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質，用人工的方法配制而成的一種基質。它是微生物的生活環(huán)境，各種微生物對養(yǎng)分和培養(yǎng)基的物理、化學要求條件不一樣，為了分離、培養(yǎng)、鑒定、保藏和研究不同種類的微生物，就應當根據它們的需要，配制合適的培養(yǎng)基。微生物在培養(yǎng)基上生長發(fā)育，必須在一定的最適酸堿度范圍才能表現(xiàn)出它們最好的生命活動力。不同的微生物對酸堿度的要求不同，因此，我們在配制培養(yǎng)基時，必須調節(jié)培養(yǎng)基的pH值。培養(yǎng)基的種類繁多，根據培養(yǎng)基的成分、物理性狀不同，

2、可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。1天然培養(yǎng)基:主要成分是復雜的天然有機物質配制而成，如馬鈴薯、玉米粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，這些復雜天然有機物質的成分不完全了解，每次所用的原料，其中各成分的數(shù)量也不恒定的天然有機物質配制成的培養(yǎng)基，如牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯、麥芽汁培養(yǎng)基。它適用于生產上大規(guī)模培養(yǎng)微生物。2合成培養(yǎng)基:合成培養(yǎng)基是用化學成分完全了解的純化合物藥品配制而成的培養(yǎng)基，也稱化學成分明確的培養(yǎng)基，例如高氏一號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基等。一般適用于在實驗室范圍內研究微生物的形態(tài)、代謝、分類鑒定、生物測定、菌種選育和遺傳分析等工作。3半合成

3、培養(yǎng)基:在以天然有機物作為微生物營養(yǎng)來源的同時，適當補充一些成分已知的化學藥品所配制的培養(yǎng)基叫半合成培養(yǎng)基。大多數(shù)微生物都能在此種培養(yǎng)基上生長，因此，應用廣泛，如馬鈴薯葡萄糖(蔗糖)培養(yǎng)基，大多數(shù)霉菌都生長良好。4固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑即為固體培養(yǎng)基，常用凝固劑有洋菜、明膠、硅膠，硅膠用于配制自養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基；對于其他多數(shù)微生物來講，洋菜最為合適，一般加入1.52.5%即可凝固成固體，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等。此培養(yǎng)基可供微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)、菌種保存等。5半固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑即配成為半固體培養(yǎng)基，如加入0.20.7%洋菜作為凝固劑。用來觀察細菌

4、運動特征、菌種鑒定、菌種保存和噬菌體的效價測定等。6液體培養(yǎng)基：不加任何凝固劑配好后成為液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。如糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基等。常用于大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵生產、遺傳學研究、生理代謝等基本理論的研究工作。根據培養(yǎng)基的特殊用途可分為基礎培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。(1)基礎培養(yǎng)基：含有一般細菌生長繁殖需要的基本營養(yǎng)物質，常用的基礎培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，也是作為某些特殊培養(yǎng)基的基礎成分。(2)加富培養(yǎng)基：是在基礎培養(yǎng)基中加入血、血清，動物、植物組織提取液，主要用于對培養(yǎng)某些微生物要求比較苛刻的營養(yǎng)。(3)選擇培養(yǎng)基 是根據某一類或某一種微生物的特殊營養(yǎng)要求或對一些物

5、理、化學條件的抗性而設計的培養(yǎng)基。一種是根據某些微生物對碳、氮源等營養(yǎng)的特殊要求所設計的選擇性培養(yǎng)基，就可以分離到能分解某些物質的微生物。如以纖維素作唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，可以分離到分解纖維素微生物；無氮培養(yǎng)基可以分離到固氮微生物。另一種是根據某些微生物對一些物理、化學因素的抗性而設計的培養(yǎng)基，最常用的是在培養(yǎng)基中加入某些化學物質，以抑制不需要的微生物的生長繁殖。如在分離放線菌時，在培養(yǎng)基中添加10%的酚或鏈霉素數(shù)滴可抑制細菌和霉菌的生長，又如分離霉菌的馬丁氏（Martun）培養(yǎng)基。(4)鑒別培養(yǎng)基 是在基礎培養(yǎng)基中加入某種化合物或化學試劑，某種微生物在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，它所產生的某種代謝

6、產物與某種化合物或化學試劑能發(fā)生某種明顯的特征性反應，根據這一特征性反應可以將某種微生物與其他種微生物區(qū)別開來，如糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基等。 （二）滅菌消毒與滅菌兩者有不同的概念。消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體而言，而不能殺死全部芽孢，因此，消毒只是一種常用的衛(wèi)生措施；滅菌則是指殺滅一切微生物的營養(yǎng)體、芽孢和孢子，因此，滅菌后的物品是無菌的。滅菌的方法很多，有加熱、過濾、照射和化學藥品等。1加熱法：又分干熱滅菌和濕熱滅菌兩種。(1)干熱滅菌：有火焰燒灼和熱空氣滅菌兩種?；鹧鏌茰缇m用于接種環(huán)、接種針和金屬用具（如鑷子）等，無菌操作時的試管口和瓶口也在火焰上短暫燒灼滅菌。我們

7、通常所說的干熱滅菌是在電熱干燥箱內滅菌，此法適用于玻璃器皿（如吸管和培養(yǎng)皿）等的滅菌，在熱空氣160170下保溫2小時進行滅菌。(2)濕熱滅菌：高壓蒸汽滅菌法。此法時將物品放在高壓蒸汽滅菌鍋內1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3保持1530分鐘進行滅菌，時間的長短可根據滅菌物品種類和數(shù)量的不同而有所變化，以到達徹底滅菌為目的。這種滅菌適用于培養(yǎng)基、工作服、橡皮物品等的滅菌。間歇滅菌法。有少數(shù)培養(yǎng)基例如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等用于干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌均會受到破壞，則必須用間歇滅菌法。此法是用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進行滅菌，將滅菌培養(yǎng)基放入滅菌器內，每天加熱100，30分

8、鐘，連續(xù)3天，第一天加熱后，其中的營養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物去出放37下培養(yǎng)1824小時，使其中的芽孢發(fā)育成營養(yǎng)體，第二天再加熱100，30分鐘，發(fā)育的營養(yǎng)體又被殺死，但可能仍有芽孢，故再重復一次，以達到徹底滅菌。煮沸消毒法。注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物學實驗室中煮沸消毒時間1015分鐘，人用注射器和手術器械在有條件的地方，一般均采用高壓蒸汽滅菌法或干熱滅菌法滅菌。表2-1 蛋白質含水量與凝固所需溫度的關系卵白蛋白含量/%30分鐘內凝固所需的溫度/505625748018809061450160170表2-2 滅菌鍋留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關系壓力數(shù)全部空氣排出時的溫度/2

9、/3空氣排出時的溫度/l/2空氣排出時的溫度/l/3空氣排出時的溫度/空氣全不排出時的溫度/MPaKg/cm2Ib/in20.030.070.100.140.170.210.350.701.051.401.752.1051015202530108.8115.6121_3126.2130.0l34.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121現(xiàn)在法定壓力單位已不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其換算關系為：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa。表2-3

10、干熱濕熱穿透力及滅菌效果比較溫度/時間/h透過布層的溫度/滅菌20層10層100層干熱130140濕熱105.343861017210170.5101不完全完全2.過濾除菌； 3.紫外線滅菌；4.化學藥品滅菌等 三、實驗用品(一) 器材 臺秤、三角瓶、試管、漏斗、電爐、搪瓷杯（鋁鍋）、試管架、玻璃棒、滴管、稱量紙、pH試紙、棉花、紗布、牛皮紙、棉線、滅菌鍋、干燥箱等。 (二) 試劑 NaCl、蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、K2HPO4、HCl、NaOH、洋菜(瓊脂)、葡萄糖、蔗糖、NaSO4、黃豆芽、馬鈴薯等。 四、實驗操作 1一般培養(yǎng)基的配制（1）稱量：按照培養(yǎng)基配方，稱取各種成分。（2）熔化

11、：在容器中先加入所需蒸餾水水量的一部分，依次將各成分加入，使全部溶解，最后補足水量。若用蛋白胨、牛肉膏等物質配制培養(yǎng)基時，需加熱溶解，并補足因蒸發(fā)而減少的水分。配制固體培養(yǎng)基時，先將上述配好的液體培養(yǎng)基加熱到快沸時，再將稱好的洋菜(瓊脂)加入，繼續(xù)加熱到瓊脂完全溶化，在加熱溶解過程中要不斷攪拌，以免洋菜(瓊脂)糊底，同時控制火力，防止培養(yǎng)基沸騰時外溢。（3）矯正pH值：初配制好的培養(yǎng)基，往往不能符合所需求的pH值，因此必須矯正，用精密pH試紙，以1NHCl或1N NaOH調節(jié)至所需要的pH值。（4）過濾：用濾紙、棉花或雙層紗布過濾。（5）分裝：根據不同的需要，可將制成的培養(yǎng)基分裝于三角瓶或試管

12、內，分裝時取玻璃漏斗一只，裝在漏斗架上，漏斗下連接橡皮管與一根玻璃管相接，橡皮管上夾一只彈簧夾，將培養(yǎng)基到入漏斗內，用左手拿空試管的中部，并將漏斗下玻璃管插入試管內，以右手拇指和食指開放彈簧夾，中指及無名指夾住玻璃管上端，使培養(yǎng)基流入管內。注意不要使培養(yǎng)基沾污上段管壁及管口，保持棉塞的干凈。分裝量根據試管大小和實際需要而定。制備試管斜面培養(yǎng)基時，每支的分裝量約為管高1/5左右為度，液體培養(yǎng)基分裝試管的量以管高的1/4左右為宜，三角瓶的分裝量，不宜超過三角瓶的一半。圖2-1 培養(yǎng)基的分裝 圖2-2 斜面的擺法（6）棉塞的制作與滅菌：棉塞要做的形狀、大小、松緊完全合適，緊貼管壁不留縫隙，正常的棉塞

13、，頭稍大些，約有2/5在外，3/5在試管內，塞好棉塞后，用牛皮紙包扎，置高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌。圖2-3 棉塞制作 (引自沈萍等，2001)（7）斜面培養(yǎng)基的制作：固體培養(yǎng)基經滅菌后，如果要做成斜面，則在取出試管后略為冷卻，而后放置桌上，管口端放在木條上或其他支持物上，使其傾斜，傾斜度以培養(yǎng)基正好形成斜面為準。（8）無菌試驗：培養(yǎng)基經滅菌后，必須先放進37恒溫箱內，經24小時后，若無微生物生長才能使用。 2滅菌 滅菌是微生物生產和實驗的基本操作技術，其方法很多。因滅菌對象及設備條件不同而適當選用。下面分別介紹幾種常用的滅菌方法。（1）干熱滅菌 這種滅菌法是利用熱空氣使物體升溫，而導致物體上所帶的

14、微生物由于干熱脫水而死亡。常用于空玻璃器皿、金屬用具等的滅菌，對于帶膠皮的物品、液體及固體培養(yǎng)基等不能使用此法滅菌。 使用步驟： 將要待滅菌的器皿（培養(yǎng)皿、吸管等）包扎好，放入恒溫干燥箱內。 接通電源，打開開關；將恒溫調節(jié)器調至160，當達到此溫度時，借助恒溫調節(jié)器的自動控制，保持恒溫兩小時。兩小時后，關掉電源，當溫度降至與室溫差不多時，打開箱門，去出滅菌物品。1.門拉手 2.箱門 3.觀察窗 4.風量調節(jié) 5.隔板 6.銘牌 7.密封圈 8.溫控 9.開關 10.指示燈圖2-4 恒溫干燥箱注意事項： 滅菌的器皿必須干燥，否則容易破裂。若沒有干燥需預熱烤干。 滅菌的溫度不能超過180，否則棉花

15、、報紙、牛皮紙要燒焦，甚至發(fā)生事故，所以在使用時，要隨時檢查溫度情況，以防自動恒溫調節(jié)器失靈。 滅菌后，假如溫度沒下降就打開箱門，冷空氣突然進入箱內，玻璃器皿就要破裂；同時，熱空氣沖出，有灼傷皮膚的可能。因此，必須在溫度降至與室溫差不多時方可開箱門。（2）高壓蒸汽滅菌 此種滅菌方法的原理是在一密閉容器內，煮沸時形成的蒸汽不能擴散到容器外面去，而堆積在密閉的容器內，使蒸汽壓力升高，隨著水的煮沸，溫度也就相應地增高。利用過熱的蒸汽來使細菌及其耐熱芽孢蛋白質凝固變性，以致失去生命力，從而達到徹底滅菌的效果。 高壓蒸汽滅菌是最有效的滅菌方法。一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3保持

16、1530分鐘進行滅菌，就可殺死一切微生物細胞及其芽孢或孢子。進行高壓蒸汽滅菌的儀器叫高壓蒸汽滅菌鍋。滅菌對象是培養(yǎng)基、玻璃器皿和各種不因高溫處理而變質的物品材料。但對一些不耐高溫、高壓的溶液或培養(yǎng)基不宜用此種方法。 鍋內加入適量的水，使水面與三腳擱架相平為宜。 打開滅菌鍋蓋，把要滅菌的材料裝入鍋內，注意不要放得太擠，以防礙蒸汽的流通，影響滅菌效果。 蓋好滅菌鍋鍋蓋，按對角線形式均勻擰緊鍋蓋上的螺栓，螺栓松緊一致，切勿漏氣。 打開排汽開關，以排除鍋內的冷空氣。 打開電源，排除冷空氣。水沸騰后，滅菌鍋內就逐漸充滿蒸汽，并將冷空氣排出，待冷空氣完全排盡后，關閉排汽閥。讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸

17、上升，當鍋內壓力升到所需壓力時?？刂茻嵩?，維持壓力至所需時間。本實驗用1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3保持1530分鐘。 滅菌所需時間到后，關閉熱源。 讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力降至“0”時，打開排汽開關。 打開滅菌鍋蓋，拿出已滅菌的物品及培養(yǎng)基。 將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37恒溫箱中培養(yǎng)24小時，經培養(yǎng)若無微生物生長，即可使用。 注意事項：如果壓力未降到“0”時，打開排汽閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養(yǎng)基由于內外壓力不平衡而沖出瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。圖2-5 立式滅菌鍋 （3） 間隙滅菌 有少數(shù)培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等，

18、用于干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌營養(yǎng)均會受到破壞，則必須用間歇滅菌法。此法是用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進行滅菌，將滅菌培養(yǎng)基放入滅菌器內，每天加熱100，30分鐘，連續(xù)3天，第一天加熱100，30分鐘后，其中的營養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物去出放37下培養(yǎng)1824小時，使其中的芽孢發(fā)育成營養(yǎng)體，第二天再加熱100，30分鐘，發(fā)育的營養(yǎng)體又被殺死，但可能仍有芽孢，故再重復一次，以達到徹底滅菌。 （4）紫外線滅菌 紫外線是一種很強殺菌劑，其波長在2000Å3000Å之間都具有殺菌作用，其中以2500Å2800Å者殺菌力最強。它的殺菌機理主要是因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成，

19、從而抑制了DNA的復制；另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成O，再使O2氧化成O3或使水H2O氧化生成H2O2,O3和H2O2均有殺菌作用。它的殺菌作用隨劑量的增加而增加，不同微生物對紫外線的敏感性是不同的。一般細菌經紫外線照射510分鐘，即可死亡。接種室和接種箱常紫外線燈光作空氣滅菌。由于紫外線穿透力不強，故一般只適用于物體表面和環(huán)境的滅菌。為了加強紫外線的滅菌效果，在開燈以前，可以在接種室內噴霧苯酚溶液。也可將室內的桌面和坐凳可用0.1%新潔爾滅溶液擦洗，然后再開紫外線燈光照射2050%分鐘（視接種室大小而定），以殺死空氣中各種微生物細胞及芽孢為原則，必要時，可做無菌檢查，以檢查滅菌效果。 （5）微孔濾膜過濾除菌(1)組裝、滅菌將0.22m孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊壓平，包裝滅菌后待