1、- 噬菌體及質(zhì)粒載體郭莧 2014212346噬菌體的一般生物學(xué)特性噬菌體的一般生物學(xué)特性 依賴于寄主細(xì)胞存活。脫離了寄主細(xì)胞后既不能生長也不能復(fù)制。 基本功能： 保護(hù)自己的核酸分子（DNA或RNA）免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞 將其核酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞 經(jīng)被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，從而能產(chǎn)生出大量的子代噬菌體顆粒。 使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代噬菌體顆粒噬菌體載體噬菌體載體1 1 噬菌體的分子生物學(xué)概述噬菌體的分子生物學(xué)概述2 2 噬菌體載體噬菌體載體1 1 噬菌體的分子生物學(xué)概述噬菌體的分子生物學(xué)概述 噬菌體顆粒中的噬菌體顆粒中的DNADNA是一線性雙鏈?zhǔn)且痪€性雙鏈DNAD

2、NA分分子，長子，長48 502bp48 502bp，兩端各有，兩端各有1212個堿基的個堿基的55凸出黏性末端是互補(bǔ)的。進(jìn)入細(xì)胞的凸出黏性末端是互補(bǔ)的。進(jìn)入細(xì)胞的DNADNA通過兩端的黏性末端環(huán)化。通過兩端的黏性末端環(huán)化。可用來構(gòu)建柯可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒。斯質(zhì)粒。 噬菌體上有些基因可被取代而不影響其噬菌體上有些基因可被取代而不影響其生活周期。生活周期。噬菌體基因組編碼基因區(qū)域噬菌體基因組編碼基因區(qū)域 左側(cè)區(qū)：自基因A到基因J，包括參與噬菌體頭部蛋白質(zhì)和尾部蛋白質(zhì)合成所需要的全部基因。 中間區(qū)：介于基因J與基因N之間，這個區(qū)又稱為非必要區(qū)。本區(qū)基因與保持噬菌斑形成能力無關(guān)，但包括了一些與重組有關(guān)

3、的基因（redA 和redB）。以及整合到大腸桿菌染色體中去的int基因。和把原噬菌體從寄主染色體上刪除出去的xis基因。 右側(cè)區(qū)：位于基因的右側(cè)，包括全部主要的調(diào)控成分，噬菌體復(fù)制基因（和）以及溶菌基因（和）注注 意意 噬菌體感染了寄主細(xì)胞之后，究竟是發(fā)生溶噬菌體感染了寄主細(xì)胞之后，究竟是發(fā)生溶菌反應(yīng)還是溶源反應(yīng)，這是由菌反應(yīng)還是溶源反應(yīng)，這是由cI基因基因和和cro基基因因編碼的蛋白質(zhì)，同編碼的蛋白質(zhì)，同噬菌體的兩個操縱基因噬菌體的兩個操縱基因（OL, OR)之間的相互作用來決定的。之間的相互作用來決定的。 如果這兩個操縱基因都已擺脫了阻遏狀態(tài)，如果這兩個操縱基因都已擺脫了阻遏狀態(tài)，那么噬

4、菌體便可以進(jìn)入溶菌周期，否則進(jìn)行那么噬菌體便可以進(jìn)入溶菌周期，否則進(jìn)行溶源周期。溶源周期。構(gòu)建構(gòu)建噬菌體載體的基本原理噬菌體載體的基本原理 野生型的噬菌體DNA，對大多數(shù)基因克隆中常用的核酸內(nèi)切酶都有過多的限制位點(diǎn)，通過消除一些多余的限制位點(diǎn)和切除非必要的區(qū)段，才可能將它改造成適用的克隆載體。 插入型載體插入型載體 替換型載體替換型載體噬菌體載體可分為：噬菌體載體可分為：插入型載體插入型載體 免疫功能失活的插入型載體免疫功能失活的插入型載體：載體基因組上存在一段免疫區(qū)，其中帶有一兩種核酸內(nèi)切限制酶的單切割位點(diǎn)。當(dāng)外源DNA插入到這種位點(diǎn)上時，就會使載體所具有的合成性阻遏物的功能遭受到破壞，而不

5、能進(jìn)入溶源周期。因此帶有外源DNA插入的重組體都只能形成清晰的噬菌斑，而沒有外源DNA插入的親本噬菌體就會形成渾濁的噬菌斑。-半乳糖苷酶失活的插入型載體 載體基因組中含有一個大腸桿菌的lac5區(qū)段，編碼著-半乳糖苷酶基因lacZ。由這種載體感染到的大腸桿菌lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal的培養(yǎng)基上就會形成藍(lán)色的噬菌斑。替換型載體替換型載體 噬菌體的中央部分有一個可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆載體。 中央可取代片段兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列。因此當(dāng)外源DNA插入時，一對克隆位點(diǎn)之間的DNA片段便會被置換掉，從而有效的提高了克隆外源DNA片段的能力。 噬菌體載體

6、的特點(diǎn)噬菌體載體的特點(diǎn)注意：注意：噬菌載體作為載體，其重組噬菌體噬菌載體作為載體，其重組噬菌體DNADNA大小只能：大小只能： 38kb 52kb。體外包裝：體外包裝：噬菌載體噬菌載體 + + 尾部蛋白尾部蛋白 + + 頭部蛋白頭部蛋白 噬菌體載體的改良噬菌體載體的改良 圍繞三個目的進(jìn)行： 設(shè)計可對重組體分子作正選擇的克隆載體， 構(gòu)建可方便的通過轉(zhuǎn)錄作用制備外源DNA插入序列之RNA探針的克隆載體 發(fā)展可使插入的真核cDNA與-半乳糖苷酶形成融合蛋白質(zhì)的克隆載體。質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒特點(diǎn) 染色質(zhì)外的雙鏈共價閉合環(huán)形DNA（covalently closed circuar DNA,cccDNA

7、）可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2-300kb之間，15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，15kb的大質(zhì)粒則不易提取。 能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子（autonomous replicon）。一般質(zhì)粒DNA復(fù)制的質(zhì)粒可隨宿主細(xì)胞分裂而傳給后代。 質(zhì)粒對宿主生存并不是必需的，某些質(zhì)粒攜帶的基因功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下生存。質(zhì)粒載體的種類質(zhì)粒載體的種類 在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)粒可以集多種有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點(diǎn)、抗生素耐藥性等。常用的人工質(zhì)粒運(yùn)載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環(huán)素基因(Tcr)和抗氨芐青霉素基因(Apr)，并含有27種限制性內(nèi)切酶的單一識別位點(diǎn)。質(zhì)粒載體的優(yōu)缺點(diǎn) 質(zhì)粒載體主要用于DNA分子的亞克隆，表達(dá)外源蛋白，DNA序列的測定和基因的體外重新構(gòu)建等。 1.與外源DNA重組操作簡便； 2.外源DNA在質(zhì)粒載體中相對較穩(wěn)定， 3.質(zhì)粒DNA的制備和純化方便，快速簡單，所以得到廣泛應(yīng)用。 缺點(diǎn)： 1.它容納外源DNA片段有限，通常最多為15kb左右，因?yàn)楫?dāng)質(zhì)粒大于15kb時，轉(zhuǎn)化效率明顯下降。理想的質(zhì)粒載體(1)分子量小、多拷貝、松弛控制型;(2)具有多種常用的限制性內(nèi)切