1、第五章培養(yǎng)基及設(shè)備的滅菌 第一節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法一、定義1,培養(yǎng)基滅菌的定義是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活水平的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體及其抱子,或從中將其除去.工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌,殺滅雜菌比除去雜菌更為常用.2,滅菌與消毒的區(qū)別滅菌:用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物,包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽抱和抱子消毒:用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器皿內(nèi)外的病源微生物.二、培養(yǎng)基滅菌的目的1,在發(fā)酵過(guò)程中夾雜其它雜菌造成的后果：生產(chǎn)菌和雜菌同時(shí)生長(zhǎng),生產(chǎn)菌喪失生產(chǎn)水平；在連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中,雜菌的生長(zhǎng)速度有時(shí)會(huì)比生產(chǎn)菌生長(zhǎng)得更快,結(jié)果使發(fā)酵罐中以雜菌為主；雜菌及其產(chǎn)生的物質(zhì),使提取精制發(fā)生困難雜菌會(huì)降

2、解目的產(chǎn)物；雜菌會(huì)污染最終產(chǎn)品,雜菌會(huì)污染最終產(chǎn)品；發(fā)酵時(shí)如污染噬菌體,可使生產(chǎn)菌發(fā)生溶菌現(xiàn)象.2,工業(yè)上具體舉措包括：(1)使用的培養(yǎng)基和設(shè)備須經(jīng)滅菌；(2)好氧培養(yǎng)中使用的空氣應(yīng)經(jīng)除菌處理；(3)設(shè)備應(yīng)嚴(yán)密,發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境；(4) 培養(yǎng)過(guò)程中參加的物料應(yīng)經(jīng)過(guò)滅菌；(5)使用無(wú)污染的純粹種子.3,培養(yǎng)基滅菌的目的殺滅培養(yǎng)基中的微生物,為后續(xù)發(fā)酵過(guò)程創(chuàng)造無(wú)菌的條件.4,培養(yǎng)基滅菌的要求(1)到達(dá)要求的無(wú)菌程度(10-3)(2)盡量減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞,在滅菌過(guò)程中,培養(yǎng)基組分的破壞,是由兩個(gè)根本類(lèi)型的反響引起的：培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)成分間的相互作用；對(duì)熱不穩(wěn)定的組分如氨基酸和維生素等的分解.5,

3、滅菌的方法(1)化學(xué)法化學(xué)藥品滅菌法(2)物理法干熱滅菌法濕熱滅菌法射線滅菌法6,濕熱滅菌的原理每一種微生物都有一定的最適生長(zhǎng)溫度范圍.當(dāng)微生物處于最低溫度以下時(shí),代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài).當(dāng)溫度超過(guò)最高限度時(shí),微生物細(xì)胞中的原生質(zhì)膠體和酶起了不 可逆的凝固變性,使微生物在很短時(shí)間內(nèi)死亡, 加熱滅菌即是根據(jù)微生物這一特性而進(jìn)行的.7,濕熱滅菌中的相關(guān)定義?殺死微生物的極限溫度稱為 致死溫度.在致死溫度下,殺死全部微生物所需的時(shí)間稱為致死時(shí)間；在致死溫度以上,溫度愈高,致死時(shí)間愈短.?微生物的熱阻：是指微生物在某一特定條件 (主要是溫度和加熱方式) 下的致死時(shí)間.相對(duì)熱阻是指某一微生物在某

4、條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死 時(shí)間的比值.各種微生物對(duì)濕熱的相對(duì)熱阻微生物 相對(duì)熱阻營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和酵母1.0細(xì)菌芽抱3 M06霉菌抱子210病毒和噬菌體158,濕熱滅菌的優(yōu)點(diǎn)?蒸汽來(lái)源容易,操作費(fèi)用低,本身無(wú)毒；?蒸汽有強(qiáng)的穿透力,滅菌易于徹底；?蒸汽有很大的潛熱；?操作方便,易治理.第二節(jié)濕熱滅菌的理論根底一,培養(yǎng)基濕熱滅菌需解決的工程問(wèn)題1,將培養(yǎng)基中的雜菌總數(shù) N0殺滅到可以接受的總數(shù) N (10-3),需要多高的溫度、多 長(zhǎng)的時(shí)間為合理.2,菌溫度和時(shí)間確實(shí)定取決于：(1)雜菌抱子的熱滅死動(dòng)力學(xué)(2)反響器的形式和操作方式(3)培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍二、微生

5、物的熱死滅動(dòng)力學(xué)方程實(shí)驗(yàn)證實(shí),微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的均相熱死滅動(dòng)力學(xué)符合化學(xué)反響的一級(jí)反響動(dòng)力學(xué),即:dN"dTN:任一時(shí)刻的活細(xì)菌濃度個(gè) /L t:時(shí)間minK:比熱死速率常數(shù)min-1取邊界條件t0=0, N=N q,對(duì)1積分得N Nq e Kt3fflaj營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞典型死亡速率的數(shù)據(jù) < 大腸桿窗>實(shí)驗(yàn)還證實(shí),細(xì)菌抱子的熱殺滅動(dòng)力學(xué)與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的有所不同.它表現(xiàn)為非對(duì)數(shù)的死亡動(dòng)力學(xué).這可能與抱子壁的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)有關(guān).但當(dāng)溫度超過(guò)120?C時(shí),熱阻極強(qiáng)的嗜熱脂肪芽抱桿菌抱子的熱殺滅動(dòng)力學(xué)也接近對(duì)數(shù)死亡動(dòng)力學(xué)即符合一級(jí)反響規(guī)律.三、溫度對(duì)K的影響微生物的熱死滅動(dòng)力學(xué)接近一級(jí)反響

6、動(dòng)力學(xué),它的比熱死滅速率常數(shù)K與滅菌溫度 T的關(guān)系可用阿累尼烏斯方程表征E/RTK A e4A :頻率因子min-1AE:活化能J/molR:通用氣體常數(shù)J/ mol.k從方程4可以看出：1活化能AE的大小對(duì)K值有重大影響.其它條件相同時(shí),AE越高,K越低,熱死速率越慢.2不同菌的抱子的熱死滅反響A E可能各不相同.對(duì)方程4兩邊取對(duì)數(shù),得方程5ln K RE ln A 5K是AE和T的函數(shù),K的對(duì)T的變化率與有關(guān),對(duì)方程5兩邊對(duì)T取導(dǎo)數(shù),得方 程6.由方程6可得出結(jié)論：反響的 AE越高,lnK對(duì)T的變化率越大,即 T的變化 對(duì)K的影響越大試驗(yàn)說(shuō)明, 細(xì)菌抱子熱死滅反響的 A E很高,而某些有效

7、成分熱破壞反響的AE較低見(jiàn)下表.將溫度提升到一定程度,會(huì)加速細(xì)菌抱子的死滅速度,縮短滅菌時(shí)間, 由于有效成分的 AE很低,溫度的提升只能稍微增大其破壞速度,但由于滅菌時(shí)間的顯著縮 短,有效成分的破壞反而減少.受熱物質(zhì)A E (J/mol)維生素B1296232維生素B1鹽酸鹽92048嗜熱脂肪芽抱桿菌抱子283257肉毒梭菌抱子343088317984X 4.184匕Kbs從 0.12 (AEbs =67000 X 4.184 (J/mol),維生素 105?CK高127?C,Kvb* 0：02(mirT1)；Min-1). 3DBi 的 AEvb=22000 是高到 0.06(min-1),

8、枯草桿菌抱子嗜熱脂肪芽抱桿菌抱子和維生素Bi的lnK-1/T圖嗜熱脂肪芽抱桿菌抱子死滅程度為N/No=1O-16時(shí),滅菌溫度對(duì)維生素B1破壞的影響火菌溫度C到達(dá)滅菌程度的時(shí)間min維生素B1的損失%10084399.9911075891207.6271300.851101400.10731500.0151第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)一、無(wú)菌的標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)微生物熱死滅方程, 要求滅菌后到達(dá)絕對(duì)無(wú)菌是很難做到的,也是不必要的.因此在工程設(shè)計(jì)中常取 N=10-3.二、分批滅菌1,分批滅菌的設(shè)計(jì)在發(fā)酵罐中進(jìn)行實(shí)罐滅菌,是典型的分批滅菌.全過(guò)程包括升溫、保溫、降溫三栩用:一0 L,. 上 -工 一 1.1_

9、、一 一 口 20 40 6030 100 120 140 160 18.205 220 24.263Bifl 分dNdT池子熱死亡的規(guī)律符合積分得(8)ln NN0 Kt8在分批滅菌過(guò)程中l(wèi)n學(xué)東：格 得喏ln中0 1n左ln等 9N1共Kht2 ti111n N2 A t3e E/RTdt 12K不是常數(shù),所以:t2由于升溫、冷卻階段 T是時(shí)間t的函數(shù), 式中Kh是保溫階段的抱子比熱死亡速度常數(shù)分批滅菌中幾種換熱方式的溫度-時(shí)間變化關(guān)系加熱或者冷 卻的型式溫度-時(shí)間變化關(guān)系直接蒸汽鼓泡T = Tot 1斗(1芋41間接加熱T=Th(1電加熱 T = Tq( J + cu )盤(pán)管冷卻Tcc

10、C 1 + p'at )hs又 Sa = MCpTo§ = MUA a To- Th產(chǎn),0 = " Th口_s 一 及P*WCp -tiA/wc'pT：介質(zhì)溫度(K); T.：介質(zhì)初溫(K); t:時(shí)間(min); h：蒸汽相對(duì)于介質(zhì)的熱 始(kJ/kg); s：蒸汽的重量流率(kg/min ); M ：介質(zhì)重量(kg); Cp：介質(zhì)比熱kJ/(kg.K);Th：熱源溫度(K); U :總傳熱系數(shù)kJ/ (m2.min.K) ; q：傳熱速率(kJ/min); Cp： 冷卻劑比熱；W:冷卻劑流率；Tco：冷卻劑溫度2,計(jì)算舉例(自學(xué))參見(jiàn)：?微生物工程工藝原

11、理?P226、倫世儀主編?生化工程?P13.3,保證間歇滅菌 成功的要素(1)內(nèi)部結(jié)構(gòu)合理(主要是無(wú)死角),焊縫及軸封裝置可靠,蛇管無(wú)穿孔現(xiàn)象(2)壓力穩(wěn)定的蒸汽發(fā)酵罐的接管圖4,培養(yǎng)基間歇滅菌過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題(1)溫度和壓力的關(guān)系(2)泡沫問(wèn)題(3)投料過(guò)程中,妹皮和豆餅粉等固形物在罐壁上殘留的問(wèn)題(4)滅菌結(jié)束后應(yīng)立即引入無(wú)菌空氣保壓、連續(xù)滅菌的設(shè)計(jì) 1 ,連續(xù)滅菌的流程(1)噴射加熱連續(xù)滅菌狙有時(shí)間典型的噴射加熱連續(xù)滅菌時(shí)的溫度和時(shí)間曲線圖(2)薄板換熱器連續(xù)滅菌薄板換熱器連續(xù)滅菌流程薄板換熱器連續(xù)滅菌時(shí)的溫度和時(shí)間曲線圖(3)噴淋冷卻連續(xù)滅菌7連酒塔連儂3放汽培養(yǎng)液 冷卻水幢淋冷用器

12、噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程2,連續(xù)滅菌設(shè)計(jì)及計(jì)算舉例(自學(xué))參見(jiàn)：?微生物工程工藝原理? P228,倫世儀主編?生化工程?P22.3,連續(xù)滅菌設(shè)備的結(jié)構(gòu)及計(jì)算(1)設(shè)備結(jié)構(gòu): 套管式連消塔口噴嘴式連消塔連消器噴射加熱器圖2-19噴射加熱器示意圖1 一嗜臂2一吸入口 3吸入室,一混合嗔膏5-混合段6一擴(kuò)大管薄板換熱器維持罐(2)連消塔計(jì)算(自學(xué))參見(jiàn)?發(fā)酵工程與設(shè)備? P53四、連續(xù)滅菌與間歇滅菌的比較 1,連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)- 保存較多的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量- 容易放大- 較易自動(dòng)限制；- 糖受蒸汽的影響較少；- 縮短滅菌周期；- 在某些情況下,可使發(fā)酵罐的腐蝕減少；- 發(fā)酵罐利用率高；- 蒸汽負(fù)荷均勻.缺點(diǎn)

13、- 設(shè)備比較復(fù)雜,投資較大.2,分批滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)- 設(shè)備投資較少- 染菌的危險(xiǎn)性較小- 人工操作較方便- 對(duì)培養(yǎng)基中固體物質(zhì)含量較多時(shí)更為適宜缺點(diǎn)-滅菌過(guò)程中蒸汽用量變化大, 造成鍋爐負(fù)荷波動(dòng)大,一般只限于中小型發(fā)酵裝置.五、影響滅菌的因素 (1)培養(yǎng)基成分對(duì)滅菌的影響油脂,糖類(lèi)及一定濃度的蛋白質(zhì)可增加微生物的耐熱性,另一些物質(zhì),如高濃度的鹽類(lèi),色素等可削弱其耐熱性.- 2)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對(duì)滅菌的影響- 3)培養(yǎng)基中微生物數(shù)量對(duì)滅菌的影響- 4)培養(yǎng)基中氫離子濃度對(duì)滅菌的影響培養(yǎng)基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果.培養(yǎng)基的酸堿度越大,所需殺滅微生物的溫度越低.(5)微生物細(xì)胞中水分對(duì)滅菌的影響細(xì)胞含水越多,蛋白質(zhì)變性的溫度越底- 6)微生物細(xì)胞菌齡對(duì)滅菌的影響老細(xì)胞水分含量低、低齡細(xì)胞水分含量高- 7)空氣排除情況對(duì)滅菌的影響- 8)攪拌對(duì)滅菌的影響- 9)泡沫對(duì)滅菌的影響六、發(fā)酵罐的滅菌培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法.那么發(fā)酵罐應(yīng)在參加滅菌的培養(yǎng)基前先行單獨(dú)滅菌.通常是用蒸汽加熱發(fā)酵罐的夾套或設(shè)管并從空氣分布管中通入蒸汽,充滿整個(gè)容器后,再?gòu)呐菤夤苤芯従徟懦?容器內(nèi)的蒸汽壓力保持1公斤