1、BCP/HAFG-rhBMP-2復(fù)合人工骨修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究(1)    【摘要】 目的 研制理想的能較快修復(fù)大段骨缺損的人工骨材料。 方法 將重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2）/透明 質(zhì)酸鈉 纖維蛋白復(fù)合凝膠（HAFG）緩釋體系和多孔雙相鈣磷陶瓷（BCP）結(jié)合研制成BCP/HAFG-rhBMP -2人工骨，并分別將BCP/HAFG-rhBMP -2和BCP/rhBMP-2及BCP/HAFG人工骨進(jìn)行兔橈骨大段骨缺損修復(fù)的對(duì)比研究。術(shù)后分別行大體、放射學(xué)、組織形態(tài)學(xué)及生物力學(xué)測(cè)試。結(jié)果 試驗(yàn)中第12周與第2周相比較，3組堿性磷酸酶（AKP）值下降

2、情況分別為BPC/HAFG-rhBMP-2組降低了65.13%，BPC/BMP-2組降低了71.03%，BPC/HAFG組降低了58.59%。 組織學(xué)及掃描電鏡觀察顯示:12周時(shí)BPC/HAFG-rhBMP-2組材料已基本被成熟骨組織所代替，新骨結(jié)構(gòu)與宿主骨無差別，而BPC/HAFG和BPC/rhBMP-2組骨小梁結(jié)構(gòu)疏松細(xì)小，材料仍未完全被降解，材料與骨組織間形成較大間隙。術(shù)后12周時(shí)3組材料植入部位骨組織極限抗壓強(qiáng)度分別為:BCP/HAFG-rhBMP-2組（538±12.7） N、BCP/BMP-2組（368±24.0）N、BCP/HAFG組（256±8.4

3、） N。BPC/HAFG-BMP-2復(fù)合型人工骨較BCP/BMP-2及BCP/HAFG人工骨具 有更強(qiáng)、更持久的誘導(dǎo)成骨活性。結(jié)論 BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨能更快促進(jìn)長(zhǎng)骨大段骨缺損的修復(fù)，是一種較理想的人工骨材料。 【關(guān)鍵詞】 骨和骨組織;骨移植;生物力學(xué)為尋找理想的人工骨組織材料，本實(shí)驗(yàn)將多孔雙 相鈣磷陶瓷（BCP）同重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2）/透明質(zhì)酸鈉（HA）和纖維蛋白復(fù)合凝膠（HAFG）緩釋體系結(jié)合，制成BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨材料，進(jìn)行修復(fù)長(zhǎng)骨大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)。 1 材料與方法    1.1 人工骨材料

4、的制備（1）BCP由東南大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院生物材 料研究組研制提供。該BCP材料呈白色多孔狀結(jié)構(gòu)， 孔道彼此連通，孔徑約為300 m，孔隙率為80%。試 驗(yàn)中將BCP制成長(zhǎng)10 mm，直徑4 mm圓柱體。（2）BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨的制備:在BCP植入前 用特制雙管注射器將混有等量rhBMP-2 的HAFG復(fù)合凝膠緩慢滴注入BCP，使其在BCP表面涂布均勻。待復(fù)合凝膠由流體狀變?yōu)榛野咨脘撔誀顟B(tài)時(shí)植入缺 損部位。同法制備并植入BCP/HAFG人工骨。（3） BCP/rhBMP-2工骨的制備:利用部分真空吸入法1將    rhBMP -

5、2和BCP結(jié)合在一起。制成的每支人工骨中約含rhBMP-2 1mg，植入前人工骨在密封包裝下環(huán)氧 乙烷氣體消毒24 h。1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 新西蘭兔60只，體重2.53.2 kg，雌雄不限。隨機(jī)分為3組:A組為BCP/HAFG-rhBMP-2組;B組為 BPC/rhBMP-2組;C組為BPC/HAFG組。 1.3 實(shí)驗(yàn)方法 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的戊巴比妥鈉（1ml·kg-1 ）靜脈麻醉后，每兔隨機(jī)選用左右側(cè)前肢，經(jīng)剃毛、消毒，取橈側(cè)切口切開皮膚及皮下組織，顯露橈骨干中段，用單片小鋸鋸下10 mm連帶骨膜骨段，然后按組分別植入相應(yīng)人工骨材料。術(shù)后給予慶大霉素10 000 U·

6、kg-1，每日2次肌肉注射，連續(xù)注射3d。常規(guī)條件下喂養(yǎng) 觀察。 1.4 大體觀察 觀察動(dòng)物的飲食、活動(dòng)、傷口反應(yīng)，術(shù)后第2、4、8、12周分批處死動(dòng)物并取材，觀察植入材料的表面、局部成骨及炎癥反應(yīng)等情況。 1.5 X線觀察 術(shù)后第4、8、12周攝片，由3人盲法按照Lane-sandhu X射線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)2進(jìn)行評(píng)分。 1.6 堿性磷酸酶（AKP）活性檢測(cè) 術(shù)后第2、4、8、12周3組各取5只動(dòng)物，全麻后，從心臟抽血3 ml離心，使用AKP試劑盒行血清AKP活性測(cè)定。 1.7 橈骨生物力學(xué)檢測(cè) 術(shù)后12周時(shí)，每組各取5個(gè)標(biāo)本及正常橈骨標(biāo)本 作力學(xué)強(qiáng)度測(cè)試。以材料植入處為中心截取橈骨長(zhǎng)約1.4 cm

7、。經(jīng)牙托粉兩端包埋后，置于MTS-858mini    bionixII 型生物力學(xué)測(cè)試機(jī)上進(jìn)行垂直壓縮試驗(yàn)。加載速度為1 mm·min-1 ，最大位移設(shè)定3 mm。每隔0.1 s記錄一次數(shù)據(jù)。 1.8 組織病理學(xué)觀察 將每次所獲取的橈骨標(biāo)本作好標(biāo)記置于10%甲醛中固定24 h后，經(jīng)EDTA脫鈣、梯度酒精脫水、石蠟包埋，沿橈骨縱軸連續(xù)切片，厚度為6 m，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。 1.9 掃描電鏡觀察 于術(shù)后第2、4、8、12周每組各取3個(gè)標(biāo)本，2.5%戊二醛（pH 7.27.4）固定2 h，然后用PBS緩沖液沖洗2次，1%鋨酸PBS液固定2

8、h，再用PBS緩沖液沖洗2次，乙腈逐級(jí)脫水，真空干燥，表面離子濺射噴金處理，HITACHIS-520掃描電鏡下觀察標(biāo)本的超微結(jié)構(gòu)。 2.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包，每組測(cè)得的X線評(píng) 分、AKP水平及生物力學(xué)評(píng)分采用方差及SNK分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平為 =0.05。 2 結(jié) 果 2.1 大體觀察 術(shù)后動(dòng)物前肢不能負(fù)重，跛行，術(shù)后1周恢復(fù)正常活動(dòng)。所有動(dòng)物切口均期愈合。術(shù)后2周時(shí)，A、B 組材料植入?yún)^(qū)有明顯骨痂生成，而C組材料外周為纖維結(jié)締組織包裹。術(shù)后8周，A組材料已部分降解，新生骨組織的形成量明顯高于B、C組。12周A組骨缺損完全修復(fù)，而其他組骨缺損處仍可見到未吸收的材料及骨

9、缺損（圖1）。    BCP/ HAFG-rhBMP-2組骨缺損完全修復(fù)，骨皮質(zhì)塑形良好（左）;BPC/HAFG組材料未完全降解，缺損部分修復(fù)（中）;BCP/ rhBMP-2組骨缺損大部分 愈合，仍可見少量未降解材料（右） 2.2 組織學(xué)觀察結(jié)果 術(shù)后2周時(shí)，A、B組材料外周新骨開始形成，材料與新骨直接結(jié)合，材料內(nèi)部孔隙中有纖維結(jié)締組織 間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入（圖2）。C組材料外周為纖維結(jié)締組織包裹，偶見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，材料內(nèi)部可見纖維結(jié)締組織填充。術(shù)后4周，各組骨缺損植入體孔隙中均有軟骨細(xì)胞生成，其中A組軟骨細(xì)胞量明顯高于B、C組，材料均未見明顯降解。術(shù)后8周，

10、A組材料已部分降解，材料內(nèi)、外新骨繼續(xù)增多。B、C組植入的材料少量降解，成骨較稀少，主要位于材料的邊緣區(qū)域。12周時(shí)，A組材料已基本降解，新生骨組織的形成量明顯高于B、C組。孔隙中有大量成熟的條索狀板層骨形成， 骨細(xì)胞排列規(guī)則，骨小梁較粗大，分布均勻，其間有骨髓組織，中心區(qū)板層骨較多，軟骨較少（圖3）。B、C組植入物孔隙中也出現(xiàn)板層骨，但以周邊為主，其間偶見少量骨髓組織，中心區(qū)板層骨及軟骨均較少。     2.3 AKP活性的變化 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)3組AKP測(cè)定結(jié)果，見表1。在第2周，B組較A組和C組均明顯增高（ P <0.05）;隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)

11、，各組AKP活性逐漸降低，其中B 組降低較快，8周時(shí)A組AKP活性較其他兩組高，差 異有顯著性（ P <0.05）;A組與C組的AKP降低幅度 較平緩。在第212周時(shí)間段內(nèi)，第12周與第2周相比較，A組降低了65.13%，B組降低了71.03%，C組 降低了58.59%。12周時(shí)各組AKP活性均恢復(fù)至正常水平。表1 3組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)AKP活性的變化（略）        BPC/HAFG- rhBMP-2材料與新骨之間及材料內(nèi)部孔隙中有纖維結(jié)締組織和間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入新生骨組織的骨小梁規(guī)則，骨髓腔及骨髓已形成，軟骨

12、細(xì)胞較。2.4 生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果    術(shù)后12周時(shí)A、B、C組植入材料和正常橈骨組的極限抗壓強(qiáng)度分別為（538±12.7）N、（368±24.0）N、（256±8.4）N和（547±14.8）N。A組的極限抗壓強(qiáng) 度與正常橈骨非常接近，無顯著性差異（ P >0.05），且兩者的抗壓強(qiáng)度均明顯高于B組和C組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性（ P <0.05）。 2.5 掃描電鏡檢查 術(shù)后2周A、B組可見排列致密的膠原纖維及大量鈣鹽結(jié)晶及小梁狀新骨形成，C組未見明顯鈣結(jié)晶沉淀。4周時(shí)A組材料與骨界面形成骨組織與宿

13、主骨結(jié)合，但新骨結(jié)構(gòu)疏松，隨時(shí)間延長(zhǎng)，骨組織逐漸轉(zhuǎn)向致密。到12周時(shí)A組材料已基本被成熟骨組織所代替，新骨結(jié)構(gòu)與宿主骨無明顯差別（圖4）。而C和B組骨小梁結(jié)構(gòu)疏松細(xì)小（圖5），材料仍未完全被降解，材料與骨組織間形成較大間隙（圖6）。 2.6 X線檢查 （1）B組:4周時(shí)材料與骨界面形成骨組織與宿主骨小梁粗大，密集，較少見到骨吸收陷窩材料仍未完全被降解，可見羥基磷灰石 結(jié)晶，材料與骨組織間形成較大間隙骨緊密結(jié)合，骨缺損內(nèi)見密度較高的BCP影，周圍有 中等量骨痂形成;8周時(shí)BCP影密度降低，周圍骨痂形 成較前有所增多;12周時(shí)BCP影部分消失，骨缺損大 部分愈合，骨髓腔部分再通（圖7）。（2）A組

14、:4周時(shí)移 植材料與兩骨端融合，骨缺損區(qū)有較多骨痂形成;8周時(shí)部分骨缺損已愈合，骨髓腔部分再通;12周時(shí)全部 骨缺損已愈合，皮質(zhì)骨塑形良好，骨髓腔完全再通（圖 8）。（3）C組:4周時(shí)BCP影清晰;8周時(shí)BCP影密度降低，有少量骨痂形成;12周時(shí)大部分骨缺損仍存在 （圖9）。Lane-sandhu X射線評(píng)分結(jié)果見表2。 表2 3組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)X射線評(píng)分結(jié)果（略）    3 討 論    3.1 骨缺損的形成及治療 由于某種因素如外傷、感染、腫瘤等而使骨喪失了一些骨質(zhì)，形成較大的間隙，稱為骨缺損。骨缺損修復(fù)最常用的

15、方法是自體骨或異體骨移植，但自體骨移植的不足是取骨數(shù)量受限、影響供骨區(qū)生物力學(xué)強(qiáng)度和功能、增加患者創(chuàng)傷和痛苦;異體骨具有自體骨一些優(yōu)越的組織特點(diǎn)及可減少手術(shù)次數(shù)，但其存在免疫排斥 反應(yīng)，并有感染HIV和肝炎病毒等可能，而且制樣、處理和存貯的成本很高。為克服自體骨和異體骨移植的 缺點(diǎn)，人們開始探索利用生物材料修復(fù)骨缺損。目前，用于骨缺損修復(fù)的生物材料主要有兩大類，一類為人工合成生物材料，如聚乳酸（PLA）、鈣磷陶 瓷、聚乙醇烯（PVA）等;另一類為天然高分子材料，如膠原、骨生長(zhǎng)因子（BMP）、明膠等。其中聚乳酸類因缺 乏骨傳導(dǎo)性、機(jī)械強(qiáng)度差及降解產(chǎn)物酸性大等缺點(diǎn)，使其在應(yīng)用上受到了限制。與其相比

16、生物活性陶瓷具有 較好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性能。因而近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)生物活性陶瓷骨替代材料的研究日趨增多。目前對(duì) 該類材料的研究主要著眼于利用先進(jìn)的加工技術(shù)將其 與各種活性因子進(jìn)行復(fù)合，以獲得更好的骨缺損修復(fù)能力。 3.2 BCP/HAFG-rhBMP-2復(fù)合人工骨生物學(xué)特性及成骨作用 多孔雙相鈣磷陶瓷材料以鈣、磷為主要成分，與骨基質(zhì)中的無機(jī)成分相似。大量實(shí)驗(yàn)證明它具有良好的 生物相容性和降解性，但缺乏骨誘導(dǎo)活性3。試驗(yàn)中將雙相鈣磷陶瓷多孔支架與HAFG-rhBMP-2緩釋體 系進(jìn)行了復(fù)合，從而使該材料在具有良好的生物相容性及骨傳導(dǎo)作用的基礎(chǔ)上，又獲得了較持久的體內(nèi)誘 導(dǎo)成骨能力。骨形態(tài)發(fā)生蛋白

17、（bone morphogenic protein， BMP）是一種廣泛分布于各種動(dòng)物骨組織中的酸性多肽，具有骨誘導(dǎo)活性。但單純的BMP在體內(nèi)易被蛋白酶分解，其生物學(xué)活性難以得到持續(xù)性發(fā)揮4。為了克服這一問題，目前的研究主要是利用有機(jī)高分子化合物制成BMP緩釋微球以獲得體內(nèi)緩釋的效果，但在微球的制備工藝中常需要有機(jī)溶劑等理化因素的處理，這使BMP的生物活性受到了影響。本實(shí)驗(yàn)中選擇HAFG復(fù)合凝膠作為rhBMP-2的緩釋載體，利用纖維蛋白原發(fā)生快速交聯(lián)和緩慢的交聯(lián)后形成半剛性三維網(wǎng)狀纖維蛋白凝塊，能將HA/rhBMP-2固定于纖 維蛋白凝塊網(wǎng)孔內(nèi)的特性，大大降低了HA在植入局部的溶散率，同時(shí)還避

18、免了組織液及纖維蛋白酶過快地進(jìn)入纖維蛋白凝塊內(nèi)部，從而使HAFG-rhBMP-2 復(fù)合凝膠緩釋體系能在機(jī)體內(nèi)存留較長(zhǎng)的時(shí)間5。 BPC/HAFG-BMP-2復(fù)合型人工骨的作用機(jī)制及優(yōu)點(diǎn)如下。（1）生物相容性:本試驗(yàn)將BCP與HAFG進(jìn)行復(fù)合，使材料在成分及結(jié)構(gòu)上與天然骨更為接近，再加上透明質(zhì)酸及纖維蛋白凝膠聚合時(shí)釋放各種生物活性因子，使得細(xì)胞更易于在材料表面黏附、增殖并分泌基質(zhì)。因此該復(fù)合材料具有比單純BCP更為良好的生物相容性。（2）骨誘導(dǎo)性:實(shí)驗(yàn)中將rhBMP-2與 HAFG制成緩釋體系后再和BCP進(jìn)行了復(fù)合。由于HA帶大量的負(fù)電荷，能與帶正電的rhBMP-2形成較好結(jié)合，再加上三維網(wǎng)狀纖維蛋白凝塊具有較強(qiáng)的吸附及降低HA/BMP溶散的作用，使得rhBMP-2可隨著復(fù)合凝膠的降解緩慢釋放，能較長(zhǎng)時(shí)間保持局部有效濃度。試驗(yàn)中對(duì)AKP檢測(cè)及組織學(xué)的觀察結(jié)果均提示BPC/HAFG-rh BMP-2復(fù)合型人工骨的誘導(dǎo)成骨活性較BPC/rhBMP-2人工骨更為持久。（2）生物降解性:由于羥基磷灰石和磷酸三鈣（tricalcium phos-