1、    HIV1整合酶單鏈抗體在大腸桿菌中的表達(dá)、純化與鑒定        關(guān)鍵詞人類免疫缺陷病毒整合酶單鏈抗體摘要將具有HIV1整合酶結(jié)合活性的單鏈抗體重組噬菌體感染HB2151大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在周質(zhì)腔萃取物及培養(yǎng)基上清中，均檢測(cè)到有較特異與整合酶結(jié)合的可溶性單鏈抗體的表達(dá)。利用HiTrapAnti?Etag柱對(duì)單鏈抗體進(jìn)行了親和層析純化。Westernblot結(jié)果初步表明，單鏈抗體不僅可與整合酶的單體反應(yīng)，而且也可與其二聚體結(jié)合。提示：研制的單鏈抗體可用于對(duì)HI

2、V1整合酶活性影響的研究。中國(guó)書資料分類號(hào)Q78Expression, purification and identification of single chain fragments variable(ScFv) antibody against HIV1 integrase(IN)Zhang Jianhui, Song Xiaoguo, Meng Li, Feng Yuying, Han Baoguang, Ling Shigan, Ma Xiankai (Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical S

3、ciences, Beijing 100850) Keywords HIV integrase ScFv Abstract E. coli HB2151 was infected with recombinant HIV1 integrase binding ScFv phages. After induced by IPTG, expression of soluble ScFv characterized by specific binding to IN protein was detected in the bacteria periplasm and supernatant of c

4、ulture medium. Using HiTrap AntiE tag column, the ScFv was purified by affinity chromatography. The preliminary results of Westernblot showed that the ScFv could bind to both oligomer and dimer of IN protein. It was indicated that the ScFv could be used for study its possible role in inhibiting IN a

5、ctivities. 目前，AIDS的治療尚無(wú)特效療法。因病毒基因突變致機(jī)體迅速產(chǎn)生的抗藥性，要求不斷研制作用于HIV多個(gè)靶位的新制劑。HIV整合酶（integrase,IN)為HIVpol基因3端編碼的Mr為32000的蛋白質(zhì)，它介導(dǎo)的病毒cDNA與宿主細(xì)胞染色體DNA的整合過程為HIV復(fù)制的基本步驟，因此，IN為治療AIDS的理想靶位之一1。為探索AIDS治療的新途徑，我們研制了HIV1IN的噬菌體單鏈可變區(qū)抗體（single chain fragments variable,ScFv)。本研究將此ScFv在大腸桿菌中進(jìn)行了可溶性表達(dá)與親和層析純化，并證明有較特異結(jié)合IN的活性。1材料和方

6、法1.1材料所用試劑均為AR或分子生物學(xué)純。重組HIV1IN，由本實(shí)驗(yàn)室制備。噬菌體單鏈可變區(qū)抗體：以重組IN免疫的Balb/c小鼠脾臟mRNA為來源，利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，獲得了ScFv重組噬菌體庫(kù)。經(jīng)抗原親和富集，篩選出具有IN結(jié)合活性的單鏈?zhǔn)删w抗體，ScFvDNA序列分析表明，符合鼠的抗體序列，詳見參考文獻(xiàn)2。1.2方法1.2.1ScFv的可溶性表達(dá)將與IN有結(jié)合活性的重組噬菌體感染培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HB2151宿主菌（Pharmacia),30振搖1h。以感染菌涂布SOBAGN平板，30溫育過夜。挑取單個(gè)菌落以2×YT培養(yǎng)基于30培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物以110接種于2&#

7、215;YTAG培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)至A600值為0.8，更換為2×YTAI培養(yǎng)基，于30溫育20h24h。1.2.2大腸桿菌周質(zhì)腔分泌物的萃取將過夜培養(yǎng)物以1500×g離心20min,菌體重懸于2培養(yǎng)基體積的TES（0.2mol/LTris?HC1,0.5mmol/LEDTA,0.5mol/Lsucrose)中，再加入3.3體積的1/5×TES混勻，置冰上40min,同上離心，以0.45m濾膜過濾后，4保存。1.2.3培養(yǎng)基上清的硫酸銨沉淀于培養(yǎng)基上清中，加入50飽和度的硫酸銨，室溫?cái)嚢?h,2500×g離心40min,沉淀重懸于PBS中，并以PBS反復(fù)

8、透析24h。1.2.4ScFv的純化由于ScFv的C端帶有13個(gè)氨基酸殘基的Etag肽，故利用HRP標(biāo)記的鼠抗Tag IgG,用ELISA方法可檢測(cè)與IN結(jié)合的ScFv的表達(dá)情況，并可用HiTrapAnti-ETag親和層析柱對(duì)ScFv純化。將1L培養(yǎng)菌的周質(zhì)腔萃取物及經(jīng)硫酸銨沉淀的培養(yǎng)基上清混合并超濾至10ml，上樣于已經(jīng)結(jié)合緩沖液（0.2mol/LPB,pH7.0)平衡的HiTrapAntiEtag親和層析柱（Pharmacia)上，樣品流速為5ml/min。先以結(jié)合緩沖液洗去雜蛋白后，再以洗脫緩沖液（1.0mol/L甘氨酸，pH3.0)洗脫結(jié)合在柱上的ScFv。將含有ScFv的組分立即以

9、中和緩沖液（1.0mol/LTris,0.05NaN3,pH8.2)調(diào)整至pH7.2,經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量后，4保存?zhèn)溆谩?.2.5ELISA純化的IN蛋白以0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至2g/ml后包被酶聯(lián)板，372h，用1BSA4封閉過夜。加入以2BSA稀釋的大腸桿菌周質(zhì)腔萃取物或培養(yǎng)上清，室溫作用2h。洗滌后，加入稀釋的HRP標(biāo)記的鼠抗ETagIgG,室溫繼續(xù)孵育1h2h，洗滌后，OPD顯色10min，測(cè)A490nm值。1.2.6SDSPAGE參照文獻(xiàn)3進(jìn)行。1.2.7Western?blot分析ScFv表達(dá)產(chǎn)物的分析：將可溶性表達(dá)、純化的ScFv以SDSPAGE分離后，

10、轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，加5脫脂奶粉封閉過夜后，繼加鼠抗ETagIgG,室溫孵育2h，洗滌后用DAB底物顯色。ScFv與IN結(jié)合活性的分析：純化的IN蛋白以SDSPAGE分離后轉(zhuǎn)膜，同上封閉后，加入1100稀釋的純化ScFv，室溫作用2h，洗滌后加入HRP標(biāo)記的鼠抗ETagIgG,同上孵育及顯色。2結(jié)果2.1ScFv的可溶性表達(dá)克隆在pCANTAB5E噬菌粒（1）上的ScFv基因，其5端與基因3蛋白的分泌信號(hào)融合；3端通過ETagDNA片段與基因3結(jié)構(gòu)基因融合。ETag與基因3間有一琥珀終止密碼子。在該終止密碼子非抑制表型HB2151大腸桿菌中，ScFv以游離形式表達(dá)，并在基因3信號(hào)肽介導(dǎo)下分泌

11、到周質(zhì)腔中進(jìn)行折疊，形成功能性的ScFv。1pCANTAB5E?ScFv表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)（示意）Fig 1 Construction of pCANTAB 5E-ScFv expression vector我們將76個(gè)與IN有結(jié)合活性克隆的重組噬菌體進(jìn)行了ScFv的可溶性表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示，59個(gè)克隆的培養(yǎng)基上清及周質(zhì)腔萃取物經(jīng)1100稀釋后，均可檢出有IN結(jié)合活性的ScFv；而HB2151空菌的培養(yǎng)上清與周質(zhì)腔萃取物均不與IN起反應(yīng)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，ScFv基因的全長(zhǎng)為768bp(包括ScFv基因C端的ETagDNA片段），編碼256個(gè)氨基酸，經(jīng)推算其表達(dá)產(chǎn)物的Mr為28000。由SDSP

12、AGE的結(jié)果（2）可見，ScFv的周質(zhì)腔萃取物及培養(yǎng)上清經(jīng)親和層析純化后，得到較純的Mr為28000的條帶，其下方還有兩條Mr較小的帶，推測(cè)可能為培養(yǎng)及純化過程中ScFv的降解產(chǎn)物。經(jīng)Westernblot分析證實(shí)，Mr為28000的蛋白即為帶有ETag的ScFv；而其降解產(chǎn)物與AntiETag的結(jié)合活性較弱，僅見痕量的顯色帶。以Westernblot證實(shí)于上樣前的樣品中，也可測(cè)到明顯的Mr為28000的ScFv帶。2 ScFv的表達(dá)及其純化產(chǎn)物的Westernblot分析Fig 2 Westernblot analysis of the expressed and purified ScFv

13、 1:Protein relative molecular mass(Mr); 2:ScFv before purification (mixture of periplasmic extract and culture medium concentrated by (NH)2SO4 precipitation); 3:ScFv purified by HiTrap AntiE Tag affinity column; 4:AntiE Tag binding characteristic of ScFv 23 loaded on lane 2; 5:AntiE Tag binding char

14、acteristic of ScFv 23 loaded on lane 3 2.2ScFv與IN蛋白的結(jié)合活性與特異性鑒定如3所示，純化后的IN蛋白在SDS?PAGE分析時(shí)，除Mr為32000的帶外，在Mr約64000處還有1條很淺的蛋白帶，推測(cè)可能為IN蛋白的二聚體。以等量的標(biāo)本上樣，經(jīng)Westernblot分析鑒定證明，純化的ScFv不僅能與Mr為32000的IN蛋白結(jié)合，而且也可與微量存在的IN蛋白的二聚體起反應(yīng)。3 ScFv與IN結(jié)合特性的Westernblot分析Fig 3 Westernblot analysis of IN binding characteristic of S

15、cFv 1:Protein relative molecular mass (Mr); 2:SDS? PAGE analysis of purified IN; 3: Western blot analysis of IN binding characteristic of purified ScFv 為鑒定ScFv與IN結(jié)合的特異性，我們分別以IN蛋白及等量的重組HIV穿膜蛋白（GP41）、重組HBV前S抗原（C/2)及人前列腺特異性抗原單克隆抗體（PSA）3種無(wú)關(guān)蛋白包被酶聯(lián)板，將1株純化的ScFv以BSA倍比稀釋后，同時(shí)進(jìn)行ELISA檢測(cè)（4）。結(jié)果顯示，即使在較高稀釋濃度（1212）時(shí)

16、，ScFv仍有結(jié)合IN蛋白的活性；僅在較高濃度（123稀釋度以下）時(shí)，才顯示ScFv與GP41和C/2有輕微的交叉反應(yīng)，而各濃度的ScFv與PSA蛋白均無(wú)反應(yīng)。4ScFv與幾種蛋白的ELISA的反應(yīng)性Fig 4 Binding of the ScFv to various proteins showed by ELISA 3討論IN蛋白的難溶性是其晶體結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)的天然構(gòu)象尚未完全明確，因而IN抑制物的發(fā)展及應(yīng)用也受到了限制4，5。單鏈可變區(qū)抗體為近年來出現(xiàn)的基因工程小分子抗體，具有穿透性強(qiáng)、代謝快，對(duì)人體免疫原性弱等特點(diǎn)6。因此，研制IN特異性的ScFv，觀察其對(duì)IN生物學(xué)活性的影響，對(duì)發(fā)

17、現(xiàn)新的IN抑制劑，探索AIDS治療的新途徑具有重要的意義。以重組IN蛋白免疫的Balb/c小鼠mRNA為來源，我們利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，獲得了具有IN結(jié)合活性的ScFv重組噬菌體。經(jīng)感染HB2151大腸桿菌，在周質(zhì)腔及培養(yǎng)上清中，得到了可溶性表達(dá)的ScFv。將其以親和層析純化后證明，有較好的IN結(jié)合特異性。免疫印跡的結(jié)果初步表明，ScFv不僅可與IN蛋白的單體起反應(yīng)，而且也可很好地與IN蛋白的二聚體結(jié)合。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道7，IN蛋白至少以二聚體的形式發(fā)揮其生物學(xué)功能。因此，和其二聚體結(jié)合是抑制IN活性的基礎(chǔ)，同時(shí)和IN單體結(jié)合也可能通過影響二聚體或多聚體的形成而發(fā)揮對(duì)IN的抑制作用。目前，我們正

18、在設(shè)法提高ScFv的表達(dá)量及純化效率，鑒定ScFv的IN作用表位，觀察其體外對(duì)IN生物學(xué)活性的影響，從而探索其在AIDS治療中的作用。作者簡(jiǎn)介：張健慧，女，34歲，助理研究員，博士北京市太平路27號(hào)，Tel.(010)66932307作者單位：張健慧宋曉國(guó)孟莉馮玉英韓保光凌世淦馬賢凱(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100850）參考文獻(xiàn)1Katz RA, Skalka AM. The retroviral enzymes. Annu Rev Biochem,1994; 63: 133 173 2張健慧，孟莉，韓保光，等.利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)制備HIV1整合酶單鏈抗體的初步研究.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1998；22：2482523金冬雁，黎孟楓譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.北