1、干細(xì)胞因子聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員骨髓干細(xì)胞促進(jìn)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟損傷修復(fù)作用的研究1張建江,易著文,何小解,何慶南,黨西強(qiáng),吳小川,莫雙紅中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院小兒腎臟病研究室,湖南省小兒腎臟病臨床中心,長(zhǎng)沙(410011E-mail:zhangjianjiang10摘要:目的觀察干細(xì)胞因子(SCF聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO大鼠骨髓干細(xì)胞動(dòng)員對(duì)腎間質(zhì)中微血管、纖維化程度和腎功能的影響,并探討其對(duì)微血管影響的可能機(jī)制。方法128只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組、SCF聯(lián)合G-CSF動(dòng)員組(SCF-G組、單側(cè)輸尿管梗阻組(UUO組、SCF聯(lián)合G-CSF動(dòng)員加梗

2、阻組(UUO+SCF-G組。于實(shí)驗(yàn)第5、14、21、28天每組各隨機(jī)抽取8只處死,檢測(cè)血清肌酐水平、腎間質(zhì)CD34+表達(dá)細(xì)胞數(shù)目和因子陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目、腎間質(zhì)纖維化和間質(zhì)的病理?yè)p害積分、腎皮質(zhì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF mRNA和血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1 模型2周時(shí)即可見到腎間質(zhì)纖維化伴腎小管周微血管的丟失; mRNA的表達(dá)。結(jié)果UUO-G組腎間質(zhì)干細(xì)胞歸巢數(shù)目明顯高于UUO組和Sham組;UUO+SCF-G組UUO+SCF腎小管周微血管指數(shù)減少出現(xiàn)的時(shí)間晚于UUO組;第14、21、28天UUO+SCF-G組間-G組術(shù)后VEGF mRNA表達(dá)質(zhì)化纖維程度和腎小管損傷程度均輕于UUO組;U

3、UO+SCF-G組術(shù)后TSP-1 下降出現(xiàn)的時(shí)間晚于UUO組,且表達(dá)均高于同期UUO組;UUO+SCFmRNA表達(dá)增高出現(xiàn)的時(shí)間晚于UUO組,且表達(dá)均低于同期UUO組;在UUO組和UUO+SCF-G組中,腎小管周微血管指數(shù)與血清肌酐水平及間質(zhì)纖維化積分、腎小管間質(zhì)的病理積分均呈負(fù)相關(guān);腎皮質(zhì)VEGF mRNA表達(dá)與腎小管周微血管指數(shù)均呈正相關(guān),腎皮大鼠中存在腎小管質(zhì)TSP-1 mRNA表達(dá)與腎小管周微血管指數(shù)均呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論UUO周微血管的丟失,并與腎間質(zhì)纖維化及間質(zhì)病理?yè)p傷密切相關(guān);聯(lián)合應(yīng)用SCF和G-CSF動(dòng)員的骨髓干細(xì)胞可以歸巢至受損的腎臟,有助于減少腎小管周微血管丟失,并進(jìn)而減輕腎間質(zhì)

4、纖維化和間質(zhì)損害,保護(hù)腎功能;聯(lián)合應(yīng)用SCF和G-CSF,可以上調(diào)腎皮質(zhì)VEGF mRNA水平和下調(diào)TSP-1 mRNA水平,這可能是其促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)及保護(hù)腎間質(zhì)微血管損傷的機(jī)制之一。關(guān)鍵詞:單側(cè)輸尿管梗阻,骨髓干細(xì)胞,干細(xì)胞因子,粒細(xì)胞細(xì)胞集落刺激因子,間質(zhì)纖維化,腎小管周微血管,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子,血小板反應(yīng)蛋白-1中圖分類號(hào):R620間質(zhì)纖維化是慢性腎臟疾病進(jìn)展的共同病理特征,最終進(jìn)展為終末期腎衰1,目前對(duì)此尚缺乏有效的治療措施。Bohle等的研究2發(fā)現(xiàn),多種進(jìn)展性腎病存在腎間質(zhì)微血管丟失,并認(rèn)為腎間質(zhì)微血管的丟失是造成腎小管間質(zhì)缺氧性損傷及間質(zhì)纖維化的重要病因。近年國(guó)內(nèi)外在心肌梗死領(lǐng)域

5、應(yīng)用骨髓干細(xì)胞進(jìn)行治療的報(bào)道較多,認(rèn)為骨髓干細(xì)胞最終不能分化為新的心肌細(xì)胞,但可促進(jìn)受損組織的新生血管形成,心肌梗死患者可能受益于此3,4。本研究擬觀察干細(xì)胞因子(SCF聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO大鼠骨髓干細(xì)胞動(dòng)員后在腎間質(zhì)的歸巢及對(duì)腎間質(zhì)中微血管、纖維化程度和腎功能的影響,并探討其對(duì)微血管影響的可能機(jī)制,以期為干細(xì)胞移植在腎臟疾病中的應(yīng)用提供新的途徑及理論依據(jù)。1本課題得到國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目號(hào):30672251及教育部博士點(diǎn)基金資助(項(xiàng)目號(hào):20040533043的資助。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物128只雄性Wistar大鼠(體重180-200 g,由

6、中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為4組,每組32只。1. 2 主要材料基因重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF,商品名:瑞白購(gòu)于山東齊魯制藥廠,干細(xì)胞因子(rhSCF購(gòu)于成都地奧九泓制藥廠,兔抗CD34多克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司,兔抗因子相關(guān)抗原多克隆抗體及SP免疫組化染色試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,引物由上海生工合成。1. 3 實(shí)驗(yàn)分組及方法假手術(shù)對(duì)照組( sham operation group,Sham組。手術(shù)分離右輸尿管但不結(jié)扎輸尿管。術(shù)后當(dāng)天即經(jīng)皮下注射生理鹽水2ml/(kg·d,連續(xù)5天。SCF聯(lián)合G-CSF對(duì)照組(SCF and

7、G-CSF control group,SCF-G組。皮下注射SCF200 µg/(kg·d,G-CSF200 µg/(kg·d,連續(xù)5天。單側(cè)輸尿管梗阻組(unilateral ureteral obstruction group,UUO組。行右側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)。術(shù)后當(dāng)天即經(jīng)皮下注射生理鹽水2ml/(kg·d,連續(xù)5天。單側(cè)輸尿管梗阻加SCF聯(lián)合G-CSF動(dòng)員組(unilateral ureteral obstruction treated with SCF and G-CSF group, UUO+SCF-G組。行右側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù),術(shù)后當(dāng)天即

8、皮下注射SCF200 µg/(kg·d,G-CSF200 µg/(kg·d,連續(xù)5天。于實(shí)驗(yàn)第5、14、21、28天每組各隨機(jī)抽取8只大鼠處死,采集血液及右側(cè)腎臟標(biāo)本。其中右腎除去腎包膜用生理鹽水灌洗后分成二份,一份用10%的福爾馬林固定以用于光鏡檢測(cè)和免疫組化檢測(cè),其余部分分離腎皮質(zhì),經(jīng)液氮速凍保存后轉(zhuǎn)入-70冰箱備用。1. 4 指標(biāo)檢測(cè)1.4.1檢測(cè)四組大鼠血清肌酐水平:日立 7150 型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。1.4.2免疫組化染色檢測(cè)腎間質(zhì)CD34陽性表達(dá)細(xì)胞染色后每張切片取腎皮質(zhì)20個(gè)顯微鏡高倍視野(×400,分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野腎小管間質(zhì)

9、中CD34+細(xì)胞數(shù)目,取其平均值。1.4.3免疫組化染色檢測(cè)腎間質(zhì)因子陽性表達(dá)細(xì)胞微血管免疫組化染色陽性細(xì)胞的量化參照文獻(xiàn)5任何1個(gè)棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為1條微血管,只要結(jié)構(gòu)不相連,其分支結(jié)構(gòu)也作為1條血管計(jì)數(shù)(除外大的血管。對(duì)每個(gè)標(biāo)本觀察腎皮質(zhì)20個(gè)顯微鏡高倍視野(×400腎小管周圍腎間質(zhì)中微血管數(shù),并取平均值,得出腎小管周微血管指數(shù)(peritubular capillar index,PCI。1.4.4腎臟病理評(píng)分HE、 PAS 及Masson染色后在光鏡下觀察腎組織形態(tài)改變,并進(jìn)行間質(zhì)纖維化及間質(zhì)的病理?yè)p害積分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照李志輝等的方法6。1.4.5 RT-PCR

10、方法檢測(cè)腎皮質(zhì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF mRNA和血小板反應(yīng)蛋白-1 (TSP-1 mRNA的表達(dá)VEGF引物序列為:上游5/-TTCGTCCAACTTCTGGGCTGT-3/,下游5/- AGCAAGGCAAGGCTCCAATG-3/;TSP-1引物序列為:上游5/- CATCAACACCGAAAGGGACG-3/,下游5/- AGCCCATAGTTCCAGAAGGTG-3/。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度VEGF為420 bp,TSP-1為538 bp。GAPDH為內(nèi)參。PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后,用Phoretix ID凝膠圖像分析軟件測(cè)定電泳條帶的光密度,用內(nèi)參校準(zhǔn)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分

11、析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。腎小球和小管間質(zhì)的病理積分系將多項(xiàng)分類資料的結(jié)果數(shù)量化,其結(jié)果同其它定量資料一樣,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s表示,兩組間均數(shù)采用t檢驗(yàn),多組間均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析。對(duì)有相關(guān)趨勢(shì)的變量,采用Pearson相關(guān)分析。腎間質(zhì)纖維化積分系單項(xiàng)分類資料的結(jié)果,按等級(jí)資料處理,兩組之間比較采用秩和檢驗(yàn)。腎間質(zhì)纖維化積分與其它資料的相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。均以P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1四組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清肌酐水平的變化UUO組與UUO+SCF-G組大鼠在術(shù)后第顯著性(P<0.05。余不14、21、28

12、天,血清肌酐水平與Sham組相比均明顯增高,差異有同時(shí)間點(diǎn)四組大鼠之間血清肌酐水平均無顯著性差異(P>0.05(見表1。表1. 四組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清肌酐的變化(µmol/L(x±s第5天第14天第21天第28天Sham 24.11±7.88 24.41±5.53 21.95±5.36 25.05±7.69SCF-G 22.19±7.04 23.55±5.36 22.44±4.83 23.77±7.07UUO 25.54±7.85 89.71±12.92a 81.50&

13、#177;18.05a 81.05±26.75aUUO+SCF-G 26.05±6.67 85.33±14.72a 84.08±20.38a 77.99±22.20aF 0.440 97.452 49.418 24.638P 0.726 0.000 0.000 0.000a P<0.05 vs. Sham group.2.2四組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎小管間質(zhì)中CD34陽性細(xì)胞數(shù)目的變化CD34表達(dá)于細(xì)胞膜,既是干細(xì)胞的表面標(biāo)志,也是血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志。CD34陽性表達(dá)為蘇木素核襯染下,細(xì)胞膜環(huán)狀棕黃色染色。在Sham組及SCF-G組,CD3

14、4+陽性表達(dá)見于腎小球內(nèi)、腎間質(zhì)內(nèi)微血管及大的血管的內(nèi)皮細(xì)胞,其他部位各時(shí)間點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)CD34+表達(dá)細(xì)胞。而在UUO組和UUO+SCF-G組中,除了上述部位外,在部分損傷的小管部位亦見CD34+表達(dá)細(xì)胞,且UUO組腎間質(zhì)CD34+表達(dá)細(xì)胞數(shù)目在術(shù)后第5天較Sham 組及SCF-G組略有增多,UUO+SCF-G組則在第5、14、21腎間質(zhì)CD34+表達(dá)細(xì)胞數(shù)目與其余三組相比均明顯增多,差異有顯著性(P<0.05。SCF-G組與Sham組相比,腎間質(zhì)CD34+表達(dá)細(xì)胞數(shù)目無顯著性差異(P>0.05(見表2。x±s表2. 四組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎小管間質(zhì)中CD34+細(xì)胞數(shù)目變化(個(gè)

15、/HP, 1040(第5天第14天第21天第28天Sham 21.6±6.7 20.6±8.9 22.3±6.9 20.3±6.9SCF-G 23.4±7.1 23.4±5.9 22.6±10.0 22.3±7.8UUO 29.6±7.9a25.9±8.6 21.1±6.8 16.8±4.9UUO+SCF-G 44.1±10.6ab49.2±11.0ab 38.0±11.0ab 27.5±7.7 bF 12.387 17.946 6.5

16、21 3.362P 0.000 0.000 0.002 0.033a P<0.05 vs. Sham group,b P<0.05 vs. UUO group.2.3四組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎小管周微血管指數(shù)的變化以腎小管周因子免疫組化染色為棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞作為微血管指數(shù)的依據(jù),結(jié)果發(fā)現(xiàn):Sham組及SCF-G組各時(shí)間點(diǎn)腎小管周微血管指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05。UUO 組在術(shù)后14天腎小管周微血管指數(shù)較Sham組下降,隨時(shí)間延長(zhǎng),微血管指數(shù)下降更為明顯。UUO+SCF-G組在術(shù)后21天腎小管周微血管指數(shù)始有下降趨勢(shì),28天時(shí)明顯低于Sham 組,但仍高于同期UUO組微血管指數(shù)

17、(P<0.05(見表3。x±s表3. 四組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎小管周微血管指數(shù)的變化(個(gè)/HP, 1040(第5天第14天第21天第28天Sham 20.0±6.5 20.0±6.1 23.0±6.3 21.1±7.3SCF-G 22.8±8.2 23.5±7.4 22.3±8.2 20.9±7.7UUO 18.6±4.6 13.5±3.6 a 12.1±3.6 a9.6±2.5 aUUO+SCF-G 20.3±6.5 20.9±5.4b 18

18、.6±4.1b14.6±2.9abF 0.552 4.333 5.800 7.629P 0.651 0.013 0.003 0.001a P<0.05 vs. Sham group,b P<0.05 vs. UUO group.2.4四組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織形態(tài)學(xué)變化及病理積分2.4.1 四組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織形態(tài)學(xué)變化Sham組在4周內(nèi)腎組織形態(tài)學(xué)未發(fā)現(xiàn)明顯變化。SCF-G組各時(shí)間點(diǎn)腎組織形態(tài)學(xué)與Sham組相比無明顯差異。UUO組結(jié)扎側(cè)腎臟隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大,腎盂內(nèi)積液擴(kuò)張,腎實(shí)質(zhì)逐漸變薄。術(shù)后第5天可見腎小管上皮細(xì)胞空泡變性,間質(zhì)內(nèi)有較多炎癥細(xì)胞浸

19、潤(rùn)。第14天腎小管上皮細(xì)胞萎縮,管腔明顯擴(kuò)張,彌漫的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),纖維化形成,皮質(zhì)變薄。第21天腎小管數(shù)目更加減少,小管空泡變性明顯,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞增殖,間質(zhì)纖維化程度進(jìn)一步加重。術(shù)后第28天,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)仍明顯,皮質(zhì)極薄,擴(kuò)張小管數(shù)量減少,纖維化更加明顯,而腎小球仍無明顯病變,僅見極少量腎小球有系膜增殖。UUO+SCF-G組與UUO組相比,術(shù)后第5天兩組之間無明顯差異,第14、21、28天UUO+SCF-G組間質(zhì)纖維程度和腎小管損傷程度均輕于UUO組。未結(jié)扎的對(duì)側(cè)腎臟組織未見明顯的組織學(xué)變化。2.4.2 UUO組與UUO+SCF-G組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎小管間質(zhì)的病理積分變化隨時(shí)間延長(zhǎng),

20、 兩組大鼠腎小管間質(zhì)損害的程度均漸加重。術(shù)后第5天,兩組腎小管間質(zhì)的病理積分之間無顯著性差異(P>0.05,余時(shí)間點(diǎn)UUO+SCF-G組大鼠腎小管間質(zhì)的病理積分均低于UUO 組(P <0.05(見表4。表4. UUO 組與UUO+SCF-G 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎小管間質(zhì)病理積分變化(x ±s 第5天 第14天 第21天 第28天 UUO 5.0±1.2 8.1±1.2 11.5±1.6 13.8±1.7UUO+SCF-G 4.8±1.2 6.3±1.4 7.6±1.6 9.0±1.5t 0.42

21、4 2.842 4.841 5.966P 0.678 0.013 0.000 0.0002.4.3 UUO 組與UUO+SCF-G 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎間質(zhì)纖維化的病理積分變化隨時(shí)間延長(zhǎng), 兩組大鼠腎間質(zhì)纖維化的程度均漸加重。術(shù)后第5天,兩組腎間質(zhì)纖維化的病理積分之間無顯著性差異(P >0.05,余時(shí)間點(diǎn)UUO+SCF-G 組大鼠腎間質(zhì)纖維化積分均低于UUO 組(P <0.05(見表5。表5. UUO 組與UUO+SCF-G 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎間質(zhì)纖維化的病理積分變化 纖維化積分M (Q 組別例數(shù) 5d 14d 21d 28d UUO8 0.5(1.0 1.0(1.0 2.0(1.0

22、 3.0(2.0 UUO+SCF-G 8 0.0(1.0 0.5(1.0 1.0(1.0 1.5(2.0T * 64.051.0 44.0 49.5 P 0.626 0.029 0.004 0.039 *積分的中位數(shù)和全距; *采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon W 。2.5 不同時(shí)間點(diǎn)三組大鼠腎皮質(zhì)VEGF mRNA 表達(dá)的變化假手術(shù)對(duì)照組腎皮質(zhì)有一定量的VEGF mRNA 表達(dá)。在UUO 組和UUO+SCF-G 組術(shù)后均有一過性的VEGF mRNA 表達(dá)增高,隨時(shí)間的延長(zhǎng),VEGF mRNA 表達(dá)開始持續(xù)下降。UUO+SCF-G 組術(shù)后VEGF mRNA 表達(dá)下降出現(xiàn)的時(shí)間晚于UU

23、O 組,且在術(shù)后第14、21、28天VEGF mRNA 表達(dá)水平均高于同期UUO 組,差異有顯著性(P <0.05(見表6。表6. 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎皮質(zhì)VEGF mRNA 表達(dá)(x ±s 第5天 第14天 第21天 第28天Sham 0.23±0.05 0.22±0.05 0.23±0.03 0.22±0.04UUO 0.29±0.06a 0.19±0.05 0.14±0.03a 0.09±0.02aUUO+SCF-G 0.33±0.06a 0.26±0.06b 0.19&#

24、177;0.02ab 0.13±0.03abF 5.746 4.058 15.949 32.088P 0.010 0.032 0.000 0.000a P<0.05 vs. Sham group,b P<0.05 vs. UUO group.2.6 不同時(shí)間點(diǎn)三組大鼠腎皮質(zhì)TSP-1mRNA 表達(dá)的變化假手術(shù)對(duì)照組腎皮質(zhì)TSP-1mRNA 表達(dá)量很低,UUO 組在術(shù)后第5天即開始較假手術(shù)對(duì)照組明顯增高,差異有顯著性(P <0.05,且隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)進(jìn)一步增高,在術(shù)后第28天TSP-1mRNA 表達(dá)水平已達(dá)假手術(shù)對(duì)照組的2倍以上。UUO+SCF-G 組在術(shù)后第14天始

25、較假手術(shù)對(duì)照組明顯增高,但仍低于同期UUO組水平,差異有顯著性(P<0.05(見表7。x±s表7. 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎皮質(zhì)TSP-1mRNA表達(dá)(第5天第14天第21天第28天Sham 0.041±0.015 0.043±0.015 0.040±0.016 0.043±0.016UUO 0.064±0.018a 0.073±0.013a 0.079±0.016a 0.096±0.021aUUO+SCF-G 0.046±0.013b 0.058±0.013ab 0.061

26、7;0.015ab 0.074±0.019abF 4.632 9.818 12.225 16.712P 0.022 0.001 0.000 0.000a P<0.05 vs. Sham group,b P<0.05 vs. UUO group.2.7 UUO組和UUO+SCF-G組腎間質(zhì)纖維化積分與腎小管間質(zhì)的病理積分的相關(guān)分析術(shù)后5-28天的腎間質(zhì)纖維化積分與腎小管間質(zhì)的病理積分之間作相關(guān)分析,在UUO組Spearman相關(guān)系數(shù)為r=0.655,P=0.000;在UUO+SCF-G組Spearman相關(guān)系數(shù)為r=0.553, P=0.001。說明腎間質(zhì)纖維化積分與腎小管

27、間質(zhì)的病理積分在兩組內(nèi)均呈正相關(guān)。2.8 UUO組和UUO+SCF-G組腎小管周微血管指數(shù)與血清尿素氮、肌酐水平及腎小管間質(zhì)纖維化積分、間質(zhì)病理積分的相關(guān)分析在UUO組和UUO+SCF-G組術(shù)后5-28天的腎小管周微血管指數(shù)與血清肌酐水平及腎小管間質(zhì)纖維化積分、間質(zhì)病理積分均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05。(見表8。表8 腎小管周微血管指數(shù)與血清尿素氮、肌酐水平及腎小管間質(zhì)的病理積分、間質(zhì)纖維化的病理積分的相關(guān)分析(r值UUO組 UUO+SCF-G組肌酐纖維化積分間質(zhì)積分肌酐纖維化積分間質(zhì)積分腎小管周微血管指數(shù) -0.384* -0.835* -0.537* -0.351* -0.631* -0

28、.359*注:經(jīng)相關(guān)分析, *P<0.05。Spearman相關(guān)系數(shù),未標(biāo)注的為Pearson相關(guān)系數(shù)。2.9 UUO組和UUO+SCF-G組大鼠腎皮質(zhì)VEGF mRNA表達(dá)與TSP-1 mRNA 表達(dá)及腎小管周微血管指數(shù)的相關(guān)分析在UUO組和UUO+SCF-G組大鼠中,腎皮質(zhì)VEGF mRNA表達(dá)與腎小管周微血管指數(shù)均呈正相關(guān)(P<0.05;在UUO組和UUO+SCF-G組大鼠中,腎皮質(zhì)TSP-1 mRNA表達(dá)與腎小管周微血管指數(shù)均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05(見表9。表9. UUO組和UUO+SCF-G組大鼠腎皮質(zhì)VEGFmRNA表達(dá)、TSP-1mRNA表達(dá)與腎小管周微血管指數(shù)

29、的相關(guān)分析 (r值UUO組 UUO+SCF-G組VEGFmRNA TSP-1mRNA VEGFmRNA TSP-1mRNA腎小管周微血管指數(shù) 0.677* -0.545* 0.439* -0.400* 注:經(jīng)相關(guān)分析, *P<0.05。3 討論腎臟微血管不僅是炎癥、代謝等損害因素的承受者,也是腎臟損傷的直接參與者,維持腎臟微血管功能與數(shù)目是預(yù)防腎臟病變持續(xù)進(jìn)展的關(guān)鍵7,8。導(dǎo)致腎間質(zhì)微血管損傷和丟失的因素包括促血管生成因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF的減少、抑制血管生成因子如血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospond

30、in-1,TSP-1的增加等,尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷甚至凋亡在其中起了重要作用。因此,探討如何促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)或再生,減少微血管進(jìn)行性丟失以達(dá)到延緩腎間質(zhì)纖維化及慢性腎病進(jìn)展的目的,顯然有著積極的意義。因子相關(guān)抗原是血管內(nèi)皮細(xì)胞一個(gè)可靠的標(biāo)記物9。因?yàn)橐蜃又辉谘軆?nèi)皮細(xì)胞中有表達(dá),陽性細(xì)胞存在的地方表示有微血管或有微血管形成,且能夠清楚的將微血管和其它組織成分分開。因此,我們也以腎小管周因子免疫組化染色為棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞作為PTC 指數(shù)的依據(jù)10。本結(jié)果表明,UUO組及UUO+SCF-G組在術(shù)后隨時(shí)間延長(zhǎng),PTC指數(shù)均逐漸下降。但UUO組術(shù)后14天即可見PTC指數(shù)較Sham組下降, UUO+

31、SCF-G組在術(shù)后21天PTC指數(shù)始有下降趨勢(shì),28天時(shí)UUO+SCF-G組PTC指數(shù)低于Sham組,但仍高于同期UUO組PTC指數(shù)。提示SCF聯(lián)合G-CSF動(dòng)員骨髓干細(xì)胞對(duì)UUO模型大鼠的PTC的丟失可能有保護(hù)作用,國(guó)內(nèi)外尚未見有類似報(bào)道。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn), UUO組與UUO+SCF-G組相比,術(shù)后第5天兩組腎間質(zhì)纖維化和間質(zhì)的病理積分之間均無顯著性差異(P>0.05,余時(shí)間點(diǎn)UUO+SCF-G組大鼠間質(zhì)纖維化和間質(zhì)的病理積分均低于UUO組(P<0.05。說明SCF聯(lián)合G-CSF動(dòng)員骨髓干細(xì)胞,可以減輕UUO模型大鼠腎間質(zhì)纖維化程度和腎間質(zhì)損傷程度。相關(guān)分析表明,在UUO組和UUO

32、+SCF-G組中,術(shù)后5-28天的腎間質(zhì)纖維化積分與腎小管間質(zhì)的病理積分均呈正相關(guān),提示間質(zhì)纖維化積極參與了腎間質(zhì)的損傷。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn),在UUO組和UUO+SCF-G組中腎小管周微血管指數(shù)與腎間質(zhì)纖維化的病理積分、小管間質(zhì)的病理積分均呈負(fù)相關(guān),進(jìn)一步證實(shí)了腎小管周圍毛細(xì)血管的損傷可能是影響腎小管間質(zhì)進(jìn)行性損傷的重要決定因素11,12。通過改善腎小管間質(zhì)PTC的形成,可能成為治療腎小管間質(zhì)損害的一個(gè)新的途徑。UUO組與UUO+SCF-G組大鼠在術(shù)后第14天,血清肌酐水平水平與Sham組相比均增高,隨后在術(shù)后的第21、28天肌酐仍持續(xù)高于Sham組。在本研究中,雖未發(fā)現(xiàn)UUO組與UUO+SCF-

33、G組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)血清肌酐水平有顯著差異,可能與對(duì)側(cè)腎臟代償有關(guān),但兩組中腎小管周微血管指數(shù)與血清肌酐水平均呈負(fù)相關(guān),同時(shí)UUO+SCF-G組大鼠間質(zhì)纖維化和間質(zhì)損害的程度均低于UUO組,因此我們有理由相信SCF聯(lián)合G-CSF動(dòng)員骨髓干細(xì)胞有助于減少PTC丟失,并進(jìn)而減輕腎間質(zhì)纖維化和間質(zhì)損害,保護(hù)腎功能。SCF是一種可由骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的酸性糖蛋白,其直接對(duì)造血干細(xì)胞及早期祖細(xì)胞的生存、增殖、分化和粘附及骨髓微環(huán)境起著關(guān)鍵作用,可協(xié)同多種造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)早期祖細(xì)胞生成定向祖細(xì)胞,使其集落數(shù)增加。而G-CSF是作用于晚期祖細(xì)胞的生長(zhǎng)因子,能促進(jìn)靜息期干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期,致其大量增殖

34、,并通過降低細(xì)胞表面黏附分子數(shù)量促進(jìn)骨髓干細(xì)胞脫離骨髓進(jìn)入血液循環(huán)13。兩者是骨髓干細(xì)胞的強(qiáng)力動(dòng)員劑,聯(lián)合應(yīng)用可使外周血中骨髓干細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。已有多項(xiàng)研究證明,骨髓干細(xì)胞有向缺血損傷組織歸巢的特征14,15,炎癥損傷可能是干細(xì)胞歸巢的始動(dòng)因素16,17。目前大多數(shù)研究將CD34+細(xì)胞視為骨髓干細(xì)胞,并以CD34+細(xì)胞作為骨髓干細(xì)胞動(dòng)員生物學(xué)活性與臨床應(yīng)用的源細(xì)胞標(biāo)志。由于UUO模型病變特點(diǎn)以腎間質(zhì)損害為主,為此本實(shí)驗(yàn)以免疫組化CD34+細(xì)胞在腎臟間質(zhì)的定位,檢測(cè)骨髓干細(xì)胞歸巢至腎間質(zhì)部位的能力。結(jié)果顯示,在術(shù)后第5天,與Sham組相比,UUO組腎間質(zhì)CD34+表達(dá)細(xì)胞數(shù)目略有增多,UUO

35、+SCF-G組腎間質(zhì)CD34+表達(dá)細(xì)胞數(shù)目則明顯增多。當(dāng)然我們計(jì)數(shù)的CD34+表達(dá)細(xì)胞也包括了腎間質(zhì)微血管的內(nèi)皮細(xì)胞,但結(jié)合我們對(duì)微血管檢測(cè)的結(jié)果示UUO組及UUO+SCF-G組腎間質(zhì)微血管數(shù)量并不高于Sham組,因此我們認(rèn)為在UUO組及UUO+SCF-G組腎間質(zhì)中存在干細(xì)胞的增多,即UUO模型中存在干細(xì)胞的歸巢,進(jìn)一步證實(shí)了組織損傷形成的微環(huán)境是誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞歸巢的必備條件之一16。我們的結(jié)果還顯示,在不同時(shí)間點(diǎn)UUO+SCF-G組腎間質(zhì)CD34+表達(dá)細(xì)胞數(shù)目均明顯高于UUO組。提示單純的損傷因素存在下歸巢的干細(xì)胞數(shù)目較少,SCF 聯(lián)合G-CSF可以促進(jìn)干細(xì)胞的歸巢,這也許更有利于促進(jìn)損傷組

36、織的修復(fù)。事實(shí)上,機(jī)體的血管生成既受內(nèi)部基因調(diào)控,又受外部調(diào)節(jié)因子的影響。無論是在生理還是病理情況下, 無論在體外還是體內(nèi),VEGF均顯示出強(qiáng)大的促血管形成和血管維持能力。本研究結(jié)果顯示,在UUO組和UUO+SCF-G組術(shù)后均有一過性的VEGF mRNA表達(dá)增高,隨時(shí)間的延長(zhǎng),VEGF mRNA表達(dá)開始持續(xù)下降。相關(guān)分析表明,在UUO組和UUO+SCF-G組大鼠中,腎皮質(zhì)VEGF mRNA表達(dá)與腎小管周微血管指數(shù)均呈正相關(guān)。說明在單側(cè)梗阻性腎病中,VEGF是維持腎小管周微血管指數(shù)的重要保護(hù)性因素,一過性的VEGF mRNA表達(dá)增高也可能是機(jī)體的代償反應(yīng),早期VEGF表達(dá)與分泌增高有利于應(yīng)對(duì)微血

37、管的損傷及修復(fù)。UUO+SCF-G組術(shù)后VEGF mRNA表達(dá)下降出現(xiàn)的時(shí)間晚于UUO組,且在術(shù)后第14、21、28天VEGF mRNA表達(dá)水平及腎小管周微血管指數(shù)均高于同期UUO 組。說明SCF聯(lián)合G-CSF可以提高腎皮質(zhì)VEGF水平,延緩腎小管周微血管的丟失。有研究發(fā)現(xiàn),TSP-1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,抑制新生血管生成,是通過抑制生存基因(Bcl-2的表達(dá)、增加Bax基因的表達(dá)和活化細(xì)胞凋亡蛋白酶caspase-3而實(shí)現(xiàn)的18。本研究結(jié)果表明,UUO組TSP-1 mRNA表達(dá)水平在術(shù)后第5天即開始較假手術(shù)對(duì)照組明顯增高,且隨時(shí)間延長(zhǎng)TSP-1 mRNA表達(dá)進(jìn)一步增高。相關(guān)分析顯示,在UUO組和

38、UUO+SCF-G組大鼠中,腎皮質(zhì)TSP-1 mRNA表達(dá)與腎小管周微血管指數(shù)均呈負(fù)相關(guān)。對(duì)比分析TSP-1 mRNA表達(dá)與腎小管周微血管指數(shù)下降及腎組織病理的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)TSP-1 mRNA表達(dá)的增高先于腎小管周微血管指數(shù)下降及腎組織病理?yè)p害積分的明顯增高。說明在單側(cè)梗阻性腎病中,TSP-1是腎小管周微血管丟失的重要影響因素,TSP-1的測(cè)定有可能作為腎組織病理?yè)p害的早期指標(biāo)之一。UUO+SCF-G組TSP-1mRNA表達(dá)水平在術(shù)后第14天始較假手術(shù)對(duì)照組明顯增高,且在不同時(shí)間點(diǎn)均低于同期UUO組水平。同時(shí),UUO+SCF-G組腎小管周微血管指數(shù)均高于同期UUO組。說明SCF聯(lián)合G-CSF可以

39、延緩腎皮質(zhì)TSP-1增高水平,有助于減少腎小管周微血管的丟失。SCF聯(lián)合G-CSF延緩腎皮質(zhì)TSP-1增高的機(jī)制目前尚不清楚,推測(cè)可能與干細(xì)胞動(dòng)員后腎臟局部的微環(huán)境改變有關(guān)。綜上所述,SCF聯(lián)合G-CSF動(dòng)員的骨髓干細(xì)胞可以歸巢至受損的腎臟,有助于減少腎小管周微血管丟失,并進(jìn)而減輕腎間質(zhì)纖維化和間質(zhì)損害,保護(hù)腎功能,顯示出其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。其上調(diào)腎皮質(zhì)VEGF mRNA水平和下調(diào)TSP-1 mRNA水平,可能是其促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)及保護(hù)腎間質(zhì)微血管損傷的機(jī)制之一。參考文獻(xiàn)1 Kushibiki T, Nagata-Nakajima N, Sugai M, et al. Targeting o

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49、huanghongLaboratory of Pediatric Nephrology,The Second Xiangya Hospital of Cenrtal South University, Hunan Province Clinical Center of Pediatric Nephrology,Changsha(410011AbatractObjective To investigate the effects and possible mechanisms of bone marrow stem cell mobilization on renal peritubular c

50、apillary, fibrosis and renal function by combination of stem cell factor(SCF with granulocyte colony-stimulating factor(G-CSFin unilateral ureteral obstruction rats. Methods 128 healthy male Wistar rats were divided into four groups,Sham group ,SCF-G group , UUO group and UUO+SCF-G group. Random eig

51、ht rats of different groups were killed on the 5th, 14th, 21stand 28th day. Items were detected as follows: serum creatinin, counts of CD34 positive cell and counts of factor positive cell in renal interstitium, histopathologic changes in kidney slices and severity by interstitial fibrosis and inter

52、stitial lesion scores, vascular endothelial growth factor(VEGF and thrombospondin-1(TSP-1 mRNA expression in the renal cortex.Results The renal interstitial fibrosis and the loss of peritubular capillary appeared in two weeks after unilateral ureteral obstruction. The number of bone marrow stem cells homing in renal interstitium in UUO+SCF-G group was higher than that of UUO group and Sham group. The loss ofperitubular capillary in UU