1、石蠟切片免疫組化及免疫熒光染色方法1、組織的采集、固定和保存：采取組織后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4C固定1小時(shí)（根據(jù)組織大小和致密程度調(diào)整固定時(shí)間）或過(guò)夜方法二：采用bouins固定RT2h（6-8dtesis）orRT過(guò)夜（成年tesis）PBS緩沖液洗三次，每次5min,4C保存于70%乙醇中。2、組織的包埋、切片、展片及保存：固定后的樣品經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，52-54C石蠟包埋，常規(guī)切片，切片厚4-10m,貼于處理過(guò)的干凈載玻片上，37C烤片過(guò)夜，之后收集于載片盒中，RT密封保存。石蠟包埋：保存于4C70%乙醇中的組織樣品80%乙醇15min95%乙醇15min100

2、%乙醇15min21/2乙醇1/2二甲苯15min二甲苯透明5-10min1/2二甲苯1/2石蠟30min石蠟（1）石蠟（2）石蠟（3）包埋RT保存3、石蠟組織切片的免疫組化方法：密封保存于RT的組織切片二甲苯20min二甲苯（2）20min100%乙醇20min95%乙醇10min80%乙醇10min通風(fēng)櫥晾干，阻水筆在組織周?chē)?huà)圈切片在PBS中浸泡5min*2%TritonxRT10min切片qPBS中浸泡5min*33%H2O2RT10min切片qPBS中浸泡5min*3%胰酶RTJ0minRT 60minBlockingbuffer(3%BSA+5%NGS+%Tritonx-100in

3、PBS)傾去blockingbuffer,勿洗切片在PBS中浸胞 5 min*3一抗4Covernightinblockingbuffer取出切片復(fù)溫1h,切片在PBS中浸泡5min*3二抗inblockingbufferGAR1:200（GAM1100）,RT1h切片在PBS中浸泡5min*3DAB顯色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增強(qiáng)型DAB只翼1min即可。切片浸入PBS終止顯色，HE襯染1s,玻片架放入泡沫盒，流水沖洗15min,肉眼看到淡淡的紫色即可停止。若顏色太深，可用鹽酸乙醇分色12秒鐘（或更久）脫水85%乙醇5min95%乙

4、醇5min無(wú)水乙醇5min無(wú)水乙醇5min二甲苯（1）10min二甲苯（2）10min中性樹(shù)膠封片，室溫干燥保存4、石蠟組織切片的免疫熒光方法：密封保存于RT的組織切片二甲苯（2）20min100%乙醇20min95%乙醇10min80%乙醇10min通風(fēng)櫥晾干，阻水筆在組織周?chē)?huà)圈切片在PBS中浸泡5min*2%TritonxRT10min切片用PBS中浸泡5min*3切片'PBS中浸泡5min*3%胰酶RT10min切片在PBS中乎5min*3Blockingbuffer(3%BSA+5%NGS+%Tritonx-100inPBS)RT60min傾去blockingbuffer,勿洗一抗4Covernightinblockingbuffer取出切片復(fù)溫1h,切片在PBS中浸泡5min*3熒光二抗inblockingbufferGAR-cy31:1000,GAM-4881:1