1、藥物分析的方法學(xué)驗證所要做到的事項（一）新藥申報時， 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中分析方法必須驗證； 藥物生產(chǎn)工藝 變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時，則質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方 法必須進(jìn)行驗證； 2005 版藥典中分析方法驗證指導(dǎo)原則只規(guī)定了項 目和基本方法而沒有合格標(biāo)準(zhǔn)：附錄XIX A;中國GMP（98非常關(guān)注驗 證的過程 , 分析方法驗證不完善是常見的問題藥物分析檢驗時藥品生產(chǎn)的 GMP勺藥物分析的方法學(xué)驗證，是保 證藥物分析結(jié)果準(zhǔn)確性的前提和基礎(chǔ)，也是實現(xiàn)藥物分析檢測 GMP勺 必然要素。構(gòu)成藥物分析中的檢測方法驗證，這要涉及到以下些方面的內(nèi) 容：1、分析方法驗證成功的前提條件： （?。﹥x器已經(jīng)確認(rèn)、

2、校正并在有效期內(nèi) （ 2）經(jīng)過培訓(xùn)的人員（ 3） 可靠穩(wěn)定的對照品（4）可靠穩(wěn)定的實驗試劑 （5）確認(rèn)受試溶液的穩(wěn)定性，在規(guī)定時 間內(nèi)無降解。2、分析方法學(xué)驗證所要求驗證的內(nèi)容：（ 1）含量的測定 （2）雜質(zhì) 的含量測定 （3）藥物的定性鑒定 （4）藥物的含量均勻度測定 （5） 藥物的微生物檢測 （6）藥物的細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測驗證內(nèi)容：準(zhǔn)確度： 準(zhǔn)確度是指用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近 的程度，用百分回收率表示。測定回收率 R（recovery ）的具體方法可采用加樣回收試驗法來進(jìn)行 測定。加樣回收試驗已準(zhǔn)確測定藥物含量P的真實樣品+已知量A的對照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測定，測定值為M數(shù)據(jù)要求：

3、規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用 9 次測定結(jié)果評價，如制備高、中、低三個不同濃度樣品各測 三次精密度： （重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性精密度是指在規(guī)定條件 下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。用 偏差（d）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（變異系數(shù)，CV表 示。（ 1）重復(fù)性 （repeatability）：在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度; 在規(guī)定的范圍內(nèi)， 至少用 9 次測定結(jié)果評價， 如制備三個不同濃度樣品各測三次或把被測物濃度當(dāng)作100%，至少測 6 次進(jìn)行評價（ 2）中間精密度同一實驗室， 不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備所得結(jié)果的精密度( 3)

4、重現(xiàn)性 (reproducibility)不同實驗室，不同分析人員測定結(jié)果的精密度(4)數(shù)據(jù)要求：需報告SD RS併口可信限。專屬性： 指有其他成分(雜質(zhì)、降解物、輔料等)可能存在情況 下采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性， 能反映該方法在有共存物 時對供試物準(zhǔn)確而專屬的測定能力， 是指該法用于復(fù)雜樣品分析時是 否受到相互干擾程度的度量? 通常通過分析含有加了雜質(zhì)、 降解產(chǎn)物、 有關(guān)化學(xué)物質(zhì)或安慰劑成 分的樣品，將所獲分析結(jié)果與未加前述成分之樣品的測試結(jié)果進(jìn)行比 較，兩組測試結(jié)果之差即專屬性?鑒別反應(yīng) - 應(yīng)能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)別， 不含被 分析的樣品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有

5、關(guān)化合物，均應(yīng)呈負(fù)反應(yīng) ?含量測定和雜質(zhì)測定 - 色譜法和其他方法， 應(yīng)附代表性圖譜， 亦說 明專屬性。 圖中應(yīng)標(biāo)明各組份的位置， 色譜法中的分離度應(yīng)符合要求 ?雜質(zhì)可獲得的情況下，對于含量測定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料， 考察測試結(jié)果是否受干擾； 對于雜質(zhì)測定， 也可向試樣中加入一定量 的雜質(zhì)，考察雜質(zhì)間是否得到分離檢測限： 檢測限系指試樣在確定的實驗條件下，被測物能被檢測出 的最低濃度或含量。它是限度檢驗效能指標(biāo)，無需定量測定，只要指 出高于或低于該規(guī)定濃度即可。?非儀器分析目視法： 用已知濃度的被測物， 試驗出能被可靠地檢測 出的最低濃度或量?信噪比法 : 用于能顯示基線噪音的分析方法(儀

6、器分析方法)，是 把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進(jìn)行比較，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比 3： 1或2： 1 時的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測限?也可采用標(biāo)準(zhǔn)差法：空白值=0時；測定背景10次以上，求出 標(biāo)準(zhǔn)差c將。乘以三倍；在工作曲線上求出3 c相對應(yīng)的濃度X,即為方 法的檢出值； 空白值不等于 0； 測定背景 10次以上，求出標(biāo)準(zhǔn)差 c；將c乘以三倍；在工作曲線上求出 3 c相對應(yīng)的濃度X; 將求得的對應(yīng)濃度值加上空白值即得該方法的檢出限定量限 ( 1imit of quantitationLOQ )?指樣品中被測物能被定量測定的最低量,結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)

7、確度和 精密度要求?常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10 : 1時相應(yīng)的 濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定， 也可用儀器所測空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差 （SD的10倍為估計值，再經(jīng)試驗確定方法的實際測定下限 定量限：指樣品中被測物能被定量測定的最低量， 結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精 密度要求?常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10 : 1時相應(yīng)的 濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定， 也可用儀器所測空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD的10倍為估計值，再經(jīng)試驗確定方法的實際測定下限線性： 在設(shè)計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正 比關(guān)系的程度。線形通常用最小二乘法處理數(shù)據(jù)求得回歸曲線的斜率

8、（ Slope ）來表示。數(shù)據(jù)要求：至少需要五個濃度考察線形，需提供 相關(guān)系數(shù)、 y 截距（是檢定的可能偏差）、回歸斜率及方差等參數(shù)， 應(yīng)列出回歸方程數(shù)和線性圖注意：做線性時，應(yīng)注意盡量做的點多一點、線性濃度范圍寬 一點，這樣做的好處是：當(dāng)你在準(zhǔn)確度考察時，你做的回收率考察的 濃度就大些，配制溶液時就容易操作些，否者，在你做線性考察時， 你做的線性濃度范圍不寬， 那么你在考察回收率時， 你采用加入法考 察時的濃度變化范圍不寬，操作濃度很難控制，造成實際操作困難。 我碰到一個在做方法學(xué)研究的人， 由于她在考察線性時， 做的線性濃 度不大， 在做回收率時， 加入后的量造成回收率濃度超出線性考察范

9、圍的濃度， 我說那樣是不行的。 因為在做分析計算時又恰恰用了線性 關(guān)系來計算，結(jié)果肯定是值得懷疑，結(jié)果是不能令人肯定的！ （這是 經(jīng)驗總結(jié)） 范圍：指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性的條件下，測試方法適 用的高、低限濃度或量的區(qū)間。 范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線 性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。?原料藥和制劑含量測定范圍為 80%-120%；制劑含量均勻度范圍為 70%-130%；雜質(zhì)測定應(yīng)為被測雜質(zhì)匯報值到限度的 120%；溶出度應(yīng) 為測定范圍的± 20%，如規(guī)定了限度范圍，應(yīng)為下限的 -20%至上限的+20%例如緩釋片1h<20%,7h>70%則驗證范圍定為0-90

10、%。耐用性： 指測定條件稍有變動時，結(jié)果不受影響的承受程度，為 常規(guī)檢驗提供依據(jù)。 是衡量實驗室和工作人員之間在正常情況下實驗 結(jié)果重現(xiàn)性的尺度 ; 如果方法易受到分析條件的影響，或要求苛刻， 應(yīng)注明。典型的變動包括：分析溶液的穩(wěn)定性，提取時間等。 藥物分 析的方法學(xué)驗證事項（二）含量測定方法驗證的接收標(biāo)準(zhǔn)?容量分析法：用原料藥精制品 （含量 >99.5 ）或?qū)φ掌房疾旆椒ǖ?精密度，相對標(biāo)準(zhǔn)差一般應(yīng)不大于 0.2 ；進(jìn)行回收率試驗?；厥章室话阍?9.7100.3 %之間?UV 法：用適當(dāng)濃度的精制品進(jìn)行測定，其 RSD 一般不大于 1 。 制劑的測定，回收率一般應(yīng)在 98% 1 02

11、%之間；線性：吸光度 A 一般 在0.20.7 ,濃度點n = 5。用濃度c對A作線性回歸處理，得一直線 方程，r應(yīng)達(dá)到0.9999（n = 5），方程的截距應(yīng)近于零含量測定方法驗證 的接收標(biāo)準(zhǔn)?HPLC 法：?要求 RSD<2 %，回收率 98% 102%之間。?線性范圍：用精制品配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度點n應(yīng)為57,用濃度 c 對峰高 h 或被測物的響應(yīng)值之比進(jìn)行回歸處理，建立回歸方程, r 應(yīng)大于 0.999 ,截距應(yīng)趨于零分析方法驗證步驟：? 驗證方案的制訂? 驗證目的、方法改進(jìn)背景、?提供的原料藥和產(chǎn)品、儀器概要、試劑、對照品?待驗證的方法,項目,合格標(biāo)準(zhǔn)? 實施人員的培訓(xùn)? 參考文獻(xiàn)?驗證的實施?收集完整的驗證過程記錄和原始圖譜?復(fù)核?驗證報告?評價該方法是否通過驗證方法確認(rèn)和方法轉(zhuǎn)移?對新產(chǎn)品的方法驗證通常在產(chǎn)品開發(fā)階段完成；大規(guī)模生產(chǎn)后的驗證通常包括方法確認(rèn)和方法轉(zhuǎn)移?分析方法確認(rèn)是指當(dāng)國家標(biāo)準(zhǔn)或藥典標(biāo)準(zhǔn)擬變化或已經(jīng)變化時在本實驗室進(jìn)行的對所涉及產(chǎn)品是否適用的確認(rèn)實驗?確認(rèn)之前應(yīng)對新舊方法進(jìn)行核對，標(biāo)明所有變更細(xì)節(jié)?檢驗樣品的信息（批號、規(guī)格 ）,變更項目的接收標(biāo)準(zhǔn)?確認(rèn)試驗的樣品通常包括正常產(chǎn)品、穩(wěn)定性產(chǎn)品?方法轉(zhuǎn)移指檢驗方法由轉(zhuǎn)移方轉(zhuǎn)移至接收方時進(jìn)行的實驗。?流動相 PH （ ±0.5）? 流動相組成 （有機相 ±5% ）