1、促甲狀腺素檢測系統(tǒng)分析靈敏度的驗證執(zhí)筆人：陳政君指導(dǎo)老師：馮仁豐、顧志冬瑞金臨床醫(yī)學(xué)院摘要：目的：對BeckmanDxi800系統(tǒng)TSH項目的檢測低限、功能靈敏度等分析性能的驗證。方法：對血清空白、系列低濃度的TSH樣品進行批內(nèi)重復(fù)性實驗、天間重現(xiàn)性實驗，統(tǒng)計確定這些性能。結(jié)果：該系統(tǒng)的TSH檢測低限為0.003mIU/L，功能靈敏度為0.005mIU/L。與Beckman的產(chǎn)品說明書的指標有差異。結(jié)論：為了使實驗室對甲狀腺患者提供可靠的TSH低值結(jié)果，實驗室必須自己建立適合本實驗室條件的可報告低限。關(guān)鍵詞：TSH、檢測系統(tǒng)、檢測低限、功能靈敏度、前言甲狀腺疾病是目前最為常見的內(nèi)分泌紊亂疾病之

2、一。其發(fā)病過程通常緩慢而不易被察覺，癥狀常被患者疏忽，當出現(xiàn)明顯的疾病癥狀時，后果十分嚴重。因此采用敏感、特異的檢驗項目，準確、可靠地為臨床提供檢驗結(jié)果，是實驗室的責(zé)任。促甲狀腺素（TSH）的檢測相對于FT4檢測來說，對甲狀腺功能紊亂更具有特異性。臨床上通常使用TSH檢測項目來篩選疑似患者。出現(xiàn)TSH異常的患者，F(xiàn)T4才是之后最重要的測定項目。TSH在血清中的含量很低，真實反映TSH的低值是內(nèi)分泌臨床、與眾多公司努力的方向。目前，各大廠商所建立的檢測系統(tǒng)的靈敏度均號稱達到了10-3mIU/L的水平。按照質(zhì)量管理要求，在實驗室開始對患者標本進行檢測、報告結(jié)果前，應(yīng)對引進的檢測系統(tǒng)進行必要的性能確

3、認。因此，我們這次短暫的實驗，就是對瑞金醫(yī)院檢驗科近日使用的BeckmanDxi800型系統(tǒng)，進行分析靈敏度（檢測低限與功能靈敏度）的系列實驗。以期為該實驗室建立TSH必須的可報告定性與定量低限。材料和方法1檢測系統(tǒng)：BeckmanDxi800免疫測定檢測系統(tǒng)。使用雙夾心酶免化學(xué)發(fā)光方法。試劑為該系統(tǒng)的專用的人促甲狀腺素（hTSH）檢測試劑，包括專用的hTSH校準品。所有檢測過程完全按照系統(tǒng)規(guī)定程序進行校準、質(zhì)量控制、以及對樣品等進行檢測。每次檢測前，首先作校準。系統(tǒng)校準認可后，進行質(zhì)量控制檢測?？刂浦翟诳兀f明檢測結(jié)果有效。收集在控的檢測數(shù)據(jù)。該系統(tǒng)的檢測原理是：在標記了堿性磷酸酶的羊抗hT

4、SH抗體（酶結(jié)合物）、包被了羊抗大鼠抗體-大鼠抗hTSH抗體復(fù)合物的磁性顆粒存在下，樣品中的hTSH兩個位點與兩個抗hTSH抗體同時結(jié)合，形成了酶標的雙夾心（抗體-抗原-抗體）磁性顆粒復(fù)合物。經(jīng)磁性作用，將所有磁性顆粒分離、清洗后，加入堿性磷酸酶的發(fā)光底物（Lumi-Phos*530）。檢測反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光化學(xué)物的相對發(fā)光單位（RLU），在校準曲線上確定樣品中的hTSH含量。2實驗用的樣品準備：（1）空白樣品：參照Beckman產(chǎn)品說明書，配制30g/L的牛血清白蛋白（BSA）溶液為hTSH空白樣品。原料來自SIGMA公司的牛血清白蛋白干粉（BSA）。在該溶液中加入0.1疊氮鈉防腐。置冰箱保存，

5、備用。（2）系列低濃度hTSH溶液：將Beckman的hTHS100mIU/L校準液，用上述配制的空白樣品液進行稀釋。限于稀釋條件，對該稀釋溶液內(nèi)的實際hTSH含量，由BeckmanDxi800免疫測定檢測系統(tǒng)檢測確定。經(jīng)測定為hTSH1.29mIU/L。然后，再從該溶液作進一步的稀釋，形成系列低濃度的hTSH溶液。它們的hTSH含量分別是：0.003、0.006、0.013、0.026、0.052、0.077、0.103，0.129mIU/L。各個溶液在實驗時的編號分別依次為：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8,空白樣品編號為S0o所有溶液為8ml,足夠進行多天實驗。置冰箱保存?zhèn)?/p>

6、用。3實驗方法：（1）定性檢測低限的實驗方案：按照文獻1要求，對空白樣品進行批內(nèi)重復(fù)測定。記錄儀器上的檢測發(fā)光強度原始值（RLU）。對數(shù)據(jù)作均值、中位數(shù)、標準差等處理。以2.58倍的標準差對應(yīng)的發(fā)光強度，在系列低濃度曲線上確定檢測低限。我們考慮到批內(nèi)重復(fù)檢測的結(jié)果，也許與實際每天檢測狀況不同，因此，也采用以下的天間重復(fù)檢測結(jié)果，另外確定檢測低限。（2）定量的功能靈敏度的實驗方案：按照文獻1、2要求，對系列低濃度樣品在每天的上下午（相隔4小時以上）分別進行檢測。共進行了10天、20批的檢測。記錄檢測的發(fā)光強度原始值（RLU）。對數(shù)據(jù)作均值、中位數(shù)、標準差、CV等處理。（3）繪制hTSH低濃度與發(fā)

7、光強度關(guān)系的校準曲線。以系列溶液的稀釋比例關(guān)系，確定各個溶液內(nèi)hTSH的預(yù)期濃度。以該濃度為X,各個溶液檢測信號讀數(shù)均值減去天間S0均值所得差的值為Y,繪制校準曲線。若各個溶液檢測結(jié)果呈非正態(tài)分布，則以各溶液檢測信號讀數(shù)扣除天間S0中位數(shù)所得差值的中位數(shù)為Y,再和hTSH濃度為X繪制標準曲線。(4)在校準曲線上，確定2.58倍空白溶液標準差相當?shù)膆TSH濃度。確定為99%可能性的檢測低限。(5)以各個溶液的TSH預(yù)期濃度為X,各個溶液的天間重復(fù)CV為Y,繪制濃度與CV關(guān)系的曲線。從曲線上查閱相當于CV為20%的對應(yīng)hTSH濃度，即為功能靈敏度限值。二結(jié)果1 .空白溶液批內(nèi)重復(fù)結(jié)果：空白均數(shù)=1

8、3037.20,標準差SD批內(nèi)=144.62,CV批內(nèi)=1.11%。2 .10天、20批低hTSH結(jié)果的統(tǒng)計，見表1。表1:各低濃度hTSH溶液10天、20批重復(fù)檢測結(jié)果的歸納樣預(yù)期hTS發(fā)光強度中位數(shù)均值標準差品濃度范圍(RLU)(RLU)(RLU)號(mIU/L(RLUS0119671265812768.0484.113551S10.003131441375113810.8383.1S20.006S30.013S40.026S50.052S60.077S70.103S80.12914483148121598817153206722197723937306913408740253461384

9、894154498605406838215260.515307.6379.818223.518203.3682.622788.522993.0566.2326434231652092.563004.532636.142695.652204.963740.9注：儀器檢測的發(fā)光強度單位為相對發(fā)光單位（644.1813.91094.61549.9RLU）。通過EXCEL2003和SPSS11.0軟件計算，這九份樣品天間數(shù)據(jù)基本屬于正態(tài)分布，可以直接使用均值與標準差反映數(shù)據(jù)分布狀況。3定性的檢測低限的確定。（1）依據(jù)實驗批內(nèi)重復(fù)檢測的結(jié)果，我們以99的可能性作為確定性限值的標準。因此，每次實驗僅做一次

10、空白時，出現(xiàn)較空白均值大的99可能性的空白值，應(yīng)為2.58S空白。為：373.1RLU。從hTSH濃度與RLU關(guān)系上（圖1）可以確定：以批內(nèi)重復(fù)方式確定的hTSH定性檢測低限為：0.001mIU/L。（2）在實驗中，同一空白溶液的10天、20批重復(fù)的均值為：12768.0RLU,標準差為：484.1RLU。它的CV為3.80%?？瞻兹芤号鷥?nèi)的10次重復(fù)CV為1.11%，較天間的CV要小得多。由于實際檢驗工作是每天進行的，最好的估計空白變異應(yīng)是天間與批間的綜合。所以，若以本實驗中綜合的標準差484.1RLU去估計hTSH定性檢測低限的99限值為：0.00288mIU/L，約為0.003mIU/L

11、。以各樣品的hTSH預(yù)期濃度為X、以RLU均值為Y,繪制hTSH在BeckmanDxi800系統(tǒng)上的校準曲線，見圖1。（皿）檢測低限標準曲線圖1:低hTSH濃度與發(fā)光強度(RLU)半對數(shù)校準曲線注：X為hTSH濃度；y為發(fā)光RLU值。4.定量可報告低限的確定將表1的所有各個濃度的RLU均值，減去S0的均值，為含有相應(yīng)hTSH量，在系統(tǒng)中相對于空白溶液的基礎(chǔ)讀數(shù)實際具有的檢測發(fā)光量值。將這些量值與原標準差求由各自對應(yīng)的CV。所有結(jié)果見表2。表2:各hTSH低濃度的檢測均值(扣除空白后)、CV值表S7樣品號S1S2S3S4S5S6(mIU/L)1043.82539.65435.310225.019

12、868.129927.63943(RLU)SD(RLU)383.1379.8682.6566.2644.1813.91094CV(%)36.7%15.0%12.6%5.5%3.2%2.7%2.8%以各樣品的hTSH預(yù)期濃度為X、以RLU的CV為Y,繪制hTSH在BeckmanDxi800系統(tǒng)上低濃度與重復(fù)變異程度的關(guān)系。見圖2。在圖2上，可以確定，當CV為20%時，對應(yīng)的hTSH濃度為：0.00535mIU/LmIU/L,約為：0.005mIU/L。這即為本系統(tǒng)的功能靈敏度，也是系統(tǒng)可以報告定量結(jié)果的低限值。圖2:hTSH在BeckmanDxi800系統(tǒng)上低濃度與重復(fù)變異程度的關(guān)系注：圖的X為

13、hTSH濃度（mIU/L;Y為重復(fù)CV（%）三討論：1.準確報告hTSH檢測結(jié)果的最低限值，一直是內(nèi)分泌臨床與有關(guān)廠商關(guān)注的熱點。早于1989年，著名的內(nèi)分泌專家Spencer4,5首先提由了以天間重復(fù)CV為20%時，對應(yīng)hTSH的濃度為實驗方法可以報告的最低量值，稱之為功能靈敏度。自此以后，由于該做法的可操作性，很快在廠商中廣泛應(yīng)用。最近，美國的國家臨床標準研究院（NICS,前身為NCCLS）發(fā)布了EP-17的標準化文件3。該文件首次在國際上提出確定空白低限（LOB）、檢測低限（LOD）、以及量值低限（LOQ）的定義和實驗方案。我們認為，這個文件在理論上可行，在具體實施中，對于如何確定量值低

14、限上，卻難以操作。文件中的LOB就是我們現(xiàn)在實驗的檢測低限；LOD就是文獻1中論述的生物檢測限。因此，本次實驗限于時間有限、大量低濃度標本收集困難、以及尚未徹底了解文件的統(tǒng)計做法等的局限，沒有按照NICS的標準化文件要求實施。還是采用了文獻1的做法，確定BeckmanDxi800系統(tǒng)對hTSH檢測的檢測低限與功能靈敏度。2實驗的時間緊湊，但是又要較好地體現(xiàn)實際和客觀的狀況，采取進行10天、20批實驗的綜合方案。這樣的做法，均較以往報道的要求全面。以綜合實驗得到的天間、批間的空白溶液變異，確定99的定性檢測低限，可以如實反映瑞金實驗室條件下，每天實驗的空白波動實際情況。該值約為0.003mIU/

15、L，與Beckman公司報告的可報告定量低限數(shù)值相符；但是在概念上是完全不同的。定性低限是因空白波動導(dǎo)致低于這樣量值的hTSH樣品，無法被定性確認，樣品中確實含有hTSH。定量低限是：除了空白波動外，樣品單次檢測的信號可以有99的可能性一定為可檢測信號，予以定量的最低值。初步實驗結(jié)果表明，由實驗室對諸如hTSH重要項目自行確定限值的意義。4 實驗結(jié)果的功能靈敏度為：0.005mIU/L。即：今后瑞金實驗室報告hTSH定量結(jié)果的最低限值不得低于該值。報告的定量值不可從0開始。今后在具體使用時建議：可報告范圍只說明可報告的上限；定量低限是報告定量結(jié)果的最低值；介于定性與定量低限間的結(jié)果不可報告具體

16、量值，只說明可檢出；不可將定性限值作為定量報告的低限。尤其在參加國際或國家的實驗室間質(zhì)量評估中，對于低于功能靈敏度的報告，只能報告無法檢測具體量值。5 美國的臨床實驗室管理法規(guī)要求實驗室對于新引入的免疫檢測系統(tǒng)，除了進行精密度、準確度、可報告范圍等性能的確認外，還應(yīng)對如hTSH項目增加分析靈敏度性能的確認。所有一切都是為了確保每個患者檢測結(jié)果的可靠。本實驗是對于分析靈敏度中確定兩個重要性能指標（檢測低限、功能靈敏度）的實踐。由于在領(lǐng)會文件與文獻的意義上不深、在真正參與檢驗實踐上缺少鍛煉，所以，還應(yīng)在以后的學(xué)習(xí)與實驗中繼續(xù)努力。四參考文獻1 馮仁豐，分析靈敏度（檢測限）。臨床檢驗質(zhì)量管理技術(shù)基礎(chǔ)。第1版上海科技技術(shù)文獻出版社，2003.72 方積乾，孫振球。衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)。第5版人民衛(wèi)生出版社，2003.83 ProtocolforDeterminationofLimitsofDetectionandLimitsofQuantitation。NCCLSDocumentEP-17A。Wayne,PA:NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards,2004。4 SpencerCA。Thyroidprofilingforthe1990s：freeT4es