1、單克隆抗體制備方案細(xì)胞融合前準(zhǔn)備一、動(dòng)物免疫1.1動(dòng)物選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的純系Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠齡8周左右。為避免小鼠反應(yīng)不佳或免疫過(guò)程中死亡，可同時(shí)免疫34只小鼠。1.2免疫原制備15ml離心管15個(gè)、50ml離心管7個(gè)、10ml注射器5支、Tip頭20個(gè)、電子天平、CFA、PBS、CFA（使用前需震搖）50g /只：稱取80mg乳鐵蛋白溶于10mlPBS中，充分混勻。取1ml加入7mlPBS中，混勻。從中取1ml加9mlPBS于50ml離心管中，加10mlCFA于該離心管中。反復(fù)搖晃，用注射器反復(fù)推吸。取一滴加入水中，如果不立即散開(kāi)，則乳化好。4保存。100g/只：稱取

2、80mg乳鐵蛋白溶于10mlPBS中，充分混勻。取1ml加入3mlPBS中，混勻。從中取1ml加9mlPBS于50ml離心管中，加10mlCFA于該離心管中。反復(fù)搖晃，用注射器反復(fù)推吸。取一滴加入水中，如果不立即散開(kāi)，則乳化好。4保存。150g/只：稱取90mg乳鐵蛋白溶于10mlPBS中，充分混勻。取1ml加入2mlPBS中，混勻。從中取1ml加9mlPBS于50ml離心管中，加10mlCFA于該離心管中。反復(fù)搖晃，用注射器反復(fù)推吸。取一滴加入水中，如果不立即散開(kāi)，則乳化好。4保存。200g/只：稱取80mg乳鐵蛋白溶于10mlPBS中，充分混勻。取1ml加入1mlPBS中，混勻。從中取1m

3、l加9mlPBS于50ml離心管中，加10mlCFA于該離心管中。反復(fù)搖晃，用注射器反復(fù)推吸。取一滴加入水中，如果不立即散開(kāi)，則乳化好。4保存。250g/只：稱取100mg乳鐵蛋白溶于10mlPBS中，充分混勻。取1ml加入1mlPBS中，混勻。從中取1ml加9mlPBS于50ml離心管中，加10mlCFA于該離心管中。反復(fù)搖晃，用注射器反復(fù)推吸。取一滴加入水中，如果不立即散開(kāi)，則乳化好。4保存。1.3實(shí)驗(yàn)步驟初次免疫：50g、100g、150g、200g、250g抗原溶于PBS中，加等體積的福氏完全佐劑（CFA）腹腔和皮下注射。（共25只小鼠，每組5只，兩只采用背部皮下注射，共1ml，0.2

4、ml/點(diǎn)，3只采用腹腔注射）3周后第二次免疫：與初次免疫等量的抗原溶液加等體積加福氏不完全佐劑（IFA），腹腔和皮下注射3周后第三次免疫：與初次免疫等量的抗原溶液加等體積加IFA，腹腔和皮下注射，5天后內(nèi)眥靜脈或斷尾取血以ELISA間接法測(cè)效價(jià)23周后加強(qiáng)免疫：取初次免疫抗原一半的量溶于PBS，靜脈或脾內(nèi)緩慢注射，以免動(dòng)物發(fā)生過(guò)敏性休克而死亡。34天后取脾細(xì)胞融合腹腔注射大鼠、小鼠一般一人即可注射：以左手大拇指與食指執(zhí)住鼠兩耳及頭部皮膚，腹部向上，將鼠固定在手掌間，必要時(shí)，以左手無(wú)名指及小指夾住鼠尾；右手持連有5號(hào)針頭的注射器，將針頭從下腹部朝頭方向刺入腹腔，回抽無(wú)回血或尿液，表示針頭未刺入肝

5、、膀胱等臟器，即可進(jìn)行注射。進(jìn)行腹腔注射時(shí)應(yīng)注意：1、針頭刺入部不宜太近上腹部或太深，以免刺破內(nèi)臟。2、針頭與腹腔的角度不宜太小，否則容易刺入皮下。3、用的針頭不要太粗，以免藥液注射后從注射孔流出。注射后用棉球按一下注射部位。4、為避免注射后藥液從針孔流出，也可在注射時(shí)先使針頭在皮下向前推一小段距離，然后再刺入腹腔。 皮下注射皮下注射較簡(jiǎn)單，一般都取背部及后腿皮下。注射時(shí)用左手拇指及食指輕輕捏起皮膚，右手持注射器將針頭刺入，固定后即進(jìn)行注射。注射器針頭不易進(jìn)入，硬進(jìn)容易折斷針頭，故給這些動(dòng)物作皮下注射時(shí)不應(yīng)選背部皮膚。一般狗、貓多在大腿外側(cè)；豚鼠在后大腿內(nèi)側(cè)或小腹部；大鼠可在側(cè)下腹部。兔在背部

6、或耳根部注射。1.4 注意事項(xiàng)免疫時(shí)抗原的劑量應(yīng)根據(jù)其免疫原性制定，若免疫原性較弱，需在50100g基礎(chǔ)上增加。商品化的福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻?？乖芤旱捏w積不能大于佐劑的體積，否則很難乳化好。一般首次注射時(shí)佐劑和抗原溶液的比例為1:1。佐劑加入抗原后一定要充分混合成乳劑，混合的方法有研磨法和注射器混合法。乳化完全與否的鑒定方法是將一滴乳劑滴入水中，如立即散開(kāi)，則未乳化好；如保持完整不散開(kāi)，呈滴狀漂在水面則為乳化完全。乳化過(guò)的物質(zhì)放置一段時(shí)間出現(xiàn)油水分層也表明未乳化好。測(cè)抗體效價(jià)的方法有ELISA間接法、免疫雙擴(kuò)散法、環(huán)狀實(shí)驗(yàn)等。用雙向免疫法測(cè)定時(shí)效價(jià)達(dá)到1：16

7、以上可用于融合實(shí)驗(yàn)；用ELISA方法測(cè)定時(shí)效價(jià)達(dá)到1：16000后可用于融合。皮下注射給藥皮下注射給藥是將藥液推入皮下結(jié)締組織，經(jīng)毛細(xì)血管、淋巴管吸收進(jìn)入血液循環(huán)的過(guò)程。作皮下注射常選項(xiàng)背或大腿內(nèi)側(cè)的皮膚。操作時(shí)，常規(guī)消毒注射部位皮膚，然后將皮膚提起，注射針頭取一鈍角角度刺入皮下，把針頭輕輕向左右擺動(dòng)，易擺動(dòng)則表示已刺入皮下，再輕輕抽吸，如無(wú)回血，可緩慢地將藥物注入皮下。拔針時(shí)左手拇、食指捏住進(jìn)針部位片刻，以防止藥物外漏。二、脾淋巴細(xì)胞1. 試劑4%的臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取4g臺(tái)盼藍(lán)，加少量蒸餾水研磨后，再加蒸餾水至100ml，用濾紙過(guò)濾，4保存。使用時(shí)需用0.1mol/L的PBS稀釋至0.4（w/

8、v），即1ml 4%的臺(tái)盼藍(lán)加9ml 0.1mol/L的PBS。RPMI-1640培養(yǎng)液10%FCS-1640培養(yǎng)液2. 試驗(yàn)步驟加強(qiáng)免疫3天后摘除眼球放血，收集血清留作抗體檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照。試管靜置3060min后，將血塊輕輕剝離管壁，3000r/min離心1520min，吸取上清（血清）4冰箱保存?zhèn)溆?。脫椎處死小鼠，浸泡?5酒精中消毒1min在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌手術(shù)剪刀剪開(kāi)小鼠左側(cè)皮膚，暴露腹膜，打開(kāi)腹腔，在無(wú)菌條件下取出脾臟置于盛有10ml不完全RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中，輕輕洗去脾臟上的紅細(xì)胞并細(xì)心剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織，于盛有10ml的RPMI-1640培養(yǎng)液的無(wú)菌平皿中過(guò)不銹鋼篩

9、網(wǎng)用注射器針芯研磨脾臟后用玻璃吸管吹打數(shù)次制成細(xì)胞懸液，移入10ml離心管中。沉降大塊的結(jié)締組織，把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中以RMPI-1640培養(yǎng)液充滿50ml離心管，配平后在室溫下以1000r/min離心10min，棄上清用約10ml的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液重懸重復(fù)步驟計(jì)數(shù)活細(xì)胞：把細(xì)胞懸液稀釋到約個(gè)/ml，將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板。用移液槍取0.9ml細(xì)胞懸液和0.1ml濃度0.4的臺(tái)盼藍(lán)工作液于EP管中，充分混勻中靜置12min，不超過(guò)5min。如果染色時(shí)間太久，細(xì)胞將下沉或受損，而且部分活細(xì)胞也會(huì)著色。用加樣器小心混勻細(xì)胞懸液后，立即用微量加樣器將其加于

10、血球計(jì)數(shù)板，置于倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，不被染色。活細(xì)胞數(shù)大于80%為合格。3. 注意事項(xiàng)取樣計(jì)數(shù)前應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液。數(shù)細(xì)胞的原則是只計(jì)數(shù)完整的細(xì)胞，鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。若細(xì)胞壓在格線上時(shí)，只計(jì)上側(cè)和左方的。操作時(shí)注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的2倍，細(xì)胞數(shù)為2×108左右。三、飼養(yǎng)細(xì)胞1012周齡Balb/c小鼠脫椎處死，浸泡于75酒精，消毒3min5min用注射器抽取5

11、ml預(yù)冷的10%的FCS-1640培養(yǎng)液注射到小鼠腹腔（嚴(yán)禁刺破腸管）并用手指輕揉3min5min后，用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)小鼠腹部一小口，用圓頭尖吸管吸出并移入50ml離心管中。吸的過(guò)程一定不要刺破腸管以免細(xì)菌污染。室溫1200r/min離心5min6min棄上清液，用10%胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105個(gè)/ml將細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板，每孔100l，放入37CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).四、骨髓瘤細(xì)胞1.骨髓瘤細(xì)胞介紹目前應(yīng)用最多的是Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0-Ag14（簡(jiǎn)稱SP2/0）細(xì)胞株。骨髓瘤細(xì)胞適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基

12、。細(xì)胞的最大密度不得超106個(gè)/ml，一般擴(kuò)大培養(yǎng)以110稀釋傳代，每35天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為1620小時(shí)。一般在融合前兩周就應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行復(fù)蘇。SP2/0細(xì)胞為懸浮或輕微貼壁生長(zhǎng)，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。在細(xì)胞融合的前一天用新鮮的10%FCS-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×105個(gè)/ml，次日取約1×1076×107對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（即培養(yǎng)15h20h）的骨髓瘤細(xì)胞，于室溫1000g（3000r/min）離心10min收集沉淀，以無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸并計(jì)數(shù)。此時(shí)細(xì)胞形態(tài)良好，觀察形態(tài)完整，排列整齊，密度為0.1×1061&

13、#215;106個(gè)/ml。經(jīng)胎盼藍(lán)染色活細(xì)胞數(shù)>95%。SP2/0細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞株，一般注射到小鼠體內(nèi)約1周左右就可以使小鼠致死。在其狀態(tài)萎靡的時(shí)候就可以用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗出其腹腔中的細(xì)胞，分離SP2/0細(xì)胞。整個(gè)過(guò)程要保證無(wú)菌，否則就前功盡棄了。為了防止骨髓瘤細(xì)胞（次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶HGPRT缺陷株）變異出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，在融合前骨髓瘤細(xì)胞株可在含有15g/ml或20g/ml的8氮鳥嘌呤(8-AG)的培養(yǎng)基內(nèi)適應(yīng)性培養(yǎng)一周或定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，再轉(zhuǎn)入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12周即可用于融合。8-AG一般試劑公司都有（如Sigma），使用時(shí)需仔細(xì)看說(shuō)明，根據(jù)根據(jù)說(shuō)明配置相應(yīng)濃度的8-AG。2.細(xì)胞培

14、養(yǎng)每月用新潔爾滅或84消毒液擦拭無(wú)菌間的所有所有器件、地板和墻壁一次，進(jìn)行徹底消毒。一般在實(shí)驗(yàn)前用紫外燈照射無(wú)菌室3060min，實(shí)驗(yàn)做完后再用紫外燈照射30min。配合紫外線滅菌燈使實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常保持高度的無(wú)菌狀態(tài)。紫外燈開(kāi)啟時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，可激發(fā)空氣中的氧分子締合成臭氧分子，這種氣體分子具有很強(qiáng)的殺菌作用，可以對(duì)紫外線沒(méi)有直接照到的角落產(chǎn)生滅菌效果。由于臭氧有礙健康，在進(jìn)入操作之前應(yīng)先關(guān)掉紫外線燈，關(guān)后十分鐘即可進(jìn)入。實(shí)驗(yàn)前開(kāi)啟超凈工作臺(tái)內(nèi)紫外燈，照射1030min，然后讓超凈工作臺(tái)預(yù)工作10min15min，以除去臭氧和使工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)。進(jìn)入無(wú)菌培養(yǎng)室原則上應(yīng)按外科手術(shù)進(jìn)行洗手和著裝，即

15、穿戴無(wú)菌服、帽子和口罩，并換鞋。用后要清洗消毒備用。開(kāi)始操作前用75%酒精和0.2%新潔爾滅消毒手和前臂，洗手時(shí)要洗刷到肘部。使用過(guò)程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以75%酒擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在臺(tái)面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。定期檢測(cè) CO2鋼瓶的壓力、CO2培養(yǎng)箱中CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無(wú)菌水，每周更換）。使用完畢，用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦拭工作臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周（切

16、不可用酒精擦拭有機(jī)玻璃擋板）。用過(guò)的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上，然后加少許清洗劑，以超聲波洗滌30min左右，(如無(wú)超聲波洗滌器可用軟毛刷輕輕刷洗干凈)，撈出晾干，再在鉻酸洗液中浸泡6-18h(或過(guò)夜)后，自來(lái)水清洗10-15遍，雙蒸水清洗3-4遍，晾干，高壓消毒后即可使用。細(xì)胞要經(jīng)常凍存，只要細(xì)胞狀態(tài)好就將細(xì)胞凍存起來(lái)。生長(zhǎng)良好的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)完整,圓形明亮,排列整齊,密度為0.1×1061×106個(gè)/ml。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于90%95%。3.細(xì)胞傳代0.25%胰蛋白酶（消化25cm2培養(yǎng)瓶每瓶約需2ml，75cm2培養(yǎng)瓶每瓶約需6ml

17、）：0.25g胰蛋白酶加入100mlD-hanks液中，濾膜過(guò)濾除菌，分裝4保存。使用時(shí)溫度在37左右為宜。5ml吸管、Tip頭、加樣器、培養(yǎng)瓶4.細(xì)胞凍存4.1實(shí)驗(yàn)器材及試劑10%的DMSO凍存液配方：RPMI-1640培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO1.0ml，雙抗0.1ml，5.6%NaHCO30.1ml。NaHCO3可在超凈臺(tái)內(nèi)經(jīng)過(guò)濾膜除菌。DMSO在常溫下有毒，在配置凍存液時(shí)，注意保護(hù)自己，帶好手套。最好現(xiàn)配現(xiàn)用。凍存管、離心管、0.25%胰酶、0.4%的胎盼藍(lán)工作液、PBS、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、顯微鏡、-80冰箱、紗布4.2實(shí)驗(yàn)步驟選用指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，已經(jīng)長(zhǎng)滿的細(xì)胞凍存

18、復(fù)蘇后存活率低。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞需離心8001000r/min離心5min（選擇1000r/min，5min），棄上清。但骨髓瘤細(xì)胞絕大部分是貼壁生長(zhǎng)，需用胰酶消化35min。消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)損傷細(xì)胞，太短達(dá)不到預(yù)期效果。用在4冰箱放置3060min的凍存液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml10×106個(gè)/ml（選擇濃度在5×106個(gè)/ml）。用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，然后分裝入無(wú)菌凍存管中，每只凍存管加液11.5ml?？捎媚z帶密封。每個(gè)凍存管上標(biāo)明凍存時(shí)間、細(xì)胞名稱、操作者等。此外還應(yīng)記錄每個(gè)凍存管中的細(xì)胞數(shù)量。將凍存管在4

19、 放置30min。將凍存管移入-20冰箱內(nèi)30min。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至-801618小時(shí)（或隔夜）。最后勻速下降至液氮中。4.3注意-20不可超過(guò)1h，以防止胞內(nèi)冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡。原則上細(xì)胞在液氮中可儲(chǔ)存多年，但為妥善起見(jiàn)，凍存1年后應(yīng)再?gòu)?fù)蘇1次，然后再繼續(xù)凍存。常溫下DMSO對(duì)細(xì)胞有毒副作用，因此應(yīng)將凍存液在4條件下放置3060min后使用。5.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線5.1 MTT比色實(shí)驗(yàn)5.1.1檢測(cè)原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活

20、細(xì)胞的數(shù)量。MTT比色法計(jì)數(shù)為間接計(jì)數(shù)，先要作出細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測(cè)樣品的A質(zhì)計(jì)算出細(xì)胞數(shù)。5.1.2試劑及實(shí)驗(yàn)器材MTT溶液：一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，稱取250mgMTT于小燒杯中，加50mlPBS（0.01mol/L，pH7.4）在電磁攪拌機(jī)上攪拌30min，用0.22的微孔濾膜除菌，分裝，4保存，兩周內(nèi)有效。保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶消化液、DMSO、96孔培養(yǎng)板、10Tip頭、酶標(biāo)儀、振蕩混合器、顯微鏡、離心管制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，從1×1

21、07個(gè)/200/孔開(kāi)始在96孔平板中倍比稀釋至102個(gè)/200/孔，每個(gè)稀釋度3個(gè)孔。培養(yǎng)板置37培養(yǎng)4h后細(xì)胞貼壁，每孔中加入20MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h6h，終止培養(yǎng)，對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，需離心（1000r/min，5min），然后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150DMSO，振蕩10min，使甲臜充分溶解。選擇490nm波長(zhǎng)，以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的孔做空白對(duì)照調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔吸光度值。制作生長(zhǎng)曲線：調(diào)整細(xì)胞的濃度，按2×103個(gè)/200/孔接種在96孔板中，約接種10塊板，每塊板的接種孔數(shù)月20個(gè)。置37培養(yǎng)，每12h用MTT比色法測(cè)定一塊板中細(xì)胞的A值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出相應(yīng)的細(xì)胞

22、數(shù)，即可以時(shí)間軸為橫軸，光吸收值（A）為縱軸繪制出細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。注意避免血清的干擾，用含15%的胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高濃度的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值，使實(shí)驗(yàn)本底值增高。一般選用小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。呈色后盡量吸凈培養(yǎng)孔的培養(yǎng)液。5.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞培養(yǎng)瓶30個(gè)、臺(tái)盼藍(lán)、計(jì)數(shù)器、顯微鏡、計(jì)數(shù)板、蓋玻片收集細(xì)胞，胎盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為104/ml，在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入7ml，每過(guò)12h用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)其中的細(xì)胞數(shù)。SP2/0雖為半懸浮生長(zhǎng)，但懸浮細(xì)胞多為死細(xì)胞或狀態(tài)不好的細(xì)胞，每23天可吸掉培養(yǎng)液并加入等體積的培養(yǎng)液。吹打前用右手緊握培養(yǎng)瓶使其平放在手心，右手從右側(cè)

23、拍擊培養(yǎng)瓶壁45次，不要讓培養(yǎng)瓶晃動(dòng)劇烈而形成泡沫。6.細(xì)胞復(fù)蘇將超聲機(jī)設(shè)為加熱至40并等到溫度到達(dá)再開(kāi)始復(fù)蘇過(guò)程、15ml離心管、RPMI-1640培養(yǎng)液、含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液、CO2培養(yǎng)箱、Tip頭、低速離心機(jī) 培養(yǎng)液在恒溫水浴箱37預(yù)熱20min，備用。 從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入37水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。 將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，加入10倍以上基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）。 倒凈上清后加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，加入培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞濃度至105個(gè)/ml，CO2培養(yǎng)箱

24、中培養(yǎng)。 記錄復(fù)蘇日期。次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)【注意事項(xiàng)】1.  取細(xì)胞的過(guò)程中注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。此項(xiàng)尤為重要，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。2.  DMSO對(duì)細(xì)胞不是完全無(wú)毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的毒副作用較大，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)蘇溫度太慢，會(huì)造成細(xì)胞的損傷。DMSO最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。3.  離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后DMSO濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。4.  DMSO的濃

25、度在小于0.5%時(shí)對(duì)一般細(xì)胞沒(méi)有什么影響，還有一個(gè)說(shuō)法是1。所以10的凍存液加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無(wú)害濃度。五、細(xì)胞融合，選擇雜交瘤用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇（PEG）一般選用相對(duì)分子量為4000者，該分子量的PEG呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，與許多化學(xué)藥品不起反應(yīng)。常用濃度為50，pH值7.48.0（用10NaHCO3調(diào)整）。通常選用供氣相色譜用的高純度PEG做融合劑。融合前一天換新鮮培養(yǎng)液一次，次日用彎頭吸管輕輕吹下貼壁生長(zhǎng)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液洗3次（800r/min離心5min），再重懸于5ml

26、無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，置冰上備用。1.試劑及實(shí)驗(yàn)器材不加血清的RPMI-1640、離心管（50ml的約50個(gè)）、10ml吸管（約10支）、無(wú)菌棉簽（約一包）、50%的PEG（分子量4000，pH值7.48.0，約50ml）、HAT、HT、胎牛血清、24孔培養(yǎng)板（約50塊）、Tip頭（約100個(gè)）、較大的濾膜（約5個(gè)）2.實(shí)驗(yàn)步驟將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按101（108個(gè)脾細(xì)胞和107個(gè)小鼠骨髓瘤細(xì)胞）的比例在50ml離心管內(nèi)混合，加50ml無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液。室溫1200r/min離心8min。同法洗滌混合細(xì)胞2次。小心吸出上清，顛倒離心管使管口向下，用無(wú)菌棉球

27、吸凈殘留液體以避免稀釋PEG。輕敲離心管底部，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)，置離心管于水浴中，使其達(dá)到37加入37下預(yù)溫的0.8ml或者0.7ml50%的聚乙二醇（PEG），邊加邊搖晃離心管，此時(shí)肉眼可見(jiàn)有顆粒出現(xiàn)，滴加過(guò)程要求持續(xù)60s，37靜置90s在5min內(nèi)加入20ml 37預(yù)溫的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液以終止融合劑的作用，即第1min內(nèi)加入1ml，第2min內(nèi)加入2ml，后3min內(nèi)加入17ml，邊滴加邊搖動(dòng)。室溫800r/min離心7min沉淀細(xì)胞棄上清，輕敲離心管底部，加25ml含20%小牛血清的HAT培養(yǎng)液。HAT（50×）用時(shí)取10ml加入490ml10FCS-1640

28、培養(yǎng)液中。加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的24孔板內(nèi)，每孔加0.5ml。放入5%CO2飽和濕度的37培養(yǎng)箱中培育第4天后更換HAT培養(yǎng)液（輕輕吸上清液，切勿吸出固定于孔底的細(xì)胞，補(bǔ)加一些液體至一定的高度，根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞）第14、16日加入HT培養(yǎng)液。HT培養(yǎng)液（100×）在用取5ml加495ml10%FCS-1640培養(yǎng)液中過(guò)濾除菌，分裝保存。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，雜交瘤細(xì)胞出現(xiàn)后，吸取上清液，檢查抗體，及早液氮凍存?zhèn)浞莺涂寺』?.注意事項(xiàng) 在10天左右可觀察到大而明亮、立體感強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞在1020天出現(xiàn)，但也有在1個(gè)月左右才能出現(xiàn)的。而且每個(gè)

29、細(xì)胞群落明顯。 融合實(shí)驗(yàn)最大的失敗原因是污染，融合成功的關(guān)鍵是提供一個(gè)干凈的環(huán)境以及適宜的無(wú)菌操作技術(shù)。 融合的關(guān)鍵除了無(wú)菌操作之外就是動(dòng)作一定要輕柔，而且一定要混勻不然在鏡下會(huì)出現(xiàn)成團(tuán)的細(xì)胞，影響本就不高的融合率。 融合后雜交瘤不生長(zhǎng)：在保證融合技術(shù)沒(méi)有問(wèn)題的前提下主要考慮下列因素1.PEG有毒性或作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。2.牛血清的質(zhì)量太差，用前沒(méi)有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。3.骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。4.HAT有問(wèn)題，主要是A含量過(guò)高或HT含量不足。 雜交瘤的選擇：當(dāng)細(xì)胞集落面積超過(guò)培養(yǎng)孔的1/10以上時(shí)，即可檢測(cè)抗體陽(yáng)性孔，連續(xù)三次檢測(cè)逐漸升高或維持在同一水平者，則可以做克隆化，一部分則冷藏起來(lái)長(zhǎng)期保種用

30、。六、抗體檢測(cè)（ELISA間接法）1.實(shí)驗(yàn)儀器酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，洗板機(jī)，聚乙烯96孔微量反應(yīng)板，微量加樣器，1.5ml離心管。2.實(shí)驗(yàn)試劑1. 包被用抗原：轉(zhuǎn)基因的人乳鐵蛋白和-LA2. 酶標(biāo)抗抗體（酶標(biāo)二抗）：兔抗小鼠IgG-HRP或兔抗鼠IgM-HRP3. 包被液（碳酸鹽緩沖液pH9.5）：Na2CO3 1.59g，NaHCO3  2.93g，加800ml水溶解，定容至1000ml加0.02%的NaN3，0.22膜過(guò)濾，4保存4. 洗滌緩沖液（0.01mol/LpH7.4的PBS-T）：pH7.4的PBS：在1000ml蒸餾水中溶解Nacl 8.0g，KH2PO4 0.2

31、g，Na2HPO4 1.1g，KCl 0.2g，以HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，高壓下滅菌20min，保存于室溫。取0.5ml0.05%的Tween20與1000mlPBS配制成洗滌緩沖液5. TMB 底物溶液：稱取固體TMB 溶于DMSO 配成1mg/mlTMB溶液，4避光保存。用前要檢查其狀態(tài)，若有凝固，可用手溫將其融化。底物緩沖液（pH5.0）： 檸檬酸1.02g ，NaHPO4.12H2O3.68g溶于100ml 水中。4避光保存的30 H2O2。使用前按TMB：底物緩沖液：H2O2為100：900：1配置，如底物緩沖液9ml加TMB溶液 1ml加10l30%H2O2(即配即用)6

32、. 封閉液：10%的小牛血清（1ml小牛血清加到9ml1×PBS中混勻）7. 終止液：2mol/LH2SO43.實(shí)驗(yàn)步驟包被：用0.05mol/L的碳酸鹽包被緩沖液（pH值9.5）將抗原稀釋至8g/ml，每個(gè)聚乙烯微量反應(yīng)板的孔中加100l，4過(guò)夜。次日傾去凹孔內(nèi)的液體，用洗滌液洗35次。封閉：加入10%的小牛血清封閉液200l，37孵育12h，用洗滌液洗35次加樣：加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）100l于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37孵育12h，洗滌，同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照加酶標(biāo)抗體：加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）100l，37孵育12h，用洗滌液洗滌，最后一遍用雙蒸水

33、（DDW）洗滌加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液100l，37孵育2030min終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2mol/L硫酸50l結(jié)果判定：若陰性對(duì)照孔無(wú)色或接近無(wú)色，陽(yáng)性對(duì)照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié)果。也可在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。七、雜交瘤細(xì)胞的克隆化（有限稀釋法）在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔依次加入100l飼養(yǎng)細(xì)胞液（約含1.0×105個(gè)腹腔細(xì)胞）制備待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液：用含10%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至10個(gè)細(xì)胞/ml，每孔接種量為0.1ml細(xì)胞懸液，即每孔含1

34、個(gè)細(xì)胞。37、5% CO2培養(yǎng)710天，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆或者在倒置顯微鏡下能夠觀察到雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/3面積即可檢測(cè)抗體；標(biāo)出只有單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔，取上清作抗體檢測(cè)。取抗體檢測(cè)陽(yáng)性孔消化分離細(xì)胞，并轉(zhuǎn)種于24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。并凍存。注意事項(xiàng)：在顯微鏡下確定培養(yǎng)孔中的細(xì)胞數(shù)時(shí)，應(yīng)特別注意觀察孔的周邊，細(xì)胞折光弱，不易觀察，最好兩個(gè)人進(jìn)行確認(rèn)?？寺〉臅r(shí)間一般越早越好，但不宜太早，太早細(xì)胞性狀不穩(wěn)定，數(shù)量少也易丟失?？寺』年?yáng)性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)后，還會(huì)因?yàn)榧?xì)胞突變或特定染色體的丟失，使部分細(xì)胞喪失產(chǎn)生抗體的能力，所以需要再次或多次克隆培養(yǎng)?？寺』拇螖?shù)多少由分泌能力強(qiáng)弱和抗原的免疫

35、強(qiáng)弱而決定，一般說(shuō)，免疫性強(qiáng)的抗原克隆次數(shù)可少一些，但至少要35次克隆才能穩(wěn)定。八、雜交瘤細(xì)胞的凍存選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在凍存前一天最好更換新鮮的10%FCS-1640培養(yǎng)液除去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，加入新鮮的10%FCS-1640培養(yǎng)液，用吸管吸取培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打貼附在瓶壁上的細(xì)胞，使細(xì)胞均勻分散懸浮1000r/min離心10min，棄上清液。細(xì)胞沉淀用10%二甲基亞砜保護(hù)液制成懸液，使成1.0×107細(xì)胞/ml取樣，用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到2002000個(gè)/毫升，和0.4的胎盤藍(lán)溶液按1:1輕輕混合后，用移液槍點(diǎn)樣到血球計(jì)數(shù)板，置于倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)，因活細(xì)胞排

36、斥臺(tái)盼蘭，不被染色，其中藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞。存活率應(yīng)在95%以上 分裝冷凍管，冷凍管要將蓋子蓋緊，每瓶0.51ml，在酒精燈上封口冷凍管 置4冰箱2h 將有布袋包裹的冷凍管移入液氮罐氣態(tài)部分（-70）暫放15h，最后沉入液氮中（-195）九、單克隆抗體的生產(chǎn)及純化1.動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)單抗成年Balb/c小鼠（5月齡）腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠0.30.5ml，7天后使用收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，用生理鹽水洗滌兩次，1500r/min離心10min取樣，用胎盤藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，重新用生理鹽水配制成5×106個(gè)細(xì)胞/ml的懸液給每只小鼠腹腔注射0.5ml處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞間

37、隔5天后，每天觀察小鼠腹水的產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時(shí)，皮膚有緊張感，即可用針頭抽提腹水，一般可連續(xù)收集23次，通常每只小鼠可收集510ml腹水，其單克隆的量可達(dá)到510mg/ml2000r/min離心腹水5min，除去細(xì)胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測(cè)定抗體效價(jià)，分裝-70凍存?zhèn)溆谩?.單克隆抗體的純化（飽和硫酸銨鹽析沉淀法）2.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑生理鹽水：0.9gNaCl溶于100ml蒸餾水中，高壓滅菌0.01mol/LpH7.4PBS：在1000ml蒸餾水中溶解Nacl 8.0g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4 1.1g，KCl 0.2g，以HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，高壓下滅菌20min，保存于室溫。2.1.3. 飽和硫酸銨（SAS）溶液：稱取400g硫酸銨溶于500ml蒸餾水，加熱到7080，攪拌使大部分晶體溶解，室溫靜置過(guò)夜，可見(jiàn)部分硫酸銨結(jié)晶析出，沉于瓶底，上清即位飽和硫酸銨溶液。pH約為5，以28%氨水調(diào)pH值至7.2.過(guò)濾備用2.1.4. 磁力攪拌袋，透析袋2.2實(shí)驗(yàn)步驟腹水4 12000r/m