1、轉錄組學研究技術及轉錄組學研究技術及其應用其應用目錄：目錄：一、轉錄組簡介二、主要技術及其原理三、與蛋白質(zhì)組研究進展比較四、轉錄組學應用五、參考文獻一、轉錄組簡介一、轉錄組簡介 1、概念 2、轉錄組學 3、相關知識 1 1、概念、概念 遺傳學中心法則表明, 遺傳信息在精密的調(diào)控下通過信使RNA(mRNA)從DNA傳遞到蛋白質(zhì)。因此,mRNA 被認為是DNA與蛋白質(zhì)之間生物信息傳遞的一個“橋梁”,而所有表達基因的身份以及其轉錄水平,綜合起來被稱作轉錄組(Transcriptome)。轉錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉錄出來的所有RNA的總和,主要包括mRNA和非編碼RNA(non

2、-coding RNA, ncRNA)。2 2、轉錄組學、轉錄組學 研究生物細胞中轉錄組的發(fā)生和變化規(guī)律的科學就稱為轉錄組(transcriptomics)。轉錄組學（transcriptomics），是一門在整體水平上研究細胞中基因轉錄的情況及轉錄調(diào)控規(guī)律的學科。簡而言之，轉錄組學是從RNA水平研究基因表達的情況。3 3、相關知識、相關知識（1）四大組學基因組轉錄組蛋白質(zhì)組代謝組解釋人類生老病死奧秘的四大組學（2）基因組學 基因組學（英文genomics），研究生物基因組和如何利用基因的一門學問。用于概括涉及基因作圖、測序和整個基因組功能分析的遺傳學分支。該學科提供基因組信息以及相關數(shù)據(jù)系統(tǒng)

3、利用，試圖解決生物，醫(yī)學，和工業(yè)領域的重大問題。1基因組發(fā)展趨勢圖基因組發(fā)展趨勢圖（3）蛋白質(zhì)組學 蛋 白 質(zhì) 組 學 （proteome ）一詞， 源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組（genome）兩個詞的雜合，意指“一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識，這個概念最早是在1995年提出的。蛋白質(zhì)組的研究不僅能為生命活動規(guī)律提供物質(zhì)基礎，也能為眾多種疾病機理的闡明及攻克提供理

4、論根據(jù)和解決途徑（4）代謝組學 代謝組學(metabonomicsmetabolomics)是效仿基因組學和蛋白質(zhì)組學的研究思想，對生物體內(nèi)所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式，是系統(tǒng)生物學的組成部分。其研究對象大都是相對分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。先進分析檢測技術結合模式識別和專家系統(tǒng)等計算分析方法是代謝組學研究的基本方法。 代謝組學研究進展代謝組學研究進展二、主要技術及其原理二、主要技術及其原理1、基因芯片技術(Microarray)2、基因表達系列分析技術(Serialanalysis of gene expression，SAGE)3、大規(guī)模平行

5、測序技術(Massively parallel signature sequencing，MPSS)4、RNA測序技術(RNAsequencing，RNA-seq)。 1、基因芯片技術(Microarray) 在轉錄組研究中應用最早及最廣泛的為基因芯片技術(Microarray)，首先從待檢測樣品中提取RNA，并利用熒光標記的核苷酸將其反轉錄成cDNA，經(jīng)過標記的核苷酸序列可與基因芯片特定位點上的探針雜交，經(jīng)檢測雜交信號而獲取細胞基因表達信息?；蛐酒韴D基因芯片原理圖2、基因表達系列分析技術(SAGE) 基因表達系列分析技術 技術是一種基于測序技術、開放式的、快速高效的分析細胞基因表達狀態(tài)

6、的方法，該技術不需任何基因序列的信息，能夠全局性地檢測所有基因的表達水平。3、大規(guī)模平行測序技術( MPSS) MPSS 技術是對SAGE 技術的改進，但其原理都是基于短標簽測序(Tag-based sequencing)的方法。MPSS技術可獲得更長的短標簽，因而精度更高；此外，MPSS 技術特有的微球熒光測序可直接高通量讀出序列，簡化了測序過程。4、RNA測序技術(RNAsequencing，RNA-seq) RNA 測序技術(RNA-seq)新一代高通量基因組測序儀的迅速發(fā)展(Solexa，454 GS-FLX，SOLiD，tSMS)不僅給基組領域帶來革命性的突破，同時也給轉錄組檢測方法

7、帶來重大革新。采用類似SAGE 技術和MPSS 技術的理念，新一代高通量基因組測序儀可以通過測定細胞全部轉錄產(chǎn)物序列，通過序列比對得到最后的轉錄組，一個新的測定轉錄組的“RNA 測序”法出現(xiàn)了，該技術稱為RNA 測序技術(RNA-seq)。RNA-seq技術可以提供更多信息，可以得到用基因芯片難以得到的轉錄可變剪接序列；該技術對低表達基因的檢測更加準確，并且可以定量確定轉錄水平。 RNA-Seq RNA-Seq 原理原理 把上述高通量測序技術應用到由mRNA 逆轉錄生成的cDNA 上, 從而獲得來自不同基因的mRNA 片段在特定樣本中的含量, 這就是mRNA 測序或 mRNA-Seq, 同樣原

8、理, 各種類型的轉錄本都可以用深度測序技術進行高通量檢測, 統(tǒng)稱作RNA-Seq。該技術3首先將細胞中的所有轉錄產(chǎn)物反轉錄為cDNA 文庫(利用最新的SMS 技術可略去這一步, 直接對RNA 進行測序19), 然后將cDNA 文庫中的DNA 隨機剪切為小片段(或先將RNA 片段化后再反轉錄), 在cDNA 兩端加上接頭利用新一代高通量測序儀測序, 直到獲得足夠的序列, 所得序列通過比對(有參考基因組)或從頭組裝(de novo assembling)(無參考基因組)形成全基因組范圍的轉錄 1RNA-Seq RNA-Seq 實驗流程圖實驗流程圖RNA-Seq RNA-Seq 技術優(yōu)勢技術優(yōu)勢1(

9、1)數(shù)字化信號；直接測定每個轉錄本片段序列,單核苷酸分辨率的精確度,可以檢測單個堿基差異、基因家族中相似基因以及可變剪接造成的不同轉錄本的表達,同時不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音問題,能覆蓋信號超高的動態(tài)變化范圍。(2)高靈敏度：能夠檢測到細胞中少至幾個拷貝的稀有轉錄本。(3)任意物種的全基因組分析；無需預先設計特異性探針, 因此無需了解物種基因信息,能夠直接對任何物種進行轉錄組分析,這對非模式生物的研究尤為重要,例如Wang等、Xiang等和 Vera等利用RNA-Seq技術分別對白粉虱、海鱸魚和蝴蝶轉錄組進行了研究。同時能夠檢測未知基因,發(fā)現(xiàn)新的轉錄本,并精確地

10、識別可變剪切位點及cSNP,UTR 區(qū)域。(4)更廣的檢測范圍：高于6 個數(shù)量級的動態(tài)檢測范圍, 能夠同時鑒定和定量稀有轉錄本和正常轉錄本; 而芯片對過低或過高表達的基因缺乏敏感性, 因而動態(tài)檢測范圍小。此外, RNA-Seq 重復性好, 無需技術重復, 而且起始樣品比芯片技術要少得多, 尤其適用于來源極為有限的生物樣品分析, 如癌癥干細胞。三、與蛋白質(zhì)組研究進展比較三、與蛋白質(zhì)組研究進展比較 轉錄組與蛋白質(zhì)組比較研究發(fā)現(xiàn)，總體而言其間的相關性不高。根據(jù)數(shù)據(jù)的類型不同可以將現(xiàn)有的研究分為4類：單點比較、兩點差異比較、多點時序比較和多點非時序比較。對其差異原因的研究和分析表明：除了由實驗系統(tǒng)及數(shù)

11、據(jù)類型不同導致的差異外，轉錄蛋白質(zhì)合成各步驟受到的限制，以及在此過程中的分子調(diào)控也對其有重要的影響；而且不同基因，不同組織和細胞在不同狀態(tài)下可能也會有差異。因此，結合轉錄組和蛋白質(zhì)組的表達譜研究傾向于利用蛋白質(zhì)組和轉錄組研究的差異和互補性，同時對生物體特定狀態(tài)下的基因和蛋白質(zhì)表達水平進行全方位度量，以獲得表達譜的全景圖，并挖掘受到轉錄后調(diào)控的基因。四、轉錄組學應用四、轉錄組學應用1 1、轉錄組在代謝工程領域的應用、轉錄組在代謝工程領域的應用2 2、轉錄組學在藥用植物研究中的應用、轉錄組學在藥用植物研究中的應用3 3、轉錄組學在植物細胞特性的改造方面的應用、轉錄組學在植物細胞特性的改造方面的應用

12、1 1、轉錄組在代謝工程領域的應用、轉錄組在代謝工程領域的應用 動物細胞系目前已經(jīng)被廣泛用于蛋白質(zhì)藥物等產(chǎn)品的大量生產(chǎn)上，利用動物細胞表達蛋白其優(yōu)勢在于有助于蛋白質(zhì)正確折疊、組裝并進行翻譯后的修飾，目標蛋白質(zhì)可正常行使其功能。轉錄組分析在減少細胞代謝負擔、控制細胞貼壁性、調(diào)控細胞生長活性等方面都有成功的應用12 2、轉錄組學在藥用植物研究中的應用、轉錄組學在藥用植物研究中的應用 目前，1/3 以上的臨床用藥來源于植物提取物或其衍生物。隨著分子生物學向各個學科領域的滲透及蛋白質(zhì)組學和生物信息學的應用，闡明藥用植物天然活性成分生物合成途徑及其關鍵酶，實現(xiàn)關鍵酶基因的克隆與體外高效表達，利用現(xiàn)代生物

13、技術手段及次生代謝工程，大規(guī)模生產(chǎn)藥用植物的有效成分將成為未來發(fā)展方向之一。 通過對物種的轉錄組進行描述，能夠對理解物種的生物學和生物化學的各個方面提供新的信息。雖然藥用植物有效成分的化學和藥理學研究已經(jīng)具有良好的基礎，但是在天然活性成分生物合成途徑和調(diào)控方面研究還很薄弱。目前，該領域的研究主要集中在長春花、青蒿、紅豆杉和甘草等少數(shù)物種，這些研究多采用單基因研究策略。例如Collu G.等將候選細胞色素P450 基因轉化長春花的懸浮細胞，驗證了其具有10-香葉醇羥化酶的催化功能；SekiH.等利用昆蟲外源體內(nèi)共表達和酵母體外表達檢驗酶活的方法鑒定了甘草中的三萜甘草酸合成關鍵酶基因；Wildun

14、g MR & Croteau R. A采用同源探針篩選太平洋參紫杉cDNA文庫并結合GC-MS的方法，鑒定了紫杉醇生物合成中的關鍵酶TaxadieneSynthase 基因3 3、轉錄組學在植物細胞特性的改造方面的應用、轉錄組學在植物細胞特性的改造方面的應用 植物的生長發(fā)育及產(chǎn)量與外界環(huán)境密切相關，通過代謝工程手段可以顯著提高植物對環(huán)境脅迫的抗性，保護植物免受外界環(huán)境的不良影響。Seki等對擬南芥轉錄組分析，得到了44 個受干旱誘導基因以及19 個受冷誘導的基因，其中有12 個基因被確定為植物脅迫應答的重要調(diào)節(jié)因子CBF/DREB(C-repeat-binding-factor/deh

15、ydration-responsive-element-binding) 的靶基因。這些靶基因的確認對深入認識植物產(chǎn)生環(huán)境脅迫抗性的機理具有重要意義。Benedict 等將擬南芥的冷脅迫應答轉錄因子CBF1 轉入楊樹，使其冷耐受性明顯增強，同時發(fā)現(xiàn)楊樹中受擬南芥CBF1 調(diào)控的基因與擬南芥中相應基因具有高度一致性。該研究指出CBF/DREB1冷調(diào)控機制可增強植株對多種逆境的抵抗性五、參考文獻五、參考文獻【1】轉錄組研究新技術：RNA-Seq 及其應用 祁云霞, 劉永斌, 榮威恒 遺傳HEREDITAS (Beijing) 2011 年11 月, 33(11): 11911202 ISSN 0253-9772【2】轉錄組與蛋白質(zhì)組的比較研究進展 吳松峰、朱云平、賀福初 生物化學與生物物理進展2005；32（2）【3】轉錄組平臺技術及其在代謝工程中的應用 史碩博、陳濤、趙學明 生物工程學報Chin J Biotech 2010, September 25; 26(9): 11871198 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061【4】轉錄組學平臺技術及其在植物抗逆分子生物學中的應用 付暢、黃宇 生物技術通報2012年第六期【5】A new RNASeq-based referen