1、基因工程基本操作程序上課用2 2、表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4 4、目的基因的檢測(cè)與鑒定、目的基因的檢測(cè)與鑒定C 1基因工程的正確操作步驟是基因工程的正確操作步驟是() 使目的基因與載體相結(jié)合使目的基因與載體相結(jié)合 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 驗(yàn)證目的基因的表達(dá)是否符合特定性狀驗(yàn)證目的基因的表達(dá)是否符合特定性狀要求要求 提取目的基因提取目的基因 A B C DC一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取( (一一) )、目的基因主要是、目的基因主要是_編碼蛋白質(zhì)的基因編碼蛋白質(zhì)的基因請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子（

2、二）、獲取目的基因的常用方法有哪些（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、從基因文庫(kù)中獲取、從基因文庫(kù)中獲取2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增3 3、人工合成、人工合成請(qǐng)閱讀請(qǐng)閱讀P9P9第一和二兩段第一和二兩段化學(xué)合成法化學(xué)合成法反（逆）轉(zhuǎn)錄法反（逆）轉(zhuǎn)錄法一、目的基因的獲取一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸?kù)中直接獲?。ㄒ唬幕蛭膸?kù)中直接獲取1.基因文庫(kù)：概念見(jiàn)基因文庫(kù)：概念見(jiàn)P92.種類(lèi)種類(lèi)基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因 如：如：cDNA文庫(kù)文庫(kù)提取

3、某種生物的全部提取某種生物的全部DNADNA限制酶限制酶一定大小的一定大小的DNADNA片段片段與載體連接與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)P 10基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNAmRNA單鏈單鏈cDNAcDNA雙鏈雙鏈cDNAcDNA片段片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接與載體連接cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)反（逆）轉(zhuǎn)錄酶反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶P 10cDNA文庫(kù)文庫(kù)1.1.概念：概念：3.3.原理：原理：含義：含義：P10P10以以_方式擴(kuò)增，即方式擴(kuò)增，即_（n n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）DNADNA

4、復(fù)制（堿基互補(bǔ)配對(duì)原則）復(fù)制（堿基互補(bǔ)配對(duì)原則）模板模板DNA、四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸)、能量、酶、能量、酶（熱穩(wěn)定（熱穩(wěn)定DNA聚合酶）、引物、溫度聚合酶）、引物、溫度指數(shù)指數(shù)2 2n n大量擴(kuò)增目的基因大量擴(kuò)增目的基因3.3.原理：原理：4.前提：前提： 過(guò)程過(guò)程 P10P10高溫變性（解旋為單鏈）高溫變性（解旋為單鏈）低溫退火（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）低溫退火（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）適溫延伸（在適溫延伸（在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 與模板互補(bǔ)的與模板互補(bǔ)的DNADNA雙鏈）雙鏈）PCRPCR過(guò)程：過(guò)程：a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈D

5、NADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火（、退火（復(fù)性復(fù)性55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的合成與模板互補(bǔ)的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈PCR技術(shù)擴(kuò)增與技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較PCR技術(shù)技術(shù)DNA復(fù)制復(fù)制相相同同點(diǎn)點(diǎn)原理原理原料原料條件條件不不同同點(diǎn)點(diǎn)解旋解旋方式方式場(chǎng)所場(chǎng)所酶酶結(jié)果結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核

6、苷酸四種脫氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋酶催化體外復(fù)制體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶聚合酶細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整個(gè)形成整個(gè)DNA分子分子B B下列有關(guān)下列有關(guān)PCR技術(shù)的敘述正確的是技術(shù)的敘述正確的是A.作為模板的作為模板的DNA序列必須不斷的加進(jìn)每一次的擴(kuò)增當(dāng)中序列必須不斷的加進(jìn)每一次的擴(kuò)增當(dāng)中B.作為引物的脫氧核苷酸序列必須不斷的加進(jìn)每一次的擴(kuò)增當(dāng)中作為引物的脫氧核苷酸序列必須不斷的加進(jìn)每一次的擴(kuò)增當(dāng)中C.反應(yīng)需要的反應(yīng)需要的DNA聚合酶必須不斷的加進(jìn)反應(yīng)當(dāng)中聚合酶必

7、須不斷的加進(jìn)反應(yīng)當(dāng)中D.反應(yīng)需要的反應(yīng)需要的DNA連接酶必須不斷的加進(jìn)反應(yīng)當(dāng)中連接酶必須不斷的加進(jìn)反應(yīng)當(dāng)中B B小結(jié)（二）、獲取目的基因的方法（二）、獲取目的基因的方法1 1、從基因文庫(kù)中獲取、從基因文庫(kù)中獲取2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增3 3、人工合成、人工合成1 1、從生物材料中直接提取、從生物材料中直接提取2 2、人工合成、人工合成反（逆）轉(zhuǎn)錄法反（逆）轉(zhuǎn)錄法根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列合根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列合成成DNADNAD4.下列獲取目的基因的方法中需要模板的是下列獲取目的基因的方法中需要模板的是() 從基因文庫(kù)中獲取目的基因從基因文庫(kù)中獲取目的基因利用利用PCR技術(shù)

8、擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法通過(guò)通過(guò)DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成合成儀利用化學(xué)方法人工合成DNA A B C DD質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA連接酶連接酶基因表達(dá)基因表達(dá)載體載體重組重組DNA質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口兩個(gè)切口獲得目的基因獲得目的基因DNA DNA 連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種 限制酶限制酶構(gòu)建過(guò)程構(gòu)建過(guò)程構(gòu)建目的（基因表達(dá)載體功能）構(gòu)建目的（基因表達(dá)載體功能） ？起初科學(xué)家把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載起初科學(xué)家把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載

9、體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)?；蛟诿藁w內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。 然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子( (抗抗蟲(chóng)基因首端蟲(chóng)基因首端) )，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力。科學(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入終止子基因的質(zhì)粒中插入終止子( (抗蟲(chóng)基因末端抗蟲(chóng)基因末端) )，導(dǎo)入，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力。棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力。 它們各自的作用是什么它們各自的作

10、用是什么?1、目的基因、目的基因2、啟動(dòng)子、啟動(dòng)子3、終止子、終止子4、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因5、復(fù)制原點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)基因表達(dá)載體的組成基因表達(dá)載體的組成1.1.用用_切割質(zhì)粒，切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出_。2.2.用用_切斷目切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。3.3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個(gè)重組，形成了一個(gè)重組 DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同( (

11、二二) )基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建B5、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合所需的條件是、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合所需的條件是( ) 同一種限制酶同一種限制酶 具有標(biāo)記基因的質(zhì)粒具有標(biāo)記基因的質(zhì)粒 RNA聚合酶聚合酶 目的基因目的基因 DNA連接酶連接酶 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 ATP A. B. C. D.D載體與表達(dá)載體的區(qū)別：載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNADNA片段。片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：限制酶和用到的工具酶：限

12、制酶和DNADNA連接酶，兩種連接酶，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必須以表目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必須以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。（一）轉(zhuǎn)化：（一）轉(zhuǎn)化： （二）方法（二）方法將目的基因?qū)⒛康幕驅(qū)?植 物 細(xì) 胞入 植 物 細(xì) 胞將目的基因?qū)⒛康幕驅(qū)?動(dòng) 物 細(xì) 胞入 動(dòng) 物 細(xì) 胞將目的基因?qū)⒛康幕驅(qū)胛⑸锛?xì)胞入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)Ca

13、2+ 處理法處理法 （感受態(tài)細(xì)胞）感受態(tài)細(xì)胞）目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持受體細(xì)胞內(nèi)維持_和和_的過(guò)程的過(guò)程受體細(xì)胞受體細(xì)胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力適用對(duì)象：雙子葉植物、裸子植物適用對(duì)象：雙子葉植物、裸子植物原理：原理：Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。上。過(guò)程：過(guò)程：優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) P12（2）基因槍法基因槍法單子葉植物單子葉植物（3）花粉管通道法花粉管通道法2 2

14、、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法方法：顯微注射法受體細(xì)胞：受精卵受體細(xì)胞：受精卵程序：程序：目的基因表達(dá)載體提純目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動(dòng)物新性狀動(dòng)物3 3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物特點(diǎn)：原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法： Ca2+處理法處理法 Ca2+處理細(xì)胞處理細(xì)胞 細(xì)胞壁通透性增大細(xì)胞壁通透性增大 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子分子類(lèi)型

15、類(lèi)型步步驟驟檢測(cè)內(nèi)容檢測(cè)內(nèi)容方法方法結(jié)果顯示結(jié)果顯示分子檢測(cè)分子檢測(cè)第第一一步步第第二二步步第第三三步步個(gè)體生物個(gè)體生物學(xué)水平鑒學(xué)水平鑒定定轉(zhuǎn)基因生物的轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插上是否插入了目的基因入了目的基因DNA分子分子雜交技術(shù)雜交技術(shù)是否顯示是否顯示出雜交帶出雜交帶目的基因是否目的基因是否轉(zhuǎn)錄出轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)（DNA和和mRNA）同上同上目的基因是否目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)翻譯出蛋白質(zhì)抗原抗原 抗體雜交抗體雜交同上同上包括做抗蟲(chóng)、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性包括做抗蟲(chóng)、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能以及抗性的程度；

16、基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較，以確定功能是否相同進(jìn)行活性比較，以確定功能是否相同歸納步驟D歸納: 基因工程的基本操作程序 獲取目的基因獲取目的基因u從基因文庫(kù)從基因文庫(kù)u利用利用PCRPCRu化學(xué)方法人工合成化學(xué)方法人工合成 構(gòu)建基因表達(dá)載體構(gòu)建基因表達(dá)載體u目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞u農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法 目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定u檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯u鑒定：鑒定：從生物材料中直接分離從生物材料中直接分離 人工的方法合

17、成人工的方法合成 限制酶限制酶 DNADNA連接酶連接酶 （3 3）運(yùn)送目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體一般選用）運(yùn)送目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體一般選用病毒或病毒或 ，后者的形狀呈，后者的形狀呈 。（4 4）由于重組）由于重組DNADNA分子成功導(dǎo)入受體細(xì)胞的效分子成功導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率率 ，所以在轉(zhuǎn)化后通常需要進(jìn)行，所以在轉(zhuǎn)化后通常需要進(jìn)行 操作操作（5 5）將人胰島素基因分別導(dǎo)入大腸桿菌與酵母菌，）將人胰島素基因分別導(dǎo)入大腸桿菌與酵母菌，從兩者中生產(chǎn)的胰島素在功能和從兩者中生產(chǎn)的胰島素在功能和 序列上序列上是相同的。是相同的。氨基酸氨基酸 篩選篩選 低低 環(huán)狀環(huán)狀 質(zhì)粒質(zhì)粒 限制酶和限制酶和DN

18、ADNA連接酶連接酶啟動(dòng)子啟動(dòng)子RNARNA聚合酶聚合酶農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化( (或基因槍、花粉管通道或基因槍、花粉管通道) )法法植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞的全能性(3)若要檢測(cè)若要檢測(cè)(2)中獲得的植物細(xì)胞染色體上是否含有目的基因，中獲得的植物細(xì)胞染色體上是否含有目的基因，可采用可采用_技術(shù)。而想要得知上述植物是否真的技術(shù)。而想要得知上述植物是否真的出油率高，應(yīng)如何做？出油率高，應(yīng)如何做？_。DNA分子雜交分子雜交將該植物制出的植物油與同等質(zhì)量的非轉(zhuǎn)基因植將該植物制出的植物油與同等質(zhì)量的非轉(zhuǎn)基因植物制出的植物油稱(chēng)重比較物制出的植物油稱(chēng)重比較3.為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。家應(yīng)用耐鹽基因培育出了