1、口蹄疫抗體檢測(cè)正向間接血凝法檢測(cè)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)1、方法依據(jù)本方法參照中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所綜防技術(shù)研究 組的“口蹄疫正向間接血凝抗原使用說(shuō)明書(shū)” 所提供的方法編制而 成。2、原理用已知血凝抗原檢測(cè)未知血清抗體的試驗(yàn)，稱為正向間接血 凝試驗(yàn)（IHA）?？乖c其對(duì)應(yīng)的抗體相遇，在一定的條件下會(huì)形成抗原抗體 復(fù)合物，但這種復(fù)合物的分子團(tuán)很小， 肉眼看不見(jiàn)。若將抗原吸附 （致敏）在經(jīng)過(guò)特殊處理的紅細(xì)胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原 和抗體的反應(yīng)靈敏性。這種經(jīng)過(guò)口蹄疫純化抗原致敏的紅細(xì)胞與口蹄疫 抗體相遇，紅細(xì)胞便出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。在間接血凝試驗(yàn)中，紅細(xì)胞具有抗原載體和指示劑雙重作 用。間接

2、 血凝具有簡(jiǎn)易、快捷、特異，既可定性又可定量等特點(diǎn)，是 實(shí)用的血清學(xué)檢測(cè)方法。3、適用范圍主要用于檢測(cè)口蹄疫免疫動(dòng)物血清抗體效價(jià)，以便制定正確 的免疫程序及檢查強(qiáng)制免疫效果，保護(hù)易感動(dòng)物免遭口蹄疫強(qiáng)毒感 染。也可用于口蹄疫血清學(xué)調(diào)查4、試驗(yàn)器材4.1 96孔110V型醫(yī)用血凝板，與血凝板大小相同的玻板。4.2微量移液器（50微升，25微升），配取液塑料咀若干。4.3微量振蕩器。4.4口蹄疫血凝抗原（經(jīng)過(guò)口蹄疫純化抗原致敏的紅血球） 。4.5口蹄疫陰性對(duì)照血清。4.6口蹄疫陽(yáng)性對(duì)照血清。4.7稀釋液。4.8待測(cè)血清（樣品）每份樣品血清量頭約0.5mL即可。5、試驗(yàn)方法5.1加稀釋液在血凝板（4.

3、1）上1-6排的1-9孔，第7排的1-4孔第6、7孔；第8排的1-12孔各加稀釋液（4.7）50微升。5.2稀釋待檢血清 取1號(hào)待檢血清(4.8)(50微升加入第1排第1孔，并將 塑咀插入孔底，右手拇指輕壓彈簧1-2次混勻(避免產(chǎn)生過(guò)多的氣 泡)，從該孔取出50微升移入第2孔，混勻后取出50微升移入第3孔直至第9孔混勻后取出50微升丟棄。 此時(shí)第1排1-9孔待檢血清的稀 釋度(稀釋倍數(shù))依次為：1:2(1)1:4(2)1:8(3)1:16(4)1:32(5)1:64(6)1:128(7)1:256(8)1:512( 9)。取2號(hào)待測(cè)血清(4.8)加入第2排：取3號(hào)待檢血清加入 第3排均按上法稀

4、釋。注意!每取一份血清時(shí)，必須更換塑咀一個(gè)。5.3稀釋陰性對(duì)照血清在血凝板(4.1)的第7排第1孔加陰性血清 (4.5)50微升， 對(duì)倍稀釋至第12孔，混勻后從該孔取出50微升丟棄。此時(shí)陰 性血清的稀釋倍數(shù)依次為1:2(1)1:4(2)1:8(3)1:16(4)。第6、7孔為稀釋液對(duì)照。5.4稀釋陽(yáng)性對(duì)照血清在血凝板(4.1)的第8排第1孔加陽(yáng)性血清(4.6)50微升， 對(duì)倍稀釋至第12孔，混勻后從該孔取出50微升丟棄。此時(shí)陽(yáng)性 血清的稀釋倍數(shù)依次為1:2-1:4096。5.5加血凝抗原 被檢血清各孔、 陰性對(duì)照血清各孔、 陽(yáng)性對(duì)照血清各孔、稀 釋液對(duì) 照孔均各加血凝抗原（4.4）（充分搖勻，

5、瓶底應(yīng)無(wú)血球沉淀）25微升。5.6振蕩混勻 將血凝板置于微量振蕩器上振蕩1-2分鐘，然后將血凝板放 在白紙 上觀察各孔紅血球是否混勻，不出現(xiàn)血球沉淀為合格。蓋上 玻板，室溫下或37C下靜置1.5-2小時(shí)判定結(jié)果，也可延至翌日判定。6、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)移去玻板， 將血凝板放在白紙上， 先觀察陰性對(duì)照血清1:16孔，稀釋液對(duì)照孔，均應(yīng)無(wú)凝集（血球全部沉入孔底形成邊緣整齊 的小圓點(diǎn)），或僅出現(xiàn)“+”凝集（血球大部沉于孔底，邊緣稍有少量血 球懸?。?。陽(yáng)性血清對(duì)照1:2-1:256各孔應(yīng)出現(xiàn)“+”凝集為合 格， （少量血球沉于孔底，大部血球懸浮于孔內(nèi)） 。在對(duì)照孔合格的前提下， 再觀察待檢血清各孔， 以呈現(xiàn)“+凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價(jià)。 例如1號(hào)待檢血清1-5孔呈現(xiàn)“+”凝集，67孔呈現(xiàn)“+”凝集，第8孔呈