1、染色質免疫沉淀染色質免疫沉淀染色質免疫沉淀Chromatin immunoprecipitation第一頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀基因型決定基因型決定(judng)表表型型第二頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀破壞破壞(phui)了基因型也就改變了表型了基因型也就改變了表型第三頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀但是，也有一些但是，也有一些(yxi)無法解釋的現(xiàn)象無法解釋的現(xiàn)象 在相應的基因堿基序列沒有發(fā)生變化的情況在相應的基因堿基序列沒有發(fā)生變化的情況(qngkung)(qngkung)下，一些生物體的表型卻發(fā)生了改變。下，一些生物體的表型卻發(fā)生了改變。 第四頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀什么什么

2、(shn me)是表觀遺傳學是表觀遺傳學?是是DNA及其染色質環(huán)境的穩(wěn)定改變，這些可遺傳的變化及其染色質環(huán)境的穩(wěn)定改變，這些可遺傳的變化(binhu)并不涉及并不涉及DNA序列的突變。序列的突變。第五頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀表觀表觀(bio un)遺傳修飾遺傳修飾 在不影響在不影響DNA序列的情況下改變基因組的修飾，不僅可以影序列的情況下改變基因組的修飾，不僅可以影響個體的發(fā)育，而且還可以遺傳下去。這類變異被稱為響個體的發(fā)育，而且還可以遺傳下去。這類變異被稱為“表觀遺表觀遺傳修飾傳修飾”，并被認為是導致，并被認為是導致(dozh)遺傳物質一致的孿生子出現(xiàn)個體遺傳物質一致的孿生子出現(xiàn)個體差

3、異的主要原因。差異的主要原因。第六頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀染色質重塑染色質重塑染色質重塑在廣義上是指染色質結構的動態(tài)調整或重新塑造染染色質重塑在廣義上是指染色質結構的動態(tài)調整或重新塑造染色質結構。在一些核內因子作用下，染色質色質結構。在一些核內因子作用下，染色質DNA與其包繞的與其包繞的核核心組蛋白心組蛋白之間親和力的變化或相對位置的改變使得染色質結構變得較之間親和力的變化或相對位置的改變使得染色質結構變得較為松散，為松散，DNA更易于暴露。染色質重塑就是通過這樣的變化來調控更易于暴露。染色質重塑就是通過這樣的變化來調控基因的轉錄?；虻霓D錄。在狹義上，染色質重塑專指由在狹義上，染色質重

4、塑專指由ATP提供能量的、通過依賴于提供能量的、通過依賴于ATP的染的染色質重塑復合物改變組蛋白與色質重塑復合物改變組蛋白與DNA的結合的結合(jih)狀態(tài)，在靠近核心組狀態(tài)，在靠近核心組蛋白的蛋白的DNA表面建立特殊的構象，使轉錄因子較易于接近表面建立特殊的構象，使轉錄因子較易于接近DNA的過程。的過程。 第七頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀染色質免疫沉淀技術染色質免疫沉淀技術(jsh)的發(fā)展使染色質重塑研究得以進步的發(fā)展使染色質重塑研究得以進步第八頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀實驗實驗(shyn)目的目的學習掌握學習掌握(zhngw)(zhngw)染色質免疫沉淀技術的基本原理與關染色質免疫沉

5、淀技術的基本原理與關鍵的操作步驟。鍵的操作步驟。第九頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀實驗實驗(shyn)原理原理第十頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀實驗實驗(shyn)流程流程一、交聯(lián)及染色質一、交聯(lián)及染色質DNA剪切條件的優(yōu)化剪切條件的優(yōu)化準備準備(zhnbi)一瓶接近長滿的一瓶接近長滿的HeLa細胞，向培養(yǎng)液中加入細胞，向培養(yǎng)液中加入37%的甲醛至終濃度的甲醛至終濃度為為1%，輕輕搖勻，在，輕輕搖勻，在37孵育孵育10分鐘分鐘。 甲醛的作用甲醛的作用 細胞的用量細胞的用量 交聯(lián)條件對實驗結果的影響交聯(lián)條件對實驗結果的影響棄培養(yǎng)液，用預冷至棄培養(yǎng)液，用預冷至4帶蛋白酶抑制劑帶蛋白酶抑制劑PMSF

6、的的1PBS洗細胞兩次，刮細胞洗細胞兩次，刮細胞到一個到一個2ml離心管，離心管，2000rpm，4離心離心4min收集細胞。收集細胞。 第十一頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀 甲醛的作用甲醛的作用 在各種交聯(lián)試劑中，甲醛（在各種交聯(lián)試劑中，甲醛（HCHO）的應用最為廣泛。甲醛的濃度、作用）的應用最為廣泛。甲醛的濃度、作用時間及交聯(lián)的溫度等均可能影響交聯(lián)的程度。甲醛可以通過賴氨酸、精氨酸和時間及交聯(lián)的溫度等均可能影響交聯(lián)的程度。甲醛可以通過賴氨酸、精氨酸和組氨酸以及那些組氨酸以及那些DNA的氨基和亞氨基基團之間的交聯(lián)，高效地在體內交聯(lián)蛋白質的氨基和亞氨基基團之間的交聯(lián)，高效地在體內交聯(lián)蛋白質-D

7、NA、蛋白質蛋白質-RNA以及蛋白質以及蛋白質-蛋白質，形成生物復合體，防止細胞蛋白質，形成生物復合體，防止細胞(xbo)內組分的重新分布。內組分的重新分布。除此之外，除此之外，HCHO可以忠實地保留染色質結構，而且在溫和條件下交聯(lián)很容易可以忠實地保留染色質結構，而且在溫和條件下交聯(lián)很容易逆轉。通常交聯(lián)所用的甲醛終濃度為逆轉。通常交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，在，在12-37作用作用30min。但是如果反應溫。但是如果反應溫度超過度超過30，本底就可能增加。因此，當必須在高溫進行交聯(lián)時，則應減少作用時間，本底就可能增加。因此，當必須在高溫進行交聯(lián)時，則應減少作用時間或甲醛濃度。過度交聯(lián)將影響細胞

8、的裂解，并且在超聲處理時不能獲得理想長度的或甲醛濃度。過度交聯(lián)將影響細胞的裂解，并且在超聲處理時不能獲得理想長度的DNA片段及影響片段及影響DNA的溶解。對于特別容易進行交聯(lián)的目的蛋白質（例如，組蛋白）的溶解。對于特別容易進行交聯(lián)的目的蛋白質（例如，組蛋白）需減少交聯(lián)時間或甲醛濃度。甲醛的交聯(lián)反應可被加入的甘氨酸終止。需減少交聯(lián)時間或甲醛濃度。甲醛的交聯(lián)反應可被加入的甘氨酸終止。第十二頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀細胞的用量細胞的用量 通常通常2.5108細胞足夠進行細胞足夠進行4次免疫沉淀。因此，一般為了保證用量，采取培次免疫沉淀。因此，一般為了保證用量，采取培養(yǎng)多瓶細胞，胰酶消化，收集在養(yǎng)

9、多瓶細胞，胰酶消化，收集在50ml離心管中，培養(yǎng)液重懸，計數(shù)。（一般分裝離心管中，培養(yǎng)液重懸，計數(shù)。（一般分裝1107細胞于一個細胞于一個EP管，用于免疫沉淀反應）。管，用于免疫沉淀反應）。 交聯(lián)條件對實驗結果的影響交聯(lián)條件對實驗結果的影響 對于不同的細胞類型，甲醛的濃度、交聯(lián)的長度或者交聯(lián)的溫度對于不同的細胞類型，甲醛的濃度、交聯(lián)的長度或者交聯(lián)的溫度(wnd)都都需要調整。如果交聯(lián)不充分，會導致不完全固定，則需要調整。如果交聯(lián)不充分，會導致不完全固定，則DNA片段的平均長度會小于片段的平均長度會小于500bp。交聯(lián)過度時細胞染色質難以用超聲波破碎，就算延長超聲波作用時間。交聯(lián)過度時細胞染色質

10、難以用超聲波破碎，就算延長超聲波作用時間也會導致重要原料的丟失。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不完全，產生假陰性，也會導致重要原料的丟失。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不完全，產生假陰性，交聯(lián)時間通常為交聯(lián)時間通常為5分鐘到分鐘到1個小時，具體時間根據(jù)實驗而定。個小時，具體時間根據(jù)實驗而定。 第十三頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀3. 用用500l預熱至室溫帶有蛋白酶抑制劑的預熱至室溫帶有蛋白酶抑制劑的SDS裂解液重懸并裂解裂解液重懸并裂解細胞細胞(xbo)，冰浴，冰浴10分鐘；分鐘；超聲波處理剪切染色質超聲波處理剪切染色質DNA，使其形成，使其形成300-1000 bp即大約即大約相當于相當于2-5個核小

11、體長度的片段；個核小體長度的片段； 超聲條件對實驗的影響及超聲注意事項超聲條件對實驗的影響及超聲注意事項 設置超聲破碎的條件設置超聲破碎的條件 酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別第十四頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀 超聲條件對實驗的影響及超聲注意事項超聲條件對實驗的影響及超聲注意事項 超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而都會引起蛋白質變性，進而(jn r)影響影響ChIP的效率。所以在超聲波的效率。所以在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續(xù)的超聲程序，保斷裂染

12、色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產生泡沫。總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。以免產生泡沫。總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。 第十五頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀 設置超聲破碎的條件設置超聲破碎的條件超聲處理的條件通?？梢栽O置為超聲處理的條件通?？梢栽O置為10秒每次，共秒每次，共3-4次，功率為次，功率為50W時設時設置為最大功率的置為最大功率的30%，采用，采用2mm超聲頭。不同超聲頭。不同(b tn)的超聲處理儀的超聲處理儀器的設置不太一樣，摸索超

13、聲條件時，可以先固定其他條件，先器的設置不太一樣，摸索超聲條件時，可以先固定其他條件，先確定每次超聲多長時間不會導致明顯發(fā)熱，然后摸索不同確定每次超聲多長時間不會導致明顯發(fā)熱，然后摸索不同(b tn)的超聲次數(shù)。直至找到比較合適的超聲次數(shù)可以使大部分基因組的超聲次數(shù)。直至找到比較合適的超聲次數(shù)可以使大部分基因組DNA斷裂成斷裂成200-1000bp大小。需要注意的是每次的超聲體積和細胞用大小。需要注意的是每次的超聲體積和細胞用量宜固定，否則就不能使用一個相對比較固定的超聲條件用于后續(xù)實量宜固定，否則就不能使用一個相對比較固定的超聲條件用于后續(xù)實驗。驗。 第十六頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀 酶

14、消化與超聲消化相比較的區(qū)別酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別Micrococcal Nuclease可以將染色質切成一到幾個核小體，比超聲波處理的結果更精可以將染色質切成一到幾個核小體，比超聲波處理的結果更精致，更均一。另外，酶反應的條件比較溫和，對致，更均一。另外，酶反應的條件比較溫和，對DNA和和DNA-蛋白復合物的損傷較蛋白復合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質適用于新鮮的細胞或組織樣品和冰凍樣品。小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質適用于新鮮的細胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時，經(jīng)常采用在研究組蛋白時，經(jīng)常采用(ciyng)沒經(jīng)過甲醛固定的沒經(jīng)過甲醛固定的Native ChIP

15、（N-ChIP）的研）的研究方法。因為究方法。因為N-ChIP沒經(jīng)過甲醛固定，超聲波處理會打斷組蛋白和沒經(jīng)過甲醛固定，超聲波處理會打斷組蛋白和DNA的結合，所的結合，所以只能選擇酶處理染色質的方法。對于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方以只能選擇酶處理染色質的方法。對于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。Millipore公司公司有商品化的有商品化的Micrococcal Nuclease處理的處理的ChIP試劑盒（試劑盒（EZ-Enzyme）提供。）提供。 第十七頁，共三十一

16、頁。染色質免疫沉淀Enzyme和和sonication處理結果比較處理結果比較(bjio)第十八頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀 超聲處理的條件需要優(yōu)化，各實驗組可采用不同的超聲波處理條件，比較超聲處理的條件需要優(yōu)化，各實驗組可采用不同的超聲波處理條件，比較(bjio)剪切效果。按以下步驟操作比較剪切效果。按以下步驟操作比較(bjio)各種條件下的剪切效果：各種條件下的剪切效果：a. 將超聲處理過的樣品離心收集上清（將超聲處理過的樣品離心收集上清（ 4 13000rpm離心離心10分鐘），加入分鐘），加入10l 0.5 M EDTA、20l 1M Tris-HCl pH6.5、2l 20mg/m

17、l蛋白酶蛋白酶K，45 孵育孵育0.5-1 小時；小時；b. 酚酚/氯仿抽提氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于一次，乙醇沉淀并重溶于20l的的ddH2O中，中，1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢查。瓊脂糖凝膠電泳檢查。實驗組實驗組12345678超聲次數(shù)超聲次數(shù)3691136911超聲功率超聲功率15W15W15W15W25W25W25W25W此頁內容不在正此頁內容不在正常的常的ChIP步驟中步驟中第十九頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀酚酚/氯仿氯仿(l fn)抽提步驟抽提步驟 按照按照1：1體積體積(tj)比加酚比加酚/氯仿充分混勻后離心，取上層水相至新管，氯仿充分混勻后離心，取上層水相至新管，加入加入1

18、/10體積體積3M Nacl，2倍體積無水乙醇，大轉數(shù)離心倍體積無水乙醇，大轉數(shù)離心5min第二十頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀5. 將超聲處理過的樣品在將超聲處理過的樣品在4 13000rpm離心離心10分鐘收集上清，分鐘收集上清，10倍稀釋，將其倍稀釋，將其移入一新移入一新(y xn)的的2ml EP管中；管中；6. 按照每按照每2ml稀釋后液體加入稀釋后液體加入75l的比例加入的比例加入蛋白蛋白A-瓊脂糖瓊脂糖/鮭精鮭精DNA (50%混懸混懸液液)，4搖動搖動30分鐘，預處理，分鐘，預處理，短暫離心短暫離心(700-1000rpm 4，小于，小于1分鐘分鐘)，收，收集上清液；集上清液；

19、 Beads的選擇的選擇 Input的設置的設置7. 向向2ml上清液中加入適量的抗乙?；M蛋白上清液中加入適量的抗乙?；M蛋白H3的抗體的抗體(20l)，4搖動過夜，陰搖動過夜，陰性對照組不加抗體同樣搖動過夜；性對照組不加抗體同樣搖動過夜； 抗體的選擇抗體的選擇 對照的設置對照的設置 二、免疫沉淀染色質二、免疫沉淀染色質DNA片段片段(pin dun)第二十一頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀 Beads的選擇的選擇(xunz) 利用目的蛋白質的特異抗體利用目的蛋白質的特異抗體(kngt)通過抗原通過抗原-抗體反應形成抗體反應形成DNA-蛋蛋白質白質-抗體復合物，然后使用抗體復合物，然后使用Ag

20、arose beads或或Magna beads沉淀此復合沉淀此復合物，特異性地富集與目的蛋白結合的物，特異性地富集與目的蛋白結合的DNA片段。再經(jīng)過多次洗滌，除片段。再經(jīng)過多次洗滌，除去非特異結合的染色質后，用去非特異結合的染色質后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復合物。洗脫免疫沉淀復合物。Magna beads是近年來出現(xiàn)的一種新型是近年來出現(xiàn)的一種新型beads，它使用方便，不像，它使用方便，不像Agarose beads那樣容易破裂，所以在操作過程中更簡單，而且免去了那樣容易破裂，所以在操作過程中更簡單，而且免去了離心的步驟，節(jié)省不少時間。離心的步驟，節(jié)省不少時間。Millipor

21、e公司最新推出的公司最新推出的Magna ChIP試劑盒就是采用這種試劑盒就是采用這種Magna beads。 第二十二頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀免疫免疫(miny)共沉淀和染色質免疫共沉淀和染色質免疫(miny)沉淀沉淀input設置設置在進行在進行(jnxng)免疫沉淀步驟前的樣品免疫沉淀步驟前的樣品第二十三頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀染色質免疫沉淀抗體染色質免疫沉淀抗體(kngt)的選擇的選擇ChIP Validated第二十四頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀 對照對照(duzho)的設置的設置 ChIP實驗至少應設立實驗至少應設立3種對照：未經(jīng)免疫沉淀的超聲處理種對照：未經(jīng)免疫沉淀

22、的超聲處理樣本（樣本（input）；陽性對照。一般用組蛋白抗體或）；陽性對照。一般用組蛋白抗體或anti-RNA Polymerase II抗體這些比較抗體這些比較(bjio)保守的在所有細胞中都能結合基保守的在所有細胞中都能結合基因的蛋白的抗體；因的蛋白的抗體； 陰性對照。即用一種無關抗體（或相應動物陰性對照。即用一種無關抗體（或相應動物的免疫前血清），與抗目的蛋白質抗體同時分別與交聯(lián)染色質樣的免疫前血清），與抗目的蛋白質抗體同時分別與交聯(lián)染色質樣本進行免疫沉淀反應；本進行免疫沉淀反應；選擇不與目的蛋白質結合的基因組區(qū)域作對選擇不與目的蛋白質結合的基因組區(qū)域作對照，即照，即“基因組對照基因組

23、對照”。 另外，還應根據(jù)對另外，還應根據(jù)對ChIP的不同的特殊應用設立不同的實驗對照。的不同的特殊應用設立不同的實驗對照。例如，試圖檢測目的蛋白質是否與某一推測的結合位點結合，則例如，試圖檢測目的蛋白質是否與某一推測的結合位點結合，則必須將此位點突變后作為對照；又如，欲測定突變細胞株中目的必須將此位點突變后作為對照；又如，欲測定突變細胞株中目的蛋白質與基因組蛋白質與基因組DNA結合情況時，必須用野生型細胞株作對照等。結合情況時，必須用野生型細胞株作對照等。 第二十五頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀8. 加加60l蛋白蛋白A-瓊脂糖瓊脂糖/鮭精鮭精DNA(50%混懸液混懸液)，4搖搖1小時；小時；

24、短暫離心短暫離心(700-1000rpm，4，小于，小于1分鐘分鐘) 收集沉淀，分別用低鹽免疫收集沉淀，分別用低鹽免疫復合物洗液、高鹽免疫復合物洗液、復合物洗液、高鹽免疫復合物洗液、LiCl免疫復合物洗液洗滌沉淀各一次，免疫復合物洗液洗滌沉淀各一次，每種液體每次用每種液體每次用1ml，搖動，搖動3-5分鐘后短暫離心收集沉淀。然后用同樣的分鐘后短暫離心收集沉淀。然后用同樣的方法用方法用TE緩沖液洗滌沉淀兩次緩沖液洗滌沉淀兩次三、三、PCR鑒定結合鑒定結合(jih)于乙?；M蛋白于乙?；M蛋白H3的的DNA片段片段10. 向上步所得沉淀中加入向上步所得沉淀中加入250l洗脫液洗脫液(1% SDS,

25、 0.1M NaHCO3)，震蕩，室溫孵，震蕩，室溫孵育育15分鐘，離心收集上清；分鐘，離心收集上清；第二十六頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀11.加入加入10l 0.5M EDTA、20l 1M Tris-HCl pH6.5、和、和2l 20mg/ml蛋白酶蛋白酶K，45孵育孵育0.5-1小時；小時；12.酚酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20l的的ddH2O中，取中，取1l作模板，按以下作模板，按以下配方加樣，配方加樣，PCR擴增實驗組和對照組以及擴增實驗組和對照組以及Input組的組的GAPDH啟動子序列，擴啟動子序列，擴增條件增條件951分鐘，分鐘，953

26、0秒、秒、5530秒、秒、7230秒、秒、30個循環(huán)，個循環(huán)，725分鐘，分鐘，1.5%瓊脂糖電泳檢查結果。瓊脂糖電泳檢查結果。 此步此步DNA純化可以選擇純化可以選擇(xunz)適當?shù)倪m當?shù)腄NA純化試劑盒純化試劑盒 PCR的策略的策略 第二十七頁，共三十一頁。染色質免疫沉淀PCR的策略的策略(cl) 引物的選擇取決于實驗目的。如若鑒定目的蛋白質特異結合的位點，除了引物的選擇取決于實驗目的。如若鑒定目的蛋白質特異結合的位點，除了必須設計一對能使擴增片段跨過該位點的引物外，至少還應設計一對擴增的必須設計一對能使擴增片段跨過該位點的引物外，至少還應設計一對擴增的DNA序列中沒有目的蛋白質結合位點的對照引物。對于平均長度為序列中