1、RNA-seqRNA-seq技術(shù)原理及應(yīng)用技術(shù)原理及應(yīng)用報告人：柳曉東報告人：柳曉東2012.4.162012.4.16 1 1、RNA-seqRNA-seq技術(shù)簡介技術(shù)簡介 2 2、RNA-seqRNA-seq技術(shù)原理技術(shù)原理 3 3、RNA-seqRNA-seq技術(shù)優(yōu)勢技術(shù)優(yōu)勢 4 4、RNA-seqRNA-seq技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用 5 5、RNA-seqRNA-seq發(fā)展前景發(fā)展前景一、一、RNA-seqRNA-seq技術(shù)簡介技術(shù)簡介RNA-SeqRNA-Seq(RNA sequencing)(RNA sequencing)， 即即RNARNA測序又稱轉(zhuǎn)錄組測序，就是把測序又稱轉(zhuǎn)錄組測序，

2、就是把mRNAmRNA，smallRNAsmallRNA和和 non-coding RNAnon-coding RNA（ncRNAncRNA）全部或者其中一些用高通）全部或者其中一些用高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序分析的技術(shù)。量測序技術(shù)進(jìn)行測序分析的技術(shù)。轉(zhuǎn)錄組的含義：轉(zhuǎn)錄組的含義： 轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有轉(zhuǎn)錄出來的所有RNARNA的總和的總和, , 主要包括主要包括mRNAmRNA和非編碼和非編碼RNA(noRNA(non-coding RNA, ncRNA)n-coding RNA, ncRNA)。 轉(zhuǎn)錄組

3、研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點，是解轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點，是解讀基因組功能原件和揭示細(xì)胞及組織分子組成所必需的。讀基因組功能原件和揭示細(xì)胞及組織分子組成所必需的。有關(guān)關(guān)ncRNA的一些知識識：非編碼非編碼RNA(ncRNA)RNA(ncRNA)主要包括有以下幾種：轉(zhuǎn)運主要包括有以下幾種：轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)RNA(tRNA)，核糖體核糖體RNA(rRNA)RNA(rRNA)，小核，小核RNA(snRNA)RNA(snRNA)，核仁小分子，核仁小分子RNA(snoRNA)RNA(snoRNA)，細(xì)胞質(zhì)小分子細(xì)胞質(zhì)小分子RNA(scRNA)RNA(scRNA)，不

4、均一核，不均一核RNA(hnRNA)RNA(hnRNA)及小及小RNARNA(microRNA,miRNA)(microRNA,miRNA)等。等。非編碼非編碼RNARNA具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，如對染色體結(jié)構(gòu)的影響，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，如對染色體結(jié)構(gòu)的影響，對對RNARNA加工修飾及穩(wěn)定性的影響，對轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響，甚至對加工修飾及穩(wěn)定性的影響，對轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響，甚至對蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運及穩(wěn)定性都有一定的影響。蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運及穩(wěn)定性都有一定的影響。所以近年來，許多通過所以近年來，許多通過RNA-seqRNA-seq進(jìn)行測序分析的文章都包括對進(jìn)行測序分析的文章都包括對ncncRNARNA的分析，

5、并且發(fā)現(xiàn)了許多新的的分析，并且發(fā)現(xiàn)了許多新的ncRNAncRNA。二、二、RNA-seqRNA-seq技術(shù)原理技術(shù)原理RNA-seqRNA-seq實驗流程圖實驗流程圖首先，我們獲得細(xì)胞總首先，我們獲得細(xì)胞總RNARNA，然后根據(jù)實，然后根據(jù)實驗需要，比如是需要測驗需要，比如是需要測mRNAmRNA，ncRNAncRNA還是還是smallRNAsmallRNA等，對等，對RNARNA樣品進(jìn)行處理。處理樣品進(jìn)行處理。處理好的好的RNARNA再進(jìn)行片段化，然后反轉(zhuǎn)錄形成再進(jìn)行片段化，然后反轉(zhuǎn)錄形成cDNAcDNA，獲得，獲得cDNAcDNA文庫，然后在文庫，然后在cDNAcDNA片段的片段的兩端接上

6、接頭，最后用新一代高通量測序兩端接上接頭，最后用新一代高通量測序依進(jìn)行測序。依進(jìn)行測序。高通量測測序 高通量測序技術(shù)（高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencingHigh-throughput sequencing）是指能）是指能夠一次并行對幾十萬到幾百萬條夠一次并行對幾十萬到幾百萬條DNADNA分子進(jìn)行序列測定，每分子進(jìn)行序列測定，每一次序列測定的讀長一般較短的測序技術(shù)。一次序列測定的讀長一般較短的測序技術(shù)。 高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條幾十萬到幾百萬條DNADNA分子進(jìn)行序列測定

7、，因此在有些文獻(xiàn)分子進(jìn)行序列測定，因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測序技術(shù)中稱其為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing)(next generation sequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序稱為深度測序(deep sequencing)(deep sequencing)。三種高通量測序簡介：三種高通量測序簡介： 自自20052005年以來年以來, ,以以 RocheRoc

8、he公司的公司的454454技術(shù)、技術(shù)、IlluminaIllumina公司的公司的S Solexaolexa技術(shù)和技術(shù)和ABIABI公司的公司的SOLiDSOLiD技術(shù)為標(biāo)志的新一代測序技術(shù)技術(shù)為標(biāo)志的新一代測序技術(shù)相繼誕生。之后相繼誕生。之后Helicos BiosciencesHelicos Biosciences公司又推出單分子測公司又推出單分子測序序(Single molecule sequencing, SMS)(Single molecule sequencing, SMS)技術(shù)。技術(shù)。三種高通量測序技術(shù)的優(yōu)缺點三種高通量測序技術(shù)的優(yōu)缺點高通量測序中重要名詞解釋高通量測序中重要名

9、詞解釋 1 1、測序深度：測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。、測序深度：測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。假設(shè)一個基因組大小為假設(shè)一個基因組大小為7M7M，測序總堿基數(shù)為，測序總堿基數(shù)為70M70M，則測序深度，則測序深度為為1010。 2 2、覆蓋度：測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因、覆蓋度：測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中高組中高GCGC含量，重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，測序最終拼接組含量，重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，測序最終拼接組裝的序列往往無法覆蓋所有的區(qū)域，這些區(qū)域就叫做裝的序列往往無法覆蓋所有的區(qū)域，這些區(qū)域就叫做GapGap。二者的關(guān)系：測序深

10、度與基因組覆蓋度之間是一個正相關(guān)的關(guān)系，二者的關(guān)系：測序深度與基因組覆蓋度之間是一個正相關(guān)的關(guān)系，測序帶來的錯誤率或假陽性結(jié)果會隨著測序深度的提升而下降。測序帶來的錯誤率或假陽性結(jié)果會隨著測序深度的提升而下降。當(dāng)測序深度在當(dāng)測序深度在101015X15X以上時，基因組覆蓋度和測序錯誤率控以上時，基因組覆蓋度和測序錯誤率控制均得以保證。制均得以保證。 3 3、RPKMRPKM（reads per kilobase per million readsreads per kilobase per million reads）是每百萬讀）是每百萬讀段中來自于某基因每千堿基長度的讀段數(shù)。其公式為段中來自

11、于某基因每千堿基長度的讀段數(shù)。其公式為: : 其中，其中，total exon readstotal exon reads指映射到某個基因上的指映射到某個基因上的readsreads數(shù)，數(shù)，mapped mapped readsreads指指mapmap到所有基因的總的到所有基因的總的readsreads數(shù)。數(shù)。RPKMRPKM不僅對測序深度作了歸一化，而且對基因長度也作了歸一化，不僅對測序深度作了歸一化，而且對基因長度也作了歸一化，使得不同長度的基因在不同測序深度下得到的基因表達(dá)水平估計使得不同長度的基因在不同測序深度下得到的基因表達(dá)水平估計值具有了可比性，是目前最常用的基因表達(dá)估計方法。值

12、具有了可比性，是目前最常用的基因表達(dá)估計方法。三、三、RNA-seqRNA-seq技術(shù)優(yōu)勢技術(shù)優(yōu)勢相對于傳統(tǒng)的相對于傳統(tǒng)的sangersanger測序法，測序法，RNA-seqRNA-seq具有以下優(yōu)勢：具有以下優(yōu)勢：1 1、數(shù)字化信號：直接測定每個轉(zhuǎn)錄本片段序列，單核苷酸分辨、數(shù)字化信號：直接測定每個轉(zhuǎn)錄本片段序列，單核苷酸分辨率的精確度，同時不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號帶來的率的精確度，同時不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應(yīng)和背景噪音問題。交叉反應(yīng)和背景噪音問題。 2 2、高靈敏度：能夠檢測到細(xì)胞中少至幾個拷貝的稀有轉(zhuǎn)錄本。、高靈敏度：能夠檢測到細(xì)胞中少至幾個拷貝的稀有

13、轉(zhuǎn)錄本。 3 3、任意物種的全基因組分析：無需預(yù)先設(shè)計特異性探針，因此、任意物種的全基因組分析：無需預(yù)先設(shè)計特異性探針，因此無需了解物種基因信息，能夠直接對任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。無需了解物種基因信息，能夠直接對任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。同時能夠檢測未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，并精確地識別可變剪同時能夠檢測未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，并精確地識別可變剪切位點及切位點及cSNPcSNP，UTRUTR區(qū)域。區(qū)域。 SAGE, serial analysis of gene expression, 基因表達(dá)系列分析MPSS, massively parallel signature sequencing,

14、 大規(guī)模平行信號測序四、四、RNA-seqRNA-seq技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用 1 1、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究 利用單堿基分辨率的利用單堿基分辨率的RNA-SeqRNA-Seq技術(shù)可極大地豐富基因注釋技術(shù)可極大地豐富基因注釋的很多方面內(nèi)容的很多方面內(nèi)容, , 包括包括 5/35/3邊界鑒定、邊界鑒定、UTRsUTRs區(qū)域鑒定區(qū)域鑒定以及新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域鑒定等。以及新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域鑒定等。RNA-SeqRNA-Seq還可對可變剪接還可對可變剪接(Alter(Alternative splicing)native splicing)進(jìn)行定量研究。進(jìn)行定量研究。 2 2、轉(zhuǎn)錄本變異研究、轉(zhuǎn)錄本變異研究 在

15、發(fā)現(xiàn)序列差異方面，如融合基因鑒定、編碼序列多態(tài)在發(fā)現(xiàn)序列差異方面，如融合基因鑒定、編碼序列多態(tài)性研究等，性研究等，RNA-seqRNA-seq也具有很大的潛力。也具有很大的潛力。 3 3、非編碼區(qū)域功能研究、非編碼區(qū)域功能研究 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的一個重要方面就是發(fā)現(xiàn)和分析轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的一個重要方面就是發(fā)現(xiàn)和分析ncRNAncRNA。 ncRNAncRNA按其功能可分為看家按其功能可分為看家ncRNAncRNA和調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)ncRNAncRNA。前者通常穩(wěn)。前者通常穩(wěn)定表達(dá)定表達(dá), ,發(fā)揮著一系列對細(xì)胞存活至關(guān)重要的功能發(fā)揮著一系列對細(xì)胞存活至關(guān)重要的功能, , 主要包主要包括轉(zhuǎn)移括轉(zhuǎn)移RNA(tRN

16、A)RNA(tRNA)、核糖體、核糖體RNA(rRNA)RNA(rRNA)、小核、小核 RNA(snRNA)RNA(snRNA)及及小核仁小核仁 RNA(snoRNA)RNA(snoRNA)等；后者主要包括長鏈等；后者主要包括長鏈 ncRNA(lncRNA)ncRNA(lncRNA)和以和以microRNAmicroRNA為代表的小為代表的小ncRNA(small ncRNA), ncRNA(small ncRNA), 在表觀遺在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個層面調(diào)控基因表達(dá)。傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個層面調(diào)控基因表達(dá)。 4 4、基因表達(dá)水平研究、基因表達(dá)水平研究 相比于傳統(tǒng)的芯片技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的

17、芯片技術(shù)，RNA-SeqRNA-Seq技術(shù)能更準(zhǔn)確地確定細(xì)技術(shù)能更準(zhǔn)確地確定細(xì)胞中胞中RNARNA的表達(dá)水平。原則上，的表達(dá)水平。原則上，RNA-SeqRNA-Seq有可能確定細(xì)胞群有可能確定細(xì)胞群中的每一個分子的絕對數(shù)量，并對實驗之間的結(jié)果進(jìn)行直中的每一個分子的絕對數(shù)量，并對實驗之間的結(jié)果進(jìn)行直接比較。接比較。RNA-SeqRNA-Seq一個特別強(qiáng)大的優(yōu)勢是它可以捕捉不同組一個特別強(qiáng)大的優(yōu)勢是它可以捕捉不同組織或狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化而無需對數(shù)據(jù)集進(jìn)行復(fù)雜的織或狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化而無需對數(shù)據(jù)集進(jìn)行復(fù)雜的標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化。 5 5、低豐度全新轉(zhuǎn)錄本的確定、低豐度全新轉(zhuǎn)錄本的確定 雖然利用轉(zhuǎn)座

18、子標(biāo)簽和芯片技術(shù)能夠獲得全新的轉(zhuǎn)錄本，雖然利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽和芯片技術(shù)能夠獲得全新的轉(zhuǎn)錄本，但是其工作量大，結(jié)果不確定。而但是其工作量大，結(jié)果不確定。而RNA-SeqRNA-Seq不受背景噪音問不受背景噪音問題的困擾，結(jié)果準(zhǔn)確性高，因而被用來發(fā)現(xiàn)全新的轉(zhuǎn)錄本。題的困擾，結(jié)果準(zhǔn)確性高，因而被用來發(fā)現(xiàn)全新的轉(zhuǎn)錄本。近年來對釀酒酵母、栗酒裂殖酵母、擬南芥、水稻、小鼠、近年來對釀酒酵母、栗酒裂殖酵母、擬南芥、水稻、小鼠、人、和人體白色念珠菌的轉(zhuǎn)錄組測定結(jié)果都顯示出大量的人、和人體白色念珠菌的轉(zhuǎn)錄組測定結(jié)果都顯示出大量的新轉(zhuǎn)錄區(qū)域，并且其中許多轉(zhuǎn)錄水平都低于已知的新轉(zhuǎn)錄區(qū)域，并且其中許多轉(zhuǎn)錄水平都低于已知的cDNAcDNA基基因。因。RNA-seqRNA-seq測序數(shù)據(jù)的分析測序數(shù)據(jù)的分析五、五、RNA-seqRNA-seq發(fā)展前景發(fā)展前景 由于由于RNA-seqRNA-seq相對于傳統(tǒng)的測序方法具有明顯的優(yōu)勢，所以相對于傳統(tǒng)的測序方法具有明顯的優(yōu)勢，所以被廣泛運用到差異基因表達(dá)分析，新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)，