1、復(fù)旦大學(xué)復(fù)旦大學(xué)高通量測序技術(shù)高通量測序技術(shù)姓 名：趙 淑 莉?qū)W 校：吉林大學(xué)復(fù)旦大學(xué)主要內(nèi)容主要內(nèi)容類型及原理類型及原理2應(yīng)應(yīng) 用用341 概概 述述致致 謝謝復(fù)旦大學(xué)概概 述述高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing) 又稱“下一代”測序技術(shù)”、深度測序 以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。 這使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細(xì)致全貌的分析成為可能。復(fù)旦大學(xué)類型及原理類型及原理 目前，所說的高通量測序技術(shù)主要是指454 Life Sciences 公司、ABI 公司和Illumina公司推出的第二代測序技術(shù)以及Helic

2、os Heliscope TM 和Pacific Biosciences 推出的單分子測序技術(shù)。復(fù)旦大學(xué) 2005年，454 Life Sciences 公司( 現(xiàn)已被Roche公司收購) 首先推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)，開創(chuàng)了第二代測序技術(shù)的先河。第二代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)復(fù)旦大學(xué)原理原理：酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)1.首先將PCR 擴增的單鏈DNA 與引物雜交，并與DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、底物熒光素酶和5-磷酸硫酸腺苷共同孵育。第二代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)2.在每一輪測序反應(yīng)中只加入一種dNTP，若該dNTP與

3、模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸。復(fù)旦大學(xué)原理原理：酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)3.焦磷酸鹽被硫酸化酶轉(zhuǎn)化為ATP，ATP 就會促使氧合熒光素的合成并釋放可見光，CCD 檢測后通過軟件轉(zhuǎn)化為一個峰值，峰值與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。第二代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)復(fù)旦大學(xué)此后，Illumina 公司和ABI 公司相繼推出了Solexa和SOLiD(supported oligo ligation detetion)測序技術(shù)。第二代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)復(fù)旦大學(xué) 即生成新DNA 互補鏈時，要么加入的dNTP 通過酶促級聯(lián)反應(yīng)催化底物激發(fā)出熒光，要么直接加入

4、被熒光標(biāo)記的dNTP 或半簡并引物，在合成或連接生成互補鏈時釋放出熒光信號。通過捕獲光信號并轉(zhuǎn)化為一個測序峰值，獲得互補鏈序列信息。原理：與焦磷酸測序法的類似，核心思想都是邊合成邊測序(sequencing by synthesis)。第二代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)復(fù)旦大學(xué)第二代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)u優(yōu)點： 操作極為簡便：無需進行電泳； 可以在芯片上進行高通量分析； 大大節(jié)省了成本和時間。復(fù)旦大學(xué) Illumina公司目前擁有三種測序平臺，分別為HiSeq 2000、HiSeq 1000、Genome Analyzer IIx (http:/ )； ABI 公司則主要是SOLiD 3 和SOL

5、iD 4 兩個測序平臺。 從通量這個最直觀的數(shù)字看來，HiSeq 2000領(lǐng)先于SOLiD 4。 HiSeq 2000 測序平臺單次反應(yīng)可以讀取200G的數(shù)據(jù)，而SOLiD 4 僅為100G 左右。第二代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)復(fù)旦大學(xué) 就測序讀長來說，454 測序平臺讀長最長，目前已經(jīng)達到400nt。因此，454 平臺比較適合對未知基因組從頭測序，但是在判斷連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)時準(zhǔn)確度不高。 Solexa 測序讀長較454 短，僅為100nt 左右，但測序通量高、價位低，適合基因組重測序等。 SOLiD 讀長也較短，但測序精度較高，特別適合SNP 檢測等。復(fù)旦大學(xué)在第二代測序平臺不斷完善和廣泛應(yīng)用

6、的同時，以對單分子DNA進行非PCR測序為主要特征的更新的測序技術(shù)也初顯端倪。2008年4月Helico BioScience公司的Harris等在Science上報道了他們開發(fā)的基于全內(nèi)反射顯微鏡(total Internal reflection microscopy,TIRM) 的測序技術(shù)單分子測序技術(shù)。單分子測序技術(shù)單分子測序技術(shù)復(fù)旦大學(xué)基于全內(nèi)反射顯微鏡(total Internal reflection microscopy, TIRM) 的測序技術(shù)原理原理：1.將待測DNA樣品隨機打斷成小片段，在每個小片段的末端加上poly-dA；2.將小片段DNA模板與固定在檢測芯片上的pol

7、y-dT 引物進行雜交并精確定位，并逐一加入熒光標(biāo)記的末端終止子；單分子測序技術(shù)單分子測序技術(shù)復(fù)旦大學(xué)3.洗滌、成像，切開熒光染料和抑制基團；4.洗滌、加帽，允許下一個核苷酸的摻入；5.這樣通過摻入、檢測和切除的反復(fù)循環(huán)，即可實時讀取大量序列。復(fù)旦大學(xué)單分子實時技術(shù)(SMRT)單分子測序技術(shù)單分子測序技術(shù) 該技術(shù)利用單分子技術(shù)和DNA聚合酶，在聚合反應(yīng)的同時就可以讀取測序產(chǎn)物。 SMRT測序技術(shù)在測序速度、讀長和成本方面有著巨大的優(yōu)勢和潛力。復(fù)旦大學(xué)Ion PGM測序技術(shù)測序技術(shù)原理原理 基于半導(dǎo)體芯片技術(shù)，在半導(dǎo)體芯片的微孔中固定DNA鏈，隨后依次摻入ACGT，隨著每個堿基的摻入，釋放出氫離

8、子，在它們穿過每個孔底部時能被檢測到。單分子測序技術(shù)單分子測序技術(shù)復(fù)旦大學(xué)u主要優(yōu)點： 大大節(jié)省了成本和時間u主要缺點： 測序儀的價格昂貴單分子測序技術(shù)單分子測序技術(shù)復(fù)旦大學(xué) 目前Helico BioScience公司的HeliScope測序儀售價近百萬美元，這是一般實驗室和科研單位所不能承受的。 Life Techologies公司推出的Ion Personal Genome Machine (PGMTM) 測序儀價格僅為普通測序儀的1/10，而且研究人員能夠在2h內(nèi)獲取從10Mb到1Gb以上高精確度序列。單分子測序技術(shù)單分子測序技術(shù)復(fù)旦大學(xué)大規(guī)模平行測序(massively paralle

9、l signature sequencing，MPSS)：它利用芯片進行測序，可以在數(shù)百萬個點上同時閱讀測序，把平行處理的思想用到極致。高通量測序技術(shù)的優(yōu)點高通量測序技術(shù)的優(yōu)點成本低廉：利用高通量測序技術(shù)進行人類基因組測序，耗資不到傳統(tǒng)測序法的1%。復(fù)旦大學(xué)高通量測序技術(shù)的優(yōu)點高通量測序技術(shù)的優(yōu)點高通量測序技術(shù)有完美的定量功能：這是因為樣品中某種DNA被測序的次數(shù)反映了樣品中這種DNA的豐度。這一點有望取代以前的基因表達芯片技術(shù)用于基因表達的研究。復(fù)旦大學(xué)高通量測序技術(shù)的應(yīng)用高通量測序技術(shù)的應(yīng)用u大規(guī)?；蚪M測序u基因表達分析u非編碼小分子RNA的鑒定u轉(zhuǎn)錄因子靶基因的篩選uDNA甲基化相關(guān)研

10、究u其他復(fù)旦大學(xué)全基因組測序全基因組測序 高通量測序技術(shù)在發(fā)展初期由于讀長較短，使其在對未知基因組從頭測序( denovo Sequencing) 的應(yīng)用受到限制，只能用于基因組重測序?；蚪M重測序基因組重測序是指對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因組測序，并在此基礎(chǔ)上對個體或群體進行差異性分析。復(fù)旦大學(xué)高通量高通量RNA測序及其在轉(zhuǎn)錄組測序及其在轉(zhuǎn)錄組和基因表達調(diào)控和基因表達調(diào)控上的應(yīng)用上的應(yīng)用 最近科學(xué)家們將高通量測序技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組分析開發(fā)出了RNA測序技術(shù)測序技術(shù)(RNA-Seq) ，該技術(shù)能夠在全基因組范圍內(nèi)檢測基因表達情況，進行差異基因篩選分析。 由于RNA-Seq技術(shù)具有通量

11、高、可重復(fù)性高、檢測范圍寬、定量準(zhǔn)等特點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、擬南芥、水稻和人類等生物轉(zhuǎn)錄組的研究。復(fù)旦大學(xué) 轉(zhuǎn)錄組研究是從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)。但是，多數(shù)研究人員感興趣的是某一特定的生物過程、發(fā)育階段或處理后的基因表達情況。 建立在高通量測序基礎(chǔ)上的數(shù)字化基因表達譜(digital gene expression profiling)分析無需預(yù)先針對已知序列設(shè)計探針，即可對任何生物整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測，因此應(yīng)用范圍更加廣泛。復(fù)旦大學(xué) 高通量RNA 測序技術(shù)另一個廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小RNA 的研究。 小RNA在植物的生長、發(fā)育和外界脅迫應(yīng)答等方面具有重要功能。 但由于小RNA序列短、

12、同源性高，因此利用基因芯片檢測小RNA非常困難。 高通量測序技術(shù)不但能夠克服這一難題，而且能夠發(fā)現(xiàn)新的小RNA。目前，高通量測序技術(shù)已經(jīng)成功的應(yīng)用于擬南芥、水稻和小麥等生物小RNA的研究。復(fù)旦大學(xué) ChIP-Seq 技術(shù)及其在技術(shù)及其在DNA和和蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用 染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immuno- precipitation，ChIP) 技術(shù)是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA 之間相互作用的強有力工具，在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究中被廣泛應(yīng)用。復(fù)旦大學(xué) 染色質(zhì)免疫共沉淀測序(chromatin immune precipitatio

13、n sequencing，ChIP-Seq) 技術(shù)充 分結(jié)合了ChIP和高通量測序技術(shù)的優(yōu)勢，能夠在全基因組范圍內(nèi)高效地研究目的蛋白的結(jié)合位點。復(fù)旦大學(xué)該技術(shù)的原理：1.通過ChIP技術(shù)利用抗體特異性地富集交聯(lián)的目的蛋白-DNA復(fù)合體；2.將得到的DNA片段進行高通量測序；3.將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA 區(qū)段信息。復(fù)旦大學(xué)基因組基因組DNA 甲基化分析甲基化分析 DNA甲基化在維持細(xì)胞正常功能、遺傳印記和胚胎發(fā)育過程中起著極其重要的作用。 新一代高通量測序技術(shù)使得基因組整體水平高精度的甲基化檢測成為現(xiàn)實。 目前，高通量測序

14、技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于擬南芥、水稻、蠶和人等生物DNA甲基化的研究，并取得了豐碩的成果。復(fù)旦大學(xué) 目前，已經(jīng)建立了至少三種依賴于高通量測序的DNA甲基化分析技術(shù)： 甲基化DNA免疫共沉淀測序( methylated DNA immunoprecipitation sequencing，MeDIP-Seq)； 甲基結(jié)合蛋白測序(methyl-binding protein sequencing，MBD-Seq ) ； 亞硫酸氫鹽測序( bisulfite-sequencing，BS-Seq)。復(fù)旦大學(xué) MeDIP-Seq和MBD-Seq首先通過特異性結(jié)合甲基化DNA的MBD2b 或5-甲基胞嘧啶抗體富集高甲基化的DNA，然后再對富集到的片段測序； MeDIP-Seq 和MBD-Seq 都是基于富集的原理，二者是相輔相成的。MeDIP-Seq 對高度甲基化和高密度的CpG 更加敏感，而MDB-Seq 對高度甲基化和中等密度的CpG 更加敏感； BS-Seq不經(jīng)過富集直接測序。復(fù)旦大學(xué)存在的問題存在的問題測序速度提高了，但后續(xù)的海量測序數(shù)據(jù)的分析卻成為一大難題。不適合小規(guī)模測序。新一代測序