1、微生物學(xué)通報 OCT 20, 2008, 35(10: 16211625 Microbiology © 2008 by Institute of Microbiology, CAStongbao基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 30571245 *通訊作者:Tel: 0538-*; : xlliu 收稿日期:2008-02-28; 接受日期:2008-04-28專論與綜述多粘類芽孢桿菌及其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)研究進展楊少波 劉訓(xùn)理*(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 泰安 271018摘 要: 多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa 對人或動植物沒有致病性,某些菌株可

2、產(chǎn)生如抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶、絮凝劑等多種生物活性物質(zhì)。這些活性物質(zhì)在植物病害防治以及人和動物疾病治療方面具有誘人的應(yīng)用前景。本文對近年來多粘類芽孢桿菌及其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)的研究進展進行了綜述。關(guān)鍵詞: 多粘類芽孢桿菌, 生物活性物質(zhì), 抗生素, 抗菌蛋白, PGPRResearch Advances in Paenibacillus polymyxaand Their Bioactive SubstancesYANG Shao-Bo LIU Xun-Li *(College of Forestry , Shandong Agricultural University , Tai a

3、n 271018Abstract: Many beneficial bioactive substances were produced by Paenibacillus polymyxa such as an-tibiotics, antimicrobial proteins, plant hormones and flocculants. These bioactive substances also could be produced by Paenibacillus polymyxa making it show excellent prospect in biological con

4、trol of plant diseases, treatment of mankind and animals. This article summarizes research advances in Paenibacillus polymyxa and their bioactive substances.Keywords: Paenibacillus polymyxa , Bioactive substances, Antibiotics, Antimicrobial proteins, PGPR 1994年, Ash 等1在分子生物學(xué)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上建立了類芽孢桿菌屬, 并將多粘類芽

5、孢桿菌(Paenibacillus polymyxa 立為類芽孢桿菌屬的模式菌種。多粘類芽孢桿菌是少數(shù)能夠產(chǎn)生具有臨床應(yīng)用價值的抗生素的細菌之一, 由它產(chǎn)生的多粘菌素B(polymyxins B, PMB和多粘菌素E(colistin已在臨床上用于抗細菌感染。其中的某些菌株也是重要的植物生防細菌和植物根際促生菌(plant growth- promoting rhizobacteria, PGPR, 并且在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用2,3。此外, 多粘類芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物在工礦業(yè)及廢水處理方面也有應(yīng)用4。由于其誘人的應(yīng)用前景, 美國環(huán)保署(EPA將它列為可商業(yè)上應(yīng)用的微生物之一, 我國農(nóng)業(yè)部也

6、將其列為免做安全鑒定的一級菌種。1 多粘類芽孢桿菌的分類地位多粘類芽孢桿菌原名多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa , 以形態(tài)學(xué)為分類基礎(chǔ), 早期研究將其歸 1622微生物學(xué)通報2008, Vol.35, No.10 入芽孢桿菌屬。1994年, Ash 等1通過PCR 探針試驗分析了幾株芽孢桿菌的16S rRNA 序列, 分析顯示芽孢桿菌至少包括五種系統(tǒng)發(fā)生線, 并發(fā)現(xiàn)一些芽孢桿菌與其他芽孢桿菌的表型特征差異極大, 16S rRNA 序列存在高度特異性。在此研究結(jié)果的基礎(chǔ)上, Ash 將多粘芽孢桿菌等11個種從芽孢桿菌屬中分離出來, 另立類芽孢桿菌屬, 并將多粘類芽孢桿菌立為類芽孢

7、桿菌的模式菌種, 至今類芽孢桿菌已有23個種。多粘類芽孢桿菌細胞呈桿狀, 革蘭氏染色陽性、陰性或可變, 接觸酶陽性, 氧化酶反應(yīng)可變, 厭氧條件下所測定的大多數(shù)菌株固定氮。2 多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)多粘類芽孢桿菌可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì), 如酶、抗菌物質(zhì)、植物激素以及絮凝劑等, 這些活性物質(zhì)大多為蛋白質(zhì)、多糖、多肽等。多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)按其物質(zhì)類型及分子大小可分為小分子的多肽抗生素類、大分子的拮抗蛋白(酶類等。這些抗菌物質(zhì)性質(zhì)比較穩(wěn)定, 如耐高溫、高壓, 對酸堿穩(wěn)定, 對蛋白酶不敏感等。2.1 多肽抗生素類多肽抗生素是多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的一類非核糖體肽類抗生素, 結(jié)構(gòu)多種多樣

8、, 有線狀、環(huán)狀和線環(huán)狀, 分子中常含有一些特殊的基團, 如乙醇胺、亞精胺、2,4一二氨基丁酸和甲酰基等。與抗菌蛋白相比多肽抗生素分子量較小, 一般在1 kD2 kD 之間。多粘菌素(polymyxins是多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的一類堿性線環(huán)狀陽離子多肽抗生素, 含有疏脂性和親脂性基團及一個多肽尾, 圖1為多粘菌素的結(jié)構(gòu)示意圖。根據(jù)結(jié)構(gòu)差異將其分為多粘菌素A 、B 、C 、D 和E 等組分, 分子量都在1200 D 左右。多粘菌素(polymyxins A-E 具有相似的抗菌譜, 對多種革蘭氏陰性菌具有強烈的殺菌作用, 研究表明, 多粘菌素(polymyxins可破壞革蘭氏陰性細菌細胞質(zhì)膜的通透性

9、, 致使胞內(nèi)物質(zhì)泄漏從而起到殺菌作用。由于多粘菌素B(polymyxins B, PMB不僅對多種革蘭氏陰性細菌具有殺菌作用, 而且對如革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素(LPS等細菌的致病因子具有明顯的拮抗作用, 因而越來越引起人們的重視。多粘菌素B 具有腎毒性和神經(jīng)毒性, 一度限制了它在臨床上的應(yīng)用, 但是, 由于臨床上多藥耐藥(multidrug resistance MDR革蘭氏陰性桿菌等缺乏有效的治療藥物, 以及多粘菌素B 九肽(polymyxin B nonapep-tide(采用酶裂解PMB 后得到的毒性降低但保留了抗內(nèi)毒素活性的PMB 衍生物6的出現(xiàn), 使PMB 又重新受到人們的重視。多粘菌

10、素E(colistin是一種效性抗生素, 雖然其抗菌效果較PMB 差, 但是它毒性小、副作用低, 因此, 它在禽畜的臨床應(yīng)用上較PMB 多, 目前已廣泛應(yīng)用于禽畜的飼料添加劑。圖1 多粘菌素的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of polymyxinsFusaricidins 是一類從多粘類芽孢桿菌中分離的由六個氨基酸殘基和一個2-胍基-3-羥基十五烷酸(GHPD組成的環(huán)狀多肽類抗生素, 圖2為Fusa- ricidins 的結(jié)構(gòu)示意圖。它包括Fusaricidins A-D 幾種結(jié)構(gòu)類似的組分。Fusaricidins 對尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum 、黑曲霉(Asp

11、ergillus niger 、米曲霉(Aspergillus oryzae 、黃?？缴婢?Penicillium thomii 等具有很好的拮抗作用, 對白色念珠菌(Candida albicans 、釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae 具有顯著的拮抗作用, 對金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus 等革蘭氏陽性細菌具有很高的殺菌活性7。Soo-Keun Choi 等8將多粘類芽孢桿菌E681(Paenibacillus polymyxa E681的培養(yǎng)液離心后, 用甲醇抽提菌體得到Fusaricidins, 通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析其氨基酸

12、序列, 并測定了Fusaricidins 合成酶的基因序列, 為該抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。圖2 Fusaricidins 的結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structure of Fusaricidins另外, 還有多種多肽類抗生素在多粘類芽孢桿菌的發(fā)酵液中被發(fā)現(xiàn)。Brigitte Pichard 等9在多粘類芽孢桿菌BP1(Paenibacillus polymyxa BP1的培養(yǎng)肉湯中分離得到兩種新的多肽抗生素, 分別命名為楊少波等: 多粘類芽孢桿菌及其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)研究進展1623Gavaserin 和Saltavalin 。Gavaserin 分子量為911 D, 含有谷氨酸、丙氨酸、纈

13、氨酸、絲氨酸、2,4-二氨基丁酸以及辛酸。Saltavalin 分子量為903 D, 含有絲氨酸、丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、2,4-二氨基丁酸, 在這種多肽中沒有發(fā)現(xiàn)脂肪酸。近年來, 又有多種多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的多肽抗生素被發(fā)現(xiàn), 周華強等10用加熱法從多粘類芽孢桿菌LM-3(Paenibacillus polymyxa LM-3發(fā)酵液中純化得到一種極端嗜熱多肽APPLM3, 該多肽對稻瘟病菌有較強的拮抗作用, 且熱穩(wěn)定性相當(dāng)高。多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的多肽抗生素大多為多種組分抗生素, 它們往往是一族對特定病原菌具有很高活性、結(jié)構(gòu)相似的抗生素, 分子量在1000 D 左右。2.2 拮抗蛋白多

14、粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的蛋白質(zhì)大多數(shù)為核糖體合成的細胞壁降解酶類, 如-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等。-1,3-葡聚糖多聚物是大多數(shù)植物病原真菌細胞壁的主要成分, -1,3-葡聚糖酶可水解-1,3-葡聚糖中的-1,3-糖苷鍵, 從而抑制植物病原真菌的生長與增殖。同時, -葡聚糖酶還是一種極具經(jīng)濟價值的工業(yè)用酶。可溶性非淀粉多糖是飼料原料中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子, 它可增加動物腸道的粘性從而阻礙對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收, 在飼料中添加-葡聚糖酶可水解飼料中的可溶性非淀粉多糖。在啤酒生產(chǎn)中加入-葡聚糖酶可解決-葡聚糖引起的大麥難降解、黏度大的問題, 以提高啤酒的質(zhì)量與穩(wěn)定性。包括多粘類芽孢桿菌在內(nèi)的多種

15、桿菌可產(chǎn)生-葡聚糖酶, 李衛(wèi)芬等11對1株多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的-葡聚糖酶特性進行了分析, 克隆了該酶基因的全長DNA 序列, 該序列長度為734 bp, 其中開放閱讀框架長714 bp, 編碼238個氨基酸, Blast 分析結(jié)果顯示, 該序列與已經(jīng)登錄的多粘類芽孢桿菌X5709 (Paenibacillus polymyxa X5709同源性為99.04%。姚烏蘭等12通過DEAE-Sephadex A-50離子交換層析、Sephacryl S-200分子篩層析, 從多粘類芽孢桿菌WY110(Paenibacillus polymyxa WY110菌株發(fā)酵液中分離純化到一種分子量為26 kD

16、 的蛋白質(zhì)P 2, 該蛋白對稻瘟病菌的不同菌株表現(xiàn)出抑菌活性。蛋白質(zhì)P 2 N-末端24個氨基酸測序為H 2N-Ala-Asn-Val- Phe-Trp-Glu-Pro-Leu-Ser-Tyr-Tyr-Asn-Pro-Ser-Thr-Trp-Gln-Lys-Ala-Asp-Gly-Tyr-Ser-Asn-。Blast P 檢索結(jié)果表明, P 2蛋白與1株已報道的多粘類芽孢桿菌-1,3-1,4-葡聚糖酶基因gluB 同源性為84%。用此酶的特異底物地衣多糖進行了定性檢測, 驗證了P 2蛋白具有-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性。幾丁質(zhì)是絕大多數(shù)真菌細胞壁的結(jié)構(gòu)物質(zhì), 同時還是昆蟲中腸圍食膜的主要成

17、分。幾丁質(zhì)酶可催化水解幾丁質(zhì)的-1,4-糖苷鍵, 它在植物病蟲害的防治方面, 以及在幾丁質(zhì)廢物的轉(zhuǎn)化和利用等方面都具有重要作用。Mavingui 等13從1株多粘類芽孢桿菌中分離獲得了具有抗菌活性的幾丁質(zhì)酶。人們還發(fā)現(xiàn), 某些多粘類芽孢桿菌還可產(chǎn)生多種蛋白酶、核糖核酸酶 等14,15。多粘類芽孢桿菌還可以產(chǎn)生一些不具酶活性的拮抗蛋白。Saravanakumar Kavitha 等16將多粘類芽孢桿菌VLB 16(Paenibacillus polymyxa VLB 16的發(fā)酵液用40%的硫酸銨沉淀, 沉淀物溶解后經(jīng)Sephadex G-200分子篩層析, 得到一種分子量為37 kD 的蛋白質(zhì),

18、 該抗菌蛋白對稻瘟病菌和絲核菌具有拮抗作用。研究表明, 該拮抗蛋白可作用于病原真菌的細胞壁及菌絲, 引起細胞形態(tài)發(fā)生改變, 但未發(fā)現(xiàn)該蛋白具有酶活性。傅里葉變換紅外光譜儀檢測結(jié)果顯示, 該蛋白的高級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、-轉(zhuǎn)角、-折疊構(gòu)成, 熱穩(wěn)定性高且對鏈酶蛋白酶以及一些蛋白質(zhì)變性劑不敏感。陳雪麗等17通過硫酸銨沉淀、Sephadex G-50分子篩層析, 在多粘類芽孢桿菌BRF-1(Paenibacillus polymyxa BRF-1發(fā)酵液中分離純化到一種對大豆立枯絲核菌具有拮抗活性的抗菌蛋白, 經(jīng)SDS-PAGE 檢測BRF-1抗菌蛋白的分子量為35.4 kD, 其結(jié)構(gòu)尚不明確。2.

19、3 多粘類芽孢桿菌及其產(chǎn)生的其他生物活性物質(zhì)多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的多種抗生素和酶已應(yīng)用于臨床和植病生防。除此之外, 多粘類芽孢桿菌還可以產(chǎn)生植物激素、凝絮劑、表面活性劑等其他生物活性物質(zhì)。這些物質(zhì)是多粘類芽孢桿菌作為PGPR 以及在廢水處理、礦物浮選等領(lǐng)域應(yīng)用的物質(zhì)基礎(chǔ)。 2.3.1 多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的植物激素:微生物可產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA、生長素(auxins、雙萜化合物類的赤霉素(gibberellins、腺嘌呤衍生物類的細胞分裂素(cytokinins、乙烯(ethylene等植物激素, 這 些植物激素可以促進植物生長。很早人們就發(fā)現(xiàn) 多粘類芽孢桿菌可產(chǎn)生植物激素, 1988年, Hol

20、l1624微生物學(xué)通報2008, Vol.35, No.10等18發(fā)現(xiàn)一種可產(chǎn)生吲哚-3-乙酸的多粘類芽孢桿菌, 這種吲哚乙酸(IAA類植物激素可促進大麥草等植物的生長。Timmusk S 等19用高效液相色譜法在多粘類芽孢桿菌B2(Paenibacillus polymyxa B2的發(fā)酵液中分離得到一種促進植物生長的植物激素, 經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用法分析為一種細胞分裂素(cytokinins。 2.3.2 多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的絮凝劑:絮凝劑可通過改變膠體間靜電作用或通過聚合物架橋作用使分散狀態(tài)顆粒聚集起來, 得到較大的顆粒從而引起固液分離。絮凝劑在污水處理、礦物浮選方面有非常重要的作用。微生物產(chǎn)生的具

21、有絮凝劑功能的物質(zhì)包括一些胞外多糖、蛋白質(zhì)、有機酸等。多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的絮凝劑在污水處理方面也有應(yīng)用。Partha Patra 等5從多粘類芽孢桿菌NCIM 2539(Paenibacillus polymyxa NCIM 2539培養(yǎng)基中分離得到兩種具有絮凝劑作用的物質(zhì), 一種為胞外多糖(ECP另一種為一種胞外蛋白(EBP。3 多粘類芽孢桿菌的應(yīng)用3.1 多粘類芽孢桿菌作為PGPR 的應(yīng)用PGPR 可以促進植物生長、提高作物產(chǎn)量。研究表明, PGPR 的作用機制包括以下幾個方面:(1作為微生物肥料。PGPR 可通過生物固氮作用、解磷作用、解鉀作用等促進植物對這些物質(zhì)的吸收, 或者可促進有益

22、微生物與植物的共生等; (2產(chǎn)生植物激素。一些PGPR 菌株可以通過分泌植物激素以促進植物根部的生長及影響根部形態(tài); (3誘導(dǎo)植物抗性(Induced Systemic Resistance,ISR。植物本身對植物病原體存在著潛在的防御機制, 這種防御機制可被病原體或者PGPR 菌株誘發(fā)20; (4生物防治作用。PGPR 通過競爭作用或拮抗作用來抑制植物病原菌的侵染或生長以促進植物生長, 其中以結(jié)抗作用為主。還有報道稱某些PGPR 菌株可修復(fù)受有機物污染的土壤環(huán)境, 以改善植物生長的環(huán)境從而促進植物生長。近年來, PGPR 的應(yīng)用研究成為農(nóng)業(yè)微生物的熱點, Choong-Min Ryu 等3報

23、道, 一株多粘類芽孢桿菌E681(Paenibacillus polymyxa E681可以抑制猝倒病等多種芝麻土傳病害, 促進芝麻的生長。研究還表明多粘類芽孢桿菌E681(Paenibacillus polymyxa E681抑菌譜廣, 對終極腐霉菌(Pythium ultimum 、德巴利腐霉(Pythium debaryanum 、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani 、尖孢鐮刀菌(Fusarium ox-ysporum 、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea 、番茄葉霉病菌(Cladosporium fulvum 等具有明顯的抑制作用。Dilfuza Egamber

24、diyeva 2研究了多粘類芽孢桿菌BcP26(Paenibacillus polymyxa BcP26在不同肥力條件下對玉米生長的影響, 該研究表明, 在貧瘠土壤中多粘類芽孢桿菌BcP26 (Paenibacillus polymyxa BcP26更能促進玉米對氮、磷、鉀的吸收。許多多粘類芽孢桿菌是非常具有應(yīng)用潛力的PGPR, 但是要實現(xiàn)商業(yè)化, 還必須加強高產(chǎn)菌株的選育、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化、制劑研制等方面的研究。3.2 多粘類芽孢桿菌在選礦方面的應(yīng)用多粘類芽孢桿菌在生物誘導(dǎo)選礦(選擇性浮選和選擇性絮凝中具有重要的應(yīng)用潛力, 它可以通過附著在礦物表面形成生物膜以改變礦物的表面化學(xué)組成, 或

25、者產(chǎn)生一些如有機酸、多糖、氨基化合物、還原劑等代謝產(chǎn)物, 催化礦物的氧化還原反應(yīng)或吸附、聚集、沉淀一些礦物成分。Partha Patra 等4研究了多粘類芽孢桿菌NCIM 2539(Paenibacillus polymyxa NCIM 2539細胞及代謝產(chǎn)物用于選擇性分離黃鐵礦和方鉛礦過程中礦石的表面化學(xué), 當(dāng)?shù)V石表面吸附細菌及其代謝產(chǎn)物并相互作用后, 通過絮凝和浮選可成功地將這兩種金屬從混合礦物中選擇性的分離出來。Vijayalakshmi S P 等21用生物絮凝法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的重力濃縮技術(shù)處理高灰印度煤, 研究表明,利用一株多粘類芽孢桿菌對高灰煤樣品進行選擇性絮凝處理, 除灰率高達60%。

26、生物選礦與傳統(tǒng)的選礦方法相比具有無可比擬的優(yōu)勢, 例如生物選礦具有分離率高、成本低、無污染等優(yōu)點, 特別是對品位低、細分散及難處理的礦石。但要實現(xiàn)多粘類芽孢桿菌作為選礦藥劑的工業(yè)化, 多粘類芽孢桿菌與礦物表面作用機理的研究以及優(yōu)良菌株的選育是非常必要的。4 展望傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中化學(xué)農(nóng)藥、化學(xué)肥料的過量使用不僅導(dǎo)致了許多作物病蟲害的抗藥性, 更造成了農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的日趨惡化。在這種情況下高效且對生態(tài)和環(huán)境安全的微生物農(nóng)藥、生物肥料受到越來越多的關(guān)注。多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的多肽類抗菌物質(zhì)對植物病原真菌具有很好的拮抗活性, 且性質(zhì)比較穩(wěn)定, 因此, 多粘類芽孢桿菌是極具開發(fā)前景的生防細菌。同時, 可進一步通過

27、氨基酸序列分析, 克隆其編碼基因, 采用基因工程手段將這些抗性基因?qū)霔钌俨ǖ? 多粘類芽孢桿菌及其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)研究進展1625作物, 進行作物的抗病育種。多粘類芽孢桿菌作為PGPR 用于微生物肥料也正在受到重視, 國內(nèi)外已經(jīng)報道有多株可作為PGPR 的多粘類芽孢桿菌, 并且具有可商業(yè)化生產(chǎn)的潛力。在上世紀六、七十年代, 多粘菌素類抗生素曾在臨床上應(yīng)用于治療革蘭氏陰性細菌的感染, 由于其具有腎毒性和神經(jīng)毒性, 在八十年代被淘汰。近年來, 耐藥性成為全球關(guān)注的熱點, 多耐藥性假單胞桿菌屬、不動桿菌屬以及產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶(ESBL細菌的出現(xiàn)使得多粘菌素類抗生素被重新重視起來。多粘菌素九肽的

28、出現(xiàn)也為多粘菌素類抗生素的應(yīng)用提供了一種新的思路, 可以通過對多粘菌素的結(jié)構(gòu)改造來獲得具有更好臨床效果且毒副作用小的衍生物。生物選礦方法憑借其優(yōu)勢逐漸受到人們的關(guān)注, 近十年來多粘類芽孢桿菌作為選礦藥劑的應(yīng)用研究在國外成為一研究熱點。目前多粘類芽孢桿菌對黃鐵礦、方鉛礦、黃銅礦、赤鐵礦等礦物的生物選礦已被廣泛報道。參 考 文 獻1 Ash C, Priest FC, Collins MD. Molecular identification ofrRNA group 3 bacilli using a PCR probe test. Antonie Van Leeuwenhoek , 1994,

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