1、. .用Universal Buffer和Basal Buffer進(jìn)展限制酶活性表示TaKaRa公司，為了方便限制酶的統(tǒng)一使用，采用了通用緩沖液 (Universal Buffer) 測定限制酶活性的體系 (5種通用緩沖液中，用 標(biāo)注的)，以此時(shí)的活性值作為100%。并把在其它通用緩沖液中的相對活性表示如下表。有 ( ) 標(biāo)記的是易受Star活性影響的緩沖液，為了防止Star活性的影響，希望盡量使用 或 標(biāo)注的緩沖液。每種限制酶都有其自身的根本緩沖液 (BasalBuffer)，其中Acc、Bal、B、Bgl、Bpu1102、Cfr10、Eam1105、Eco52、Nru、PshB、SnaB、

2、Ssp、Taq、VpaK11B (共14種)由于沒有十分適宜的通用緩沖液，只能使用根本緩沖液(Basal Buffer)。各種限制酶的根本緩沖液組成不同，相互之間不能通用。各種限制酶在根本緩沖液中的相對活性也被列于下表，供參考。限制酶在各種緩沖液中的相對活性 附帶·活性測定用Buffer     推薦使用的Buffer *1 +0.01%BSA100%: Afl II, Aor13H I, EcoO65 I, Fok I, Hin1 I, Mun I, Nco I, Pvu I, Sse8387 I, Xba I 

3、*2 +0.01%BSA+0.01%Triton X-100100%: Not I按Universal Buffer分類的限制酶  各Universal Buffer的組成   使用本卷須知10×Buffer都為10倍濃度的緩沖液。此外，10×T溶液中不含BSA， 在使用時(shí)將BSA添加進(jìn)去，使最終濃度為0.01%，有些限制酶(帶有*1或*2標(biāo)記)的反響體系中需加BSA或Triton X-100，添附的溶液是10倍濃度 (0.1%) 的液體，使用時(shí)，請?jiān)诜错戵w系中添加1/10量進(jìn)展反響。  保存-20 反響停頓液組份

4、表(10 × Loading Buffer)1%        SDS60%        Glycerol0.05%        Bromophenol Blue  使用方法本公司的酶包裝中全部附帶有反響停頓液。使用時(shí)請?zhí)砑臃错懸毫康?/10，即可停頓反響，進(jìn)展電泳。-20保存時(shí)，會出現(xiàn)SDS沉淀，請于溫水浴中溶解后使用。在室溫下保存

5、時(shí)，SDS有時(shí)也會出現(xiàn)沉淀，此時(shí)同樣請于溫水浴中將其溶解后使用。   保存*后室溫保存。Double Digestion(雙酶切反響)時(shí)Universal Buffer(通用緩沖液)的使用表 說明使用二種酶同時(shí)進(jìn)展DNA切斷反響 (Double Digestion) 時(shí)，為了節(jié)省反響時(shí)間，通常希望在同一反響體系內(nèi)進(jìn)展。TaKaRa采用Universal Buffer表示系統(tǒng)，并對每種酶表示了在各Universal Buffer中的相對活性。盡管如此，在進(jìn)展Double Digestion時(shí)，有時(shí)還會難以找到適宜的Universal Buffer。本表以在pUC系列載體的多克隆位點(diǎn)處的

6、各限制酶為核心，顯示了在Double Digestion可使用的最正確Universal Buffer條件。在本表中，各Universal Buffer之前表示的 數(shù)字× 是指各Universal Buffer的反響體系中的最終濃度。TaKaRa銷售產(chǎn)品中添附的Universal Buffer全為10倍濃度的緩沖液。終濃度為0.5×時(shí)反響體系中的緩沖液那么稀釋至20倍，1×時(shí)稀釋至10倍，2×時(shí)稀釋至5倍進(jìn)展使用。   注意 1 g DNA中添加10 U的限制酶，在50 l的反響體系中，37下反響1小時(shí)可以完全降解DNA。 為防止Star活性的

7、產(chǎn)生，請將反響體系中的甘油含量，盡量控制在10%以下。 根據(jù)DNA的種類，各DNA的立體構(gòu)造的差異，或當(dāng)限制酶識別位點(diǎn)鄰接時(shí)，有時(shí)會發(fā)生Double Digestion不能順利進(jìn)展的可能。pUC18/19/118/119載體多克隆位點(diǎn)處的限制酶雙酶切效果在基因工程實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常要對DNA片段進(jìn)展多種限制酶的酶切反響。但經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對在DNA片段上相鄰或相近的兩個(gè)限制酶切位點(diǎn)進(jìn)展雙酶切反響時(shí)，往往達(dá)不到預(yù)期的效果。例如，對pUC18/19/118/119載體多克隆位點(diǎn)處的Kpn I 和Sma I 進(jìn)展雙酶切時(shí)，酶切反響難以進(jìn)展。而針對有些酶切位點(diǎn)進(jìn)展雙酶切時(shí)，酶切效果與酶切反響所用限制酶的順序還

8、有關(guān)系。例如，要對Sac I 和Kpn I 這兩個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)展雙酶切時(shí)，如果先用Sac I 進(jìn)展酶切，然后再用Kpn I 進(jìn)展酶切，雙酶切反響那么無法進(jìn)展。但是如果先用Kpn I 進(jìn)展酶切，然后再用Sac I 進(jìn)展酶切，雙酶切反響那么可以進(jìn)展。造成這些結(jié)果的原因是因?yàn)檫M(jìn)展限制酶的雙酶切反響時(shí)，由于受到酶切位點(diǎn)周圍堿基數(shù)量的影響，從而影響了酶切效果。 本公司對pUC18/19/118/119載體多克隆位點(diǎn)處的限制酶進(jìn)展雙酶切時(shí)的效果，進(jìn)展了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果見表1和表2。表1是用兩種限制酶進(jìn)展分步酶切時(shí)的結(jié)果，表2是用兩種限制酶進(jìn)展同步酶切時(shí)的結(jié)果。為了保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)展，對載體多克隆位點(diǎn)上的限制酶

9、進(jìn)展雙酶切時(shí)，應(yīng)該考慮各限制酶之間的位置關(guān)系。下表中記號：“O表示限制酶酶切效果較好；“表示限制酶的酶切效果不太好；“X表示限制酶酶切效果很差。  表1 分步酶切效果 表2 同步酶切效果注：1. 對相鄰酶切位點(diǎn)的限制酶進(jìn)展雙酶切反響時(shí)，同時(shí)參加限制酶進(jìn)展雙酶切反響的切斷效果都不太理想，建議按先后順序參加相應(yīng)的限制酶進(jìn)展酶切反響。 2. 使用EcoR I進(jìn)展酶切反響時(shí)，酶切體系為20 l，將酶的添加量控制在10 U左右，反響時(shí)間控制在2小時(shí)左右，雙酶切效果較好。 PCR產(chǎn)物末端限制酶切位點(diǎn)的切斷情況克隆PCR產(chǎn)物的方法之一，是在PCR產(chǎn)物兩端設(shè)計(jì)一定的限制酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切后克隆至用一樣酶切的載體中。但實(shí)驗(yàn)證明，大多數(shù)限制酶對裸露的酶切位點(diǎn)不能切斷。必須在酶切位點(diǎn)旁邊加上一個(gè)至幾個(gè)保護(hù)堿基，才能使所定的限制酶對其識別位點(diǎn)進(jìn)展有效切斷。下表列舉了15種