1、實驗一 蘆丁的提取精制與鑒定蘆?。≧utin）亦稱蕓香苷（Rutinoside），在植物界廣泛存在，其中以槐米、蕎麥葉、蒲公英和煙葉中含量較多，可作為提取蘆丁的原料。槐花米系豆科植物Sophora japonica 的未開放花蕾，具有調(diào)節(jié)毛細(xì)血管滲透性之作用，臨床用作毛細(xì)血管止血藥，如復(fù)方蘆丁，也作為高血壓的輔助治療藥物。除此之外，還可作為制藥原料，用于制造槲皮素（Quercetin）、羧乙基槲皮素、羧乙基蘆丁、二羧丙基蘆丁、-乙基嗎啡蘆丁、6-而乙基氨基蘆丁等?；被字刑J丁的含量高達(dá)12%16%,另含少量皂苷。蘆丁水解后得到槲皮素，皂苷水解后可得到白樺酯醇（Betulin）及槐花二醇（Sop

2、horadiol）。 蘆丁為淡黃色細(xì)小針狀結(jié)晶，含三個結(jié)晶水，熔點177178。；蘆丁溶于熱水（1:200），難容于冷水（1:8000）；溶于熱甲醇（1:7），冷甲醇（1:100）；熱乙醇（1:30），冷乙醇（1:300），難溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、三氯甲烷、乙醚及石油醚等溶劑。易溶于堿液中呈黃色，酸化后又析出。其結(jié)構(gòu)如下圖：一、實驗?zāi)康?、通過蘆丁的提取與精制掌握堿酸法提取黃酮類化合物的原理及操作。2、通過蘆丁的結(jié)構(gòu)檢識，了解苷類結(jié)構(gòu)研究的一般程序和方法二、實驗原理蘆丁為淺黃色粉末或極細(xì)的針狀結(jié)晶，含有三分子的結(jié)晶水。溶解度：冷水1:10000；熱水1:200；冷乙醇1:650；熱乙醇

3、1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于堿而呈黃色。蘆丁為黃酮苷，分子中具有酚羥基，顯酸性，可溶于稀堿液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性質(zhì)進行提取分離。利用蘆丁易溶于熱水、熱乙醇，較難溶于冷水、冷乙醇的性質(zhì)選擇重結(jié)晶方法進行精制。三、實驗器材研缽，500mL燒杯，廣泛試紙，四層紗布，濾紙，漏斗，10mL試管，5mL移液管，波棒，洗耳球，溫控烘箱石灰乳，濃鹽酸，鎂粉，10%-萘酚乙醇溶液，濃硫酸，乙醇，2%二氯氧鋯甲醇溶液，2%檸檬酸甲醇溶液四、實驗流程 槐米粗粉（10g）置250ml燒杯中，加入一定飽和石灰水，加熱，并維持pH89煮沸20分鐘，趁熱濾過

4、濾液 藥渣 用一定量飽和石灰水煮沸10分鐘，維持pH89 趁熱濾過 濾液 藥渣（×） 合并 在6070下用濃HCl調(diào)pH至45 靜置，抽濾 沉淀 低溫（60）干燥，稱重。按1：200的比例加水， 加熱使溶解，趁熱濾過 濾液 靜置，抽濾，減壓干燥，計算收率 蘆丁精制品五、實驗內(nèi)容1、蘆丁的提取精制稱取槐花米10g，置于干燥的研缽中用研缽擠壓成粗粉。稱取0.5-1g的石灰粉。置于干凈的小研缽中，加入5mL水后研成乳液備用。將槐花米粗粉置于250mL燒杯，加蒸餾水100-150mL，煮沸，在攪拌下加入石灰乳至pH8-9，在此條件下微沸20-30min，過濾。在60-70下，用濃鹽酸調(diào)濾液至

5、pH4-5，攪勻，靜置1-2h，過濾。沉淀用蒸餾水洗2-3次至中性，抽干，60干燥得蘆丁粗品。稱定蘆丁粗品重量，按1:200的比例懸浮與蒸餾水中，煮沸10-15min，趁熱過濾，冷卻濾液，充分靜置結(jié)晶。抽濾，60-70干燥得精制蘆丁。稱重，計算得率。2、蘆丁的鑒定取蘆丁適量，加乙醇使溶解，分成三份供下述試驗用：(1)鹽酸鎂粉試驗：取樣品液適量，加2滴濃HCl、再酌加少許鎂粉，即產(chǎn)生劇烈的反應(yīng)，并逐漸出現(xiàn)紅色至深紅色。(2)鋯-枸試驗：取樣品液適量，然后加 2ZrOCl2的甲醇溶液，注意觀察顏色變化，再加入2枸椽酸的甲醇溶液，并詳細(xì)記錄顏色變化。(3)-萘酚-濃硫酸反應(yīng)：取樣品液適量，加等體積的

6、l0-萘酚乙醇溶液，搖勻，沿管壁緩加濃硫酸，注意觀察兩液界面的顏色。六、注意事項1用石灰水調(diào)節(jié)蘆丁提取溶液的pH，既可以達(dá)到堿提取蘆丁的目的，還可以除去槐米中含有的大量粘液質(zhì)。但鈣離子濃度及pH值均不宜過高，否則多余的鈣能與蘆丁形成螯合物沉淀，同時黃酮母核在強堿性條件下易被破壞。2用HCl調(diào)pH時，應(yīng)注意pH不要過低，因為pH過低（pH2以下）會使蘆丁形成钅羊 鹽而使已形成的沉淀重新溶解，同時黃酮母核也會在強堿性條件下被破壞，導(dǎo)致收率下降。3 注意觀察槲皮素制備過程中的實驗現(xiàn)象。七、實驗報告記錄實驗主要步驟與實驗現(xiàn)象，并計算蘆丁的收率。判斷蘆丁的鑒定結(jié)果。八、思考題除了本實驗方法外，你能否根據(jù)

7、蘆丁的性質(zhì)設(shè)計自槐花米中提取蘆丁的另一種方法，并說明實驗原理。實驗二 精制蘆丁的含量測定藥物在通過鑒別無誤、雜質(zhì)檢查合格的基礎(chǔ)上進行含量測定。原料藥含量測定方法著眼于方法的準(zhǔn)確性與精密度，制劑含量測定方法重視方法專屬性，準(zhǔn)確性可稍差。含量表示方法為有效成分的量占總量的百分?jǐn)?shù)。準(zhǔn)確測定蘆丁原料藥含量，目的是為蘆丁制劑工藝提供可靠數(shù)據(jù)。一、 實驗?zāi)康?、熟悉可見分光光度計的構(gòu)造和使用操作2、掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定原料藥含量的方法二、 實驗原理多數(shù)黃酮類化合物有較明顯的紫外吸收，在甲醇溶液中由兩個主要吸收帶組成。帶在300-400nm區(qū)間，由B環(huán)桂皮酰系統(tǒng)引起，主要反應(yīng)B環(huán)取代情況。帶在240-285n

8、m區(qū)間，由A環(huán)苯甲酰系統(tǒng)引起，主要反應(yīng)A環(huán)取代情況。蘆丁在甲醇中的紫外吸收光譜圖如下圖，可以選擇360nm或276nm作為可見光分光光度計法測定蘆丁含量的測定波長。 三、 儀器與材料可見光分光光度計，電子天平，精制蘆丁，蘆丁對照品，鹽酸，比色皿，容量瓶，移液管，甲醇。四、 實驗內(nèi)容1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取蘆丁5.00mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，精密吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0分別置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以甲醇為空白對照，于360nm處測定吸光度，并繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、精制蘆丁的含量測定：精密稱取蘆丁原料藥5.00mg，置于100mL容量

9、瓶中，加甲醇定容，搖勻，精密平行吸取3.0兩份分別置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得供試液。去供試液于360nm處測定吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出供試液中蘆丁含量。3、計算公式：百分含量=測得量/供試量×100%五、 注意事項1、石英比色皿的正確使用和吸收度校正。2、吸收度讀數(shù)三次，取平均值計算含量。3、讀數(shù)后及時關(guān)閉光閘以保護光電管。六、 實驗報告記錄繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算精制蘆丁含量。七、 思考題黃酮類藥物的紫外光譜試驗中為什么選擇甲醇作為測定溶劑？實驗三 發(fā)酵法生產(chǎn)絲氨酸及鑒定絲氨酸是一種非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新陳代謝及肌肉的生長中發(fā)揮著作用，因為它有助于免疫血

10、球素和抗體的產(chǎn)生，維持健康的免疫系統(tǒng)也需要絲氨酸。絲氨酸在細(xì)胞膜的制造加工、肌肉組織和包圍神經(jīng)細(xì)胞的鞘的合成中都發(fā)揮著作用。因此，它在化工、制藥、化妝品及食品等工業(yè)及科學(xué)研究中有著廣泛的用途。目前，L-絲氨酸的生產(chǎn)方法有四種，即提取法、化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶法。本實驗采取發(fā)酵法生產(chǎn)絲氨酸，并用層析法進行鑒定。一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)絲氨酸的制備方法2、掌握絲氨酸鑒定的方法二、實驗原理一般直接發(fā)酵法生產(chǎn)絲氨酸的是細(xì)菌，由于絲氨酸處于氨基酸代謝的中間位置，直接發(fā)酵法得到絲氨酸的產(chǎn)量較低。工業(yè)生產(chǎn)中一般采用前體發(fā)酵法等，本實驗主要是驗證性實驗。紙上（薄板）層析法通過選用合適的層析劑，在一定的時間內(nèi)，把不

11、同種的氨基酸分離開來，然后根據(jù) Rf值以及不同氨基酸同吲哚醌顯色后的顏色差別來對氨基酸進行定性測定。如果用茚三酮作顯色劑，通過剪紙比色法，也可對氨基酸進行定量測定。它的原理與分配柱層析相同，所不同的是以濾紙作為支持劑。紙上層析以濾紙上的結(jié)合水作為固定相，以與水不相混溶的溶劑作為流動相。展開時，溶劑在濾紙上流動，樣品中各物質(zhì)在兩相中不斷進行分配，即發(fā)生一系列連續(xù)不斷的抽提作用。由于各物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)不同，因此它們的移動速度也就不相同，從而達(dá)到分離的目的。三、儀器與材料L-絲氨酸，正丁醇，丙酮，二乙胺，茚三酮，無水乙醇，微量進樣器，離心機，721 分光光度計，電子天平，層析薄板，層析缸 層析

12、溶劑正丁醇：冰醋酸：水：（V/V）= 12:3:5茚三酮配制方法： 1.5g 茚三酮+ 100mL 正丁醇+ 3.0mL 醋酸四、實驗內(nèi)容1、發(fā)酵過程：發(fā)酵培養(yǎng)基：MMI培養(yǎng)基（1000mL，作為甲基營養(yǎng)型細(xì)菌的基本培養(yǎng)基）：成分(NH4)2HPO4 3gK2HPO4 2gNaCl 1g微量元素micofinic acid(煙酸) 20gVB1 10griboflavin(VB2核黃素) 20gCalcium pantothenate(泛酸鈣) 20gPyridoxine HCl(鹽酸吡哆醇) 20gBiothin(生物素) 10gP-aminobenzoic acid(對氨基苯甲酸) 10g

13、成分MgSO4·7H2O 0.2gFeSO4·7H2O 10gMnSO4·4-6H2O 5mg pH 7.0將成分中微量元素及成分各成分先配成合適濃度的母液，成分和單獨稱取或量取，分別加入到400ml水中，完全溶解后，和混合，加水到950ml后，調(diào)節(jié)pH=7.0，加水至1000ml，固體培養(yǎng)基加入1.1%的瓊脂粉，于15MPa壓力下濕熱滅菌20分鐘。使用前加入1.2%的甲醇作為碳源（滅菌冷卻后在超菌臺內(nèi)加入甲醇）。2、靜息細(xì)胞反應(yīng)體系（1） 先接種一甲基營養(yǎng)型細(xì)菌單菌落到10mL甲基營養(yǎng)型細(xì)菌培養(yǎng)基中并于32搖床培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)接3-5mL培養(yǎng)物到100mL新

14、鮮的培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖床培養(yǎng)到OD600約0.8-1.0，8000rpm 4離心10分鐘以收集細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液并盡可能吸去所有培養(yǎng)液，用生理鹽水洗細(xì)胞3次，4離心10分鐘收集細(xì)胞，按以下次序，將各成分在universal瓶內(nèi)混合。Tris HCl 50mM甘氨酸 50mg甲醇 50mg菌體 30mg終體積 1mL（2）universal瓶置于32搖床培養(yǎng)48hr。（3）13000rpm離心10分鐘，取上清液于-20保存。3、絲氨酸鑒定 (1) 點樣：將濾紙裁成適當(dāng)大小，寬度大約為 1525cm，長度根據(jù)樣品的個數(shù)來決定。用鉛筆在距底邊 23cm 的地方劃一道直線（稱為原線），線上每隔 11.5cmL，輕輕點在紙上的所點位置。所測樣品點完后，取標(biāo)準(zhǔn) L-絲氨酸樣品，以合適的濃度點樣，作標(biāo)準(zhǔn)樣對照。點樣時應(yīng)保持濾紙潔凈。(2) 展開：展開操作時，將溶劑加入到放平的層析缸內(nèi)。將濾紙放入缸內(nèi)，但勿使它接觸層析劑溶劑，然后密閉容器進行平衡。平衡的時間是 1h。平衡結(jié)束后，將濾紙一端緩緩放入層析劑溶劑中，這時注意要使紙的底部平穩(wěn)地一齊浸入液體。此時開始展開。當(dāng)溶劑前沿到達(dá)離濾紙另一端 11.5