1、微生物及發(fā)酵工程摘要 微生物是發(fā)酵工程的靈魂，近年來(lái)，對(duì)于發(fā)酵工程的生物學(xué)屬性的認(rèn)識(shí)愈益明朗化，發(fā)酵工程正在走近科學(xué)。人們熟知的利用酵母菌發(fā)酵制造啤酒、果酒、工業(yè)酒精，乳酸菌發(fā)酵制造奶酪和酸牛奶，利用真菌大規(guī)模生產(chǎn)青霉素等都是這方面的例子。本文主要講述了微生物發(fā)酵工程技術(shù)及新的研究方向。關(guān)鍵詞 微生物發(fā)酵 歷史 發(fā)酵技術(shù) 應(yīng)用一、微生物工程的發(fā)酵歷史發(fā)酵工程1是指采用工程技術(shù)手段，利用生物（主要是微生物）和有活性的離體酶的某些功能，為人類生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品，或直接用微生物參與控制某些工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程的一種技術(shù)。20世紀(jì)20年代，酒精、甘油和丙酮等發(fā)酵工程，屬于厭氧發(fā)酵。從那時(shí)起，發(fā)酵工程開始在不斷

2、地發(fā)展和完善。 20世紀(jì)40年代初，隨著青霉素的發(fā)現(xiàn)，抗生素發(fā)酵工業(yè)逐漸興起。由于青霉素產(chǎn)生菌是需氧型的，微生物學(xué)家就在厭氧發(fā)酵技術(shù)的基礎(chǔ)上，成功地引進(jìn)了通氣攪拌和一整套無(wú)菌技術(shù)，建立了深層通氣發(fā)酵技術(shù)。它大大促進(jìn)了發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展，使有機(jī)酸、微生素、激素等都可以用發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)。 1957年，日本用微生物生產(chǎn)谷氨酸成功，如今20種氨基酸都可以用發(fā)酵法生產(chǎn)。目前，代謝控制發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于核苷酸、有機(jī)酸和部分抗生素等的生產(chǎn)中。 20世紀(jì)70年代以后，基因工程、細(xì)胞工程等生物工程技術(shù)的開發(fā)，使發(fā)酵工程進(jìn)入了定向育種的新階段，新產(chǎn)品層出不窮。 20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著學(xué)科之間的不斷交叉和滲透，微

3、生物學(xué)家開始用數(shù)學(xué)、動(dòng)力學(xué)、化工工程原理、計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行綜合研究，使得對(duì)發(fā)酵過(guò)程的控制更為合理。在一些國(guó)家，已經(jīng)能夠自動(dòng)記錄和自動(dòng)控制發(fā)酵過(guò)程的全部參數(shù)，明顯提高了生產(chǎn)效率。二、微生物發(fā)酵工程2的內(nèi)容(1)、菌種的選育方法：A、從自然界中先分離出相應(yīng)的菌種；B、利用誘變篩選出符合生產(chǎn)要求的優(yōu)良菌種 ；C、利用基因工程、細(xì)胞工程的方法構(gòu)建工程細(xì)胞或工程菌。例：可將人工合成的人的胰島素基因與大腸桿菌的質(zhì)粒結(jié)合，形成重組DNA，再把重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)形成工程菌。通過(guò)篩選則可培養(yǎng)出能生產(chǎn)人的胰島素的菌種。(2)、培養(yǎng)基的配置及原則：A、根據(jù)不同的菌種，選擇不同的材料配制培養(yǎng)基。B、

4、配制的培養(yǎng)基應(yīng)滿足微生物在碳源、氮源長(zhǎng)因子、水、無(wú)機(jī)鹽等方面的營(yíng)養(yǎng)要求，并為微生物提供適宜的PH。C、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)，以利于產(chǎn)物的合成。D、培養(yǎng)基在滿足微生物的營(yíng)養(yǎng)需求的基礎(chǔ)上應(yīng)盡量降低生產(chǎn)成本，以得到更高的經(jīng)濟(jì)效益。(3)、滅菌及原因：在發(fā)酵過(guò)程中如混入其他微生物，將與菌種形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，對(duì)發(fā)酵過(guò)程造成不良影響 。舉例：如果在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中混人放線菌，則放線菌分泌的抗生素就會(huì)使大量的谷氨酸棒狀桿菌死亡。如果在青霉素生產(chǎn)過(guò)程中污染了雜菌，這些雜菌則會(huì)分泌青霉素酶，將合成的青霉素分解掉。 (4)、擴(kuò)大培養(yǎng)和接種：擴(kuò)大培養(yǎng)是將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的菌體分開，分頭進(jìn)行培養(yǎng)，以促使菌體數(shù)量快速增加，能在短

5、時(shí)間里得到大量的菌體 接種：接種過(guò)程要注意防止雜菌污染。(5)、發(fā)酵過(guò)程：發(fā)酵產(chǎn)物主要在菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定期產(chǎn)生。在發(fā)酵過(guò)程中隨時(shí)取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)目、產(chǎn)物濃度以了解發(fā)酵進(jìn)程，及時(shí)添加必需的培養(yǎng)基成分來(lái)延長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期的時(shí)間，以得到更多的發(fā)酵產(chǎn)物 。發(fā)酵生產(chǎn)中溫度、pH、溶氧量等對(duì)發(fā)酵過(guò)程有重大影響。(6)、分離提純發(fā)酵產(chǎn)物不同，分離提純的方法會(huì)有所不同。一般方法是：代謝產(chǎn)物：蒸餾、萃取、離子交換等方法。菌體本身：過(guò)濾、沉淀。三、微生物發(fā)酵過(guò)程的多種培養(yǎng)技術(shù)1、分批培養(yǎng)分批發(fā)酵是一種封閉培養(yǎng)系統(tǒng), 含有初始限制量的基質(zhì)的發(fā)酵方式, 菌體接種到培養(yǎng)基后除了氣體流通外，發(fā)酵液始終留在生物反應(yīng)器內(nèi)

6、。分批培養(yǎng)過(guò)程中微生物生長(zhǎng)一般可以分為四個(gè)階段:延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、衰減期、穩(wěn)定期，在接種后一段時(shí)間, 細(xì)胞數(shù)目和菌體量不變，因菌體對(duì)新的生長(zhǎng)環(huán)境有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程,所以工業(yè)生產(chǎn)從發(fā)酵產(chǎn)率和發(fā)酵指數(shù)以及避免染菌考慮,應(yīng)盡量縮小延滯期，擴(kuò)大生長(zhǎng)期。延滯期過(guò)后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 ，如果條件良好, 營(yíng)養(yǎng)充分,微生物會(huì)以最大生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)3，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間, 由于養(yǎng)分的消耗和微生物產(chǎn)物的分泌,生長(zhǎng)速率逐漸減速直到停止 ，從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期到穩(wěn)定期有一個(gè)過(guò)渡,稱為衰減期 , 衰減期的長(zhǎng)短取決于菌對(duì)限制性基質(zhì)的親和力 ,例如對(duì)基質(zhì)的親和力高( 具有低 Ks值) ,則衰減期很短,反之 ,則長(zhǎng)4；當(dāng)生長(zhǎng)率下降為零時(shí), 便進(jìn)入穩(wěn)

7、定期,但是穩(wěn)定期菌體代謝仍然十分活躍,有許多次級(jí)代謝產(chǎn)物在此時(shí)合成。分批培養(yǎng)的產(chǎn)物大概可以分為兩種: (l)與生長(zhǎng)聯(lián)動(dòng)的產(chǎn)物；(2)與生長(zhǎng)不聯(lián)動(dòng)的產(chǎn)物。前者相當(dāng)于初級(jí)代謝產(chǎn)物, 由正在生長(zhǎng)的細(xì)胞合成,后者相當(dāng)于次級(jí)代謝產(chǎn)物,多在穩(wěn)定期中合成5，若所需產(chǎn)物不同,要選擇不同的分批發(fā)酵工藝，對(duì)于產(chǎn)物是細(xì)胞本身, 可采用能支持最高生長(zhǎng)量的培養(yǎng)條件；對(duì)于產(chǎn)物是初級(jí)代謝產(chǎn)物, 可設(shè)法延長(zhǎng)與產(chǎn)物關(guān)聯(lián)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； 對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物, 可縮短對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，延長(zhǎng)穩(wěn)定期 ,或降低對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率, 從而使次級(jí)代謝產(chǎn)物更早形成。2、分批補(bǔ)料培養(yǎng)在發(fā)酵開始時(shí)投人一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,到發(fā)酵過(guò)程的適當(dāng)時(shí)期，開始連續(xù)補(bǔ)加

8、碳能源或氮源或和其他必需基質(zhì),直至發(fā)酵液體積達(dá)到發(fā)酵罐最大操作容積后, 將發(fā)酵液一次全部放出, 這種操作方式稱為分批補(bǔ)料發(fā)酵6。 分批補(bǔ)料培養(yǎng), 最初以分批方式建立 , 因?yàn)楹?jiǎn)單分批發(fā)酵不能維持一定的菌體濃度, 當(dāng)基質(zhì)消耗后菌體將加速死亡, 使活細(xì)胞數(shù)量迅速下降 ,分批補(bǔ)料由于持續(xù)供給菌體維持和生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng),故能保持發(fā)酵液中有較高的活菌體濃度,從而克服上述缺點(diǎn)，另外,不斷的補(bǔ)料稀釋, 對(duì)降低發(fā)酵液的粘度, 改善流變學(xué)性質(zhì),強(qiáng)化好氧發(fā)醉的供氧,也是十分有利的。分批補(bǔ)料發(fā)酵目前已廣泛應(yīng)用于各種發(fā)酵產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)中。優(yōu)點(diǎn)在于使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度: (l)可以除去快速利用碳源的阻遏效應(yīng),并

9、維持適當(dāng)?shù)木w濃度,使不至于加劇供氧的矛盾；(2)避免培養(yǎng)基積累有毒代謝物，與連續(xù)發(fā)酵相比, 分批補(bǔ)料發(fā)酵不需要嚴(yán)格的無(wú)菌條件,也不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異等問(wèn)題 ,其應(yīng)用范圍十分廣泛, 包括抗生素、氨基酸 、酶蛋白、核昔酸 、有機(jī)酸及高聚物等 。3、半連續(xù)培養(yǎng)一部分培養(yǎng)物有規(guī)律的間隔收獲以及被等體積新鮮培養(yǎng)基替換的培養(yǎng)方式稱為半連續(xù)培養(yǎng)7。半連續(xù)培養(yǎng)在分批補(bǔ)料的基礎(chǔ)上，間歇放掉部分發(fā)酵液,與其他發(fā)酵罐的發(fā)酵液一起進(jìn)行提煉, 通常在行業(yè)中稱為帶放，這種方式可以通過(guò)補(bǔ)充養(yǎng)分和放掉部分發(fā)酵液 ,使發(fā)酵持續(xù)下去, 因?yàn)樵诎l(fā)醉中有害物的積累,也會(huì)造成合成產(chǎn)物遭到抑制, 所以放掉一部分發(fā)酵液再補(bǔ)人適當(dāng)原料

10、, 使得營(yíng)養(yǎng)充分, 代謝有害物濃度稀釋, 從而有利于產(chǎn)物的繼續(xù)合成。不足之處: (1)放掉發(fā)酵液的同時(shí)也丟失了未利用的養(yǎng)分和處于生長(zhǎng)旺盛的菌體；(2)定期補(bǔ)充和帶放使發(fā)酵液稀釋,送去提煉的發(fā)酵液體積更大；(3) 發(fā)酵液稀釋后可能產(chǎn)生更多的有害代謝物, 最終限制發(fā)酵產(chǎn)物的合成；(4) 一些經(jīng)代謝產(chǎn)生的前體可能丟失；(5)有利于非產(chǎn)生菌突變株的生長(zhǎng)，因此,采用該法時(shí)要考慮到這些限制,要具體問(wèn)題具體分析。4 、連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是發(fā)酵過(guò)程中一面補(bǔ)入新鮮的料液,一面以相同的流速放料，維持發(fā)酵液在原來(lái)的體積。連續(xù)發(fā)酵8是一個(gè)開放系統(tǒng),通過(guò)連續(xù)流加新鮮培養(yǎng)基并以相同的流量連續(xù)地排出發(fā)酵液,可以使微生物細(xì)胞群

11、體保持穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)狀態(tài),并以發(fā)酵中的各個(gè)變量都能達(dá)到恒定值而區(qū)別于瞬變狀態(tài)的分批發(fā)酵 ，連續(xù)發(fā)酵對(duì)于微生物典型的生長(zhǎng)曲線實(shí)際上是盡量縮短或消除延滯期, 使菌體一直處于良好的條件下, 以最大生長(zhǎng)率生長(zhǎng)，獲得較高的菌體量。連續(xù)發(fā)酵包括恒化器發(fā)酵和恒濁器發(fā)酵，前者以某種必需營(yíng)養(yǎng)作為生長(zhǎng)限制基質(zhì), 通過(guò)控制其流加速率，造成適應(yīng)這種流加條件的生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)速率；后者控制生長(zhǎng)限制基質(zhì)的流量以維持恒定的菌體密度，無(wú)論恒化器還是恒濁器, 除了控制進(jìn)出口物料流量外，許多重要的環(huán)境因素如溫度、pH、空氣流量、壓力等也必須加以控制以保持穩(wěn)定。同時(shí)，還應(yīng)具有良好的攪拌混合條件，使整個(gè)發(fā)酵液中所有物質(zhì)的分布都達(dá)

12、到均一，以保證流出液中各物質(zhì)的濃度與反應(yīng)器中的濃度相同。一般多用恒化器 ,但有時(shí)恒化器也會(huì)有偏差或異常, 由于不完全的攪拌和器壁貓附,恒化器的改良可以通過(guò)增加容器的級(jí)數(shù)，將菌體反饋到容器中等手段來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如, 多級(jí)恒化器、內(nèi)部反饋系統(tǒng)和外部反饋系統(tǒng)。連續(xù)發(fā)酵具有的優(yōu)點(diǎn):(l) 能夠維持較低的基質(zhì)濃度；(2)可以維持穩(wěn)定的操作條件,連續(xù)培養(yǎng)具有穩(wěn)態(tài)優(yōu)勢(shì), 從而使產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量也相應(yīng)的保持穩(wěn)定；(3)便于自動(dòng)控制, 有效的實(shí)現(xiàn)機(jī)械化和自動(dòng)化, 降低勞動(dòng)強(qiáng)度,減少操作人員與病原微生物和毒性產(chǎn)物接觸的機(jī)會(huì)；(4)減少設(shè)備清洗、準(zhǔn)備和滅菌等非生產(chǎn)占用時(shí)間，提高設(shè)備利用率，節(jié)省勞動(dòng)力和工時(shí)；(5)由于滅菌

13、次數(shù)少，使測(cè)量?jī)x器探頭的壽命得以延長(zhǎng)；(6)容易對(duì)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化,有效的提高發(fā)酵產(chǎn)率。在大規(guī)模生產(chǎn)中也有不足之處：(l)對(duì)儀器設(shè)備及控制元件的技術(shù)要求較高, 從而增加投資成本；(2)連續(xù)培養(yǎng)是開放系統(tǒng)，并且發(fā)醉周期長(zhǎng)，有極大的可能性造成菌體染菌，這也是生產(chǎn)成敗的關(guān)鍵問(wèn)題；(3)在長(zhǎng)期的發(fā)酵過(guò)程中，微生物容易發(fā)生變異, 菌株退化問(wèn)題也限制了大型連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)，生產(chǎn)慢的高產(chǎn)菌株很可能逐漸被生長(zhǎng)快的低產(chǎn)變異菌株取代，從而降低生產(chǎn)效率；(4)絲狀真菌菌體容易附著在器壁上生長(zhǎng)以及在發(fā)酵液內(nèi)結(jié)團(tuán), 給連續(xù)發(fā)酵操作帶來(lái)困難。鑒于以上情況, 連續(xù)發(fā)酵目前主要用于研究工作。5 、其他技術(shù)(1)膜分離與發(fā)酵的耦合為解

14、決產(chǎn)物反饋?zhàn)瓒艉痛x有害產(chǎn)物限制的問(wèn)題,理想的辦法是在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物積累時(shí)將產(chǎn)物即使從發(fā)酵液中分離與回收，膜分離技術(shù)與發(fā)酵的耦合可避免菌體丟失這一缺點(diǎn),可排除有害代謝物,避免或減輕產(chǎn)物的反饋抑制，從而使高密度細(xì)胞培養(yǎng)成為可能, 更合理的利用微生物的生產(chǎn)性能，以提高產(chǎn)率。與膜結(jié)合的生物反應(yīng)器在這方面最能發(fā)揮他的特長(zhǎng)，膜生物反應(yīng)器是一種借助于膜截留住酶、細(xì)胞器、微生物、動(dòng)物或植物細(xì)胞,用以生產(chǎn)較為貴重的物質(zhì)，或進(jìn)行污水處理，膜生物反應(yīng)器可以分為兩類:第一類用膜保留培養(yǎng)物, 使之懸浮于生物反應(yīng)器中, 不會(huì)因微濾或透析作用是細(xì)胞流失, 因而水流和培養(yǎng)物在反應(yīng)系統(tǒng)中的持留時(shí)間各異； 第二類把生物催化劑固

15、定在膜表面上或網(wǎng)格中或夾持在兩張膜的中間, 因此, 生物催化劑是不能運(yùn)動(dòng)的。膜技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)除了排除有害代謝物、避免反饋抑制外, 可以提高發(fā)酵中有機(jī)酸的產(chǎn)率, 乙醇、丙酮、丁醇發(fā)酵的反饋抑制 ,在基因工程菌的培養(yǎng)、超氧歧化酶生產(chǎn)、單克隆抗體生產(chǎn)等方面都能達(dá)到較高的產(chǎn)率。(2)高細(xì)胞密度培養(yǎng)代謝產(chǎn)物的合成是靠菌( 生產(chǎn)者) 來(lái)完成的，量越多，自然產(chǎn)量就越大, 條件是菌的生產(chǎn)力能保持在最佳狀態(tài)和具備適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)條件，包括足夠的產(chǎn)物合成所需的基質(zhì)、前體、誘導(dǎo)物等和沒有有害代謝物的積累10 。高細(xì)胞密度培養(yǎng)曾成功地應(yīng)用于各種代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，高細(xì)胞密度培養(yǎng)一般指微生物沉沒培養(yǎng)時(shí)其細(xì)胞濃度達(dá)到100g/L以上的

16、水平，最早應(yīng)用于生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白、乙醇等，可用于高細(xì)胞密度培養(yǎng)的生物反應(yīng)器類型有常用的攪拌罐和帶有外置式或內(nèi)置式細(xì)胞持留裝置的反應(yīng)器, 一般多用于研究，在工業(yè)生產(chǎn)中，還是采用一般的攪拌罐與補(bǔ)料工藝進(jìn)行高細(xì)胞密度培養(yǎng), 因?yàn)樗?jiǎn)單、生產(chǎn)潛力高,適合于進(jìn)行多參數(shù)的相關(guān)控制11。四、發(fā)展趨勢(shì)(1)、菌種改良青霉素和鏈霉素的相繼發(fā)現(xiàn),開啟了現(xiàn)代微生物藥學(xué)的大門。微生物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)(比如:抗生素、維生素、氨基酸、酶等)滲透了人們的生活, 并在醫(yī)藥、食品和化工工業(yè)中有著不可取代的地位，但是,由于剛從自然界分離得到的原始菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)量往往很低,遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)需要,所以, 通過(guò)菌種改良手段篩選高產(chǎn)菌種,

17、從而降低生產(chǎn)成本的工作就顯得尤為重要。早期的菌種改良思路主要集中于隨機(jī)篩選和簡(jiǎn)單的理性篩選,利用這些傳統(tǒng)方法進(jìn)行菌種改良12也取得了許多成功,例如: 最初的青霉素生產(chǎn)菌產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum NRRL 1951)的產(chǎn)量為60 mg/L, 經(jīng)過(guò)多年的傳統(tǒng)選育,如今的生產(chǎn)菌種產(chǎn)量已到達(dá) 70 g/L。但是,傳統(tǒng)方法耗時(shí)、費(fèi)力、工作量大以及誘變結(jié)果不具定向性的缺點(diǎn)隨著時(shí)間推移也逐漸暴露出來(lái) ，隨著 DNA 重組技術(shù)、原生質(zhì)體融合和組學(xué)研究的應(yīng)用日益廣泛, 菌種改良的新方法和新策略如雨后春筍,層出不窮。如今,對(duì)于那些生化途徑清晰的菌株,通過(guò)代謝工程策略可以更容易地選擇

18、菌種改良靶點(diǎn)；而對(duì)那些生化代謝途徑不清楚的菌株,也可以直接通過(guò)基因組改組(Genome shuffling)、系統(tǒng)生物技術(shù)、核糖體工程和表觀遺傳修飾等手段進(jìn)行遺傳選育,從而獲得理想突變表型。新方法和新策略的出現(xiàn),使得微生物菌種選育的工作更具定向性和正突變性,為構(gòu)造高產(chǎn)菌種提供了更廣闊的空間。以下為近年來(lái)菌種改良相關(guān)領(lǐng)域的最新方法和策略的進(jìn)展。A、代謝工程 代謝工程是使用現(xiàn)代基因工程技術(shù)對(duì)產(chǎn)生菌細(xì)胞進(jìn)行定向改造的優(yōu)化手段。以了解相關(guān)代謝產(chǎn)物的生化反應(yīng)途徑為重點(diǎn)，應(yīng)用多種不同的代謝分析手段確定生物合成的“瓶頸”,集中于細(xì)胞代謝流的控制，比如:調(diào)整參與目的抗生素合成的前體化合物的代謝通路，以提高目的

19、代謝物的產(chǎn)量或產(chǎn)率；最小限度地限制流向副產(chǎn)物的代謝流，排除某些不需要的副產(chǎn)物的合成；使微生物合成新的代謝產(chǎn)物等。應(yīng)用代謝工程進(jìn)行微生物的遺傳育種主要體現(xiàn)在提高途徑限制酶的活力、對(duì)全局性調(diào)控基因或整個(gè)基因簇的操作、增強(qiáng)菌種代謝產(chǎn)物的耐受性及其生物合成途徑的異源表達(dá)。B、基因組改組 基因組改組(Genome shuffling)9技術(shù)是結(jié)合傳統(tǒng)菌種改良技術(shù)與細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展的一種新興菌種改良手段, 它主要是指將傳統(tǒng)育種得到的具有不同表型的菌株進(jìn)行全基因重組,從而使得這些菌株的優(yōu)良性狀能集于一身。C、系統(tǒng)生物技術(shù) 近年來(lái), 隨著組學(xué)(基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組等)和高通量篩選技術(shù)的蓬勃發(fā)展, 探索細(xì)胞

20、內(nèi)復(fù)雜的次級(jí)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)逐漸成為可能。通過(guò)系統(tǒng)生物技術(shù)將獲得的相關(guān)組學(xué)數(shù)據(jù)整合,通過(guò)計(jì)算機(jī)建模和預(yù)測(cè),從而確定相關(guān)的遺傳操作靶點(diǎn),使微生物的遺傳育種更具定向性。D、核糖體工程 微生物在惡劣的環(huán)境下,比如:碳源、氮源或者磷酸鹽營(yíng)養(yǎng)突然匱乏時(shí), 自身的rRNA以及tRNA合成受到限制,從而導(dǎo)致蛋白合成水平低,啟動(dòng)抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成,這種應(yīng)答機(jī)制被稱作應(yīng)急反應(yīng)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),小分子化合物四磷酸鳥苷(ppGpp)是導(dǎo)致微生物出現(xiàn)應(yīng)急反應(yīng)中的主要響應(yīng)因子,它能直接作用于RNA 聚合酶, 調(diào)節(jié)tRNA 和 mRNA 合成水平。實(shí)驗(yàn)表明, 作用位點(diǎn)與 ppGpp 鄰近的抗生素利福平以及作用位點(diǎn)在核糖

21、體上的抗生素(鏈霉素、慶大霉素、巴龍霉素、硫鏈絲菌肽)等,都能模擬ppGpp 的作用,使微生物產(chǎn)生類似應(yīng)急反應(yīng)的現(xiàn)象,從而使得菌株相關(guān)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量增加或者產(chǎn)生新型化合物,基于這些發(fā)現(xiàn),提出了核糖體工程育種技術(shù)的概念。E、表觀遺傳修飾 上述的微生物遺傳育種的新方法與新策略主要集中于提高已知目的代謝物的產(chǎn)量，其實(shí)尋找新結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物也是微生物遺傳育種的重要面。近年來(lái)，由于真菌具有強(qiáng)大的生物酶系和代謝系統(tǒng)的特殊性等特點(diǎn)，其產(chǎn)生的一系列新穎的化學(xué)小分子實(shí)體引起了廣泛微物藥學(xué)家的重視。通“基因組挖掘”技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，真菌基因組中存在廣泛的次級(jí)代謝生物成途徑,但由于實(shí)驗(yàn)室條件對(duì)于菌株的“馴化”,大量潛在的生

22、物合成基因簇仍處于沉默狀態(tài), 菌株實(shí)際產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù) 期。雖然通過(guò)改變養(yǎng)條件或分子操作手段能適當(dāng)激活一些沉默基因的表達(dá)，但是操作基因未知性以及異宿主的兼容性等原因依然成為限制的主要因素。因此, 尋找一種能效激活真菌沉默的次級(jí)代謝生物合成基因的遺傳育種方法迫在眉睫。(2)、高效呼吸膜固態(tài)發(fā)酵近20多年來(lái)人們逐漸認(rèn)識(shí)到抗生素對(duì)人和動(dòng)物存在的潛在危害，因此，在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究和動(dòng)物養(yǎng)殖中，人們不得不花費(fèi)大量心血研究抗生素替代品及其應(yīng)用推廣。農(nóng)業(yè)部飼料工程研究中心和晟亞育達(dá)生物科技有限公司經(jīng)過(guò)共同努力，結(jié)合傳統(tǒng)發(fā)酵飼料技術(shù)和傳統(tǒng)食品發(fā)酵防雜菌污染經(jīng)驗(yàn)，發(fā)明了帶呼吸膜可移飼料發(fā)酵技術(shù)。該技術(shù)關(guān)

23、鍵在于發(fā)明了一種能使微生物有益菌在自然狀態(tài)下保持高活性生長(zhǎng)代謝的生命呼吸裝置- 呼吸膜它可以使活菌，主要是乳酸桿菌和酵母菌在自然條件下能夠長(zhǎng)期保持高活性，巧妙地解決了微生物固態(tài)發(fā)酵散熱、厭氧控制以及包裝、儲(chǔ)運(yùn)、穩(wěn)定性等難題，高效呼吸膜固態(tài)發(fā)酵核心技術(shù)在于抗生生產(chǎn)技術(shù)是以各種輕工業(yè)副產(chǎn)物或雜粕作為發(fā)酵底物，原料不需要經(jīng)過(guò)消毒，采用獨(dú)創(chuàng)的微生物呼吸膜和先包裝后發(fā)酵的移動(dòng)式微生物厭氧固態(tài)發(fā)酵工藝，低成本、規(guī)?；纳a(chǎn)，含高量有益微生物。復(fù)合培養(yǎng)物每克成品發(fā)酵料中，乳酸菌活菌數(shù)可以達(dá)到10億個(gè)。我國(guó)現(xiàn)有生豬飼養(yǎng)條件下，在配合飼料中添加15-25% 發(fā)酵飼料就可以完全替代抗生素，在基本不增加飼養(yǎng)成本條件

24、下，實(shí)現(xiàn)生豬從15 千克至出欄無(wú)抗生素飼養(yǎng)，豬肉品質(zhì)達(dá)到歐盟安全肉品要求。高效呼吸膜固態(tài)發(fā)酵技術(shù)對(duì)實(shí)現(xiàn)我國(guó)飼料安全有重大意義，通過(guò)微生物發(fā)酵無(wú)抗飼料，實(shí)現(xiàn)生豬無(wú)抗生素飼養(yǎng)技術(shù)項(xiàng)目的實(shí)施具有劃時(shí)代意義。 此技術(shù)將解決飼料中全面禁止使用抗生素難題，可以提高酒糟、醋渣、果渣、棉籽粕、菜籽粕等非糧食飼料資源利用率3-5%。 在動(dòng)物飼料中添加量可以達(dá)到20-40% 且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低、投資少、可操作性強(qiáng)、成品使用方便、特別適合廣大農(nóng)村養(yǎng)殖場(chǎng)戶，對(duì)解決人畜爭(zhēng)糧及飼料數(shù)量安全問(wèn)題建設(shè)節(jié)約型社會(huì)具有重大意義。(3)、利用代謝工程技術(shù)提高工業(yè)微生物對(duì)脅迫的抗性13代謝工程是微生物菌種改造的平臺(tái)技術(shù)，它通過(guò)修

25、飾和優(yōu)化微生物代謝網(wǎng)絡(luò)與表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)14，改善細(xì)胞的生理功能，從而將微生物改造成“細(xì)胞工廠”生產(chǎn)有用的物質(zhì)，是一個(gè)極具吸引力的研究熱點(diǎn)。A、借鑒傳統(tǒng)代謝工程技術(shù)構(gòu)建脅迫抗性突變株a構(gòu)建新的代謝途徑合成脅迫抗性物質(zhì)；b拓展已有的代謝途徑組成完整有效的抗脅迫途徑；c 削弱已有的代謝途徑。B、借鑒反向代謝工程技術(shù)構(gòu)建脅迫抗性突變株a 在異源微生物或相關(guān)模型系統(tǒng)中獲得預(yù)期的表型； b確定導(dǎo)致這一表型的遺傳基因； c通過(guò)遺傳改造使這一表型在特定微生物中表達(dá)。四、微生物發(fā)酵工程的應(yīng)用(1)、食品工業(yè)方面：酒類：如果酒（葡萄酒等）、米酒、白酒等；(2)、有機(jī)溶劑：如乙醇、丙酮、丁醇、甘油；(3)、有機(jī)酸：如

26、醋酸、乳酸、葡萄糖酸、檸檬酸、酒石酸、衣康酸、長(zhǎng)鏈二元酸（以十三到十八碳的直鏈烷烴為原料的發(fā)酵產(chǎn)品）；(4)、氨基酸：如谷氨酸（谷氨酸鈉又稱味精）、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、精氨酸、絲氨酸、丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等；核苷酸及其類似物：如鳥嘌呤核苷酸（5-GMP）、肌苷酸（5-IMP）、腺嘌呤核苷酸（5-AMP）、黃嘌呤核苷酸（5-XMP）等；(5)、抗生素：包括疾病治療的藥用抗生素，農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)用于防病抗病的抗生素，如青霉素、頭孢霉素、鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、紅霉素、稻瘟素、井崗霉素、春日霉素等等；(6)、多糖：如黃原膠、普魯蘭等；(7)、酶15：如堿性蛋白酶

27、（洗滌劑）、中性蛋白酶（洗滌劑等）、脂肪酶（洗滌劑）、-淀粉酶（淀粉水解）、葡萄糖淀粉酶（葡萄糖生產(chǎn)）、葡萄糖異構(gòu)酶（高果糖糖漿生產(chǎn)）、纖維素酶（纖維素水解、紡織品加工）、果膠酶（食品、水果加工等）、凝乳酶（奶酪制造）、青霉素酰化酶（青霉素母核生產(chǎn)）、天冬氨酸酶（L天冬氨酸制造）、延胡索酸酶（L蘋果酸制造）、葡萄糖氧化酶（檢驗(yàn)葡萄糖）、乳酸脫氫酶（臨床檢驗(yàn)）、鏈激酶（治療血栓）等，目前世界上有100多種酶用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，應(yīng)用于不同領(lǐng)域。參考文獻(xiàn)1儲(chǔ)炬、李友榮. 現(xiàn)代工業(yè)發(fā)醉調(diào)控學(xué). 化學(xué)工業(yè)出版社,2002：230-250.2熊宗貴. 發(fā)酵工藝原理. 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 1995 : 171-178.3PF Stanbury , A Whitaker, S Hall. Principles of FermentationTechnology ,1995: 13-33.4俞俊棠、唐孝宣. 生物工藝學(xué)( 上冊(cè)) . 華東理工大學(xué)出版社2003: 150 - 167.5Pirt SJ.Principles Of Microbe and cell Cultivation .Blackwell ,Oxf