1、 姓名：鄭錦濱 學(xué)號：22320131151432專業(yè)：海洋生物學(xué)目錄1、 概述概述2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成3、 血藍(lán)蛋白與血藍(lán)蛋白與PO4、環(huán)境因子對、環(huán)境因子對PO的影響的影響5、 proPO系統(tǒng)激活途徑系統(tǒng)激活途徑1、 概述概述 甲殼動物缺乏后天獲得的特異性免疫功能，但是它們有比較完善的非特異性免疫系統(tǒng)，能夠迅速識別和有效清除入侵的微生物。非特異性免疫系統(tǒng)是一種比較原始的免疫系統(tǒng)，它存在于所有多細(xì)胞生物體，是免疫防御的第一線，分為細(xì)胞免疫和體液免疫。甲殼動物的細(xì)胞免疫包括吞噬作用、包圍化及結(jié)節(jié)的形成；體液免疫包括酚氧化酶原激活系統(tǒng)(prophenoloxida

2、se activating system, proPO激活系統(tǒng))、各種凝集素及抗菌肽等。1、 概述概述 Fig. 1. Outline of the shrimp immune system (mainly the humoral immune response)1、 概述概述 proPO系統(tǒng)是一種類似于脊椎動物補(bǔ)體系統(tǒng)的酶級聯(lián)系統(tǒng)，在甲殼動物的非特異性免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用。它由酚氧化酶(phenoloxidase, PO)、酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO)、絲氨酸蛋白酶(serine protei nases, SPs)、模式識別蛋白(patten rec

3、ognition proteins, PRPs)和蛋白酶抑制劑(proteinase inhibitor)等構(gòu)成。該系統(tǒng)中的因子以非活化狀態(tài)存在于血顆粒細(xì)胞中，極微量的1、 概述概述 微生物多糖如 -1,3-葡聚糖(-1,3-glucans, G)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、肽聚糖(peptidoglycan , PGN)等和鈣離子、胰蛋白、SDS可激活該系統(tǒng)，使proPO 變成PO，并產(chǎn)生一系列有生理活性的物質(zhì)，通過包囊與黑化作用抑制和殺死病原體，達(dá)到免疫效果。另外其在表皮硬化和傷口愈合中也發(fā)揮著重要的作用。2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成

4、2.1 模式識別蛋白模式識別蛋白(patten recognition proteins，PRPs) 無脊椎動物行使非特異性免疫反應(yīng)首先是通過體內(nèi)特定蛋白對病原微生物表面的病原相關(guān)分子模式(pathogen- associated molecular patterns , PAMPs)，包括革蘭氏陰性菌的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、革蘭氏陽性菌的肽聚糖(peptidoglycan , PGN)及真菌的-1,3-葡聚糖(-1,3-glucans, G)進(jìn)行識別，這種特定蛋白就稱為模式識別蛋白(patten recognition proteins, PRPs)。2、

5、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成 目前，已在對蝦鑒定出11種PRPs，包括：-1,3-葡聚糖酶相關(guān)蛋白(-1,3-glucanase-related proteins, BGRP)-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白( -1,3-glucan-binding proteins, BGBPs) C型凝集素(C-type lectins, CTLs)清道夫受體(scavenger receptors, SCR)硫依賴型凝集素(galectins)纖維蛋白原相關(guān)蛋白(fibrinogen-related proteins, FREP)含硫酯鍵蛋白(thioester-containing pro

6、tein, TEP)唐氏綜合癥細(xì)胞粘附分子(Down syndrome cell adhesion molecule, DSCAM)絲氨酸蛋白酶同系物(serine protease homologs, SPH)反式激活應(yīng)答RNA結(jié)合蛋白(trans-activation response RNA-binding protein, TRBP)Toll樣受體(Toll-like receptors)2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成PRRsSpeciesReceptor numberFeatured domainLigandsBGRPLitopenaeus vannameiMa

7、rsupenaeus japonicusPenaeus MonodonFenneropenaeus chinensisLitopenaeus stylirostrisFenneropenaeus merguiensis11111 1 Glucanase-like (GLU)-LPS-1,3-glucanG+、G-bacteria-BGBPF. chinensisL. vannamei1M. japonicus311-CTLsF. chinensisF. merguiensisP. monodonL. vannamei7137C-type lectin domain(CTLD)LPS、PGN、L

8、TA-LPSWSSVTable 1 Reported pattern recognition receptors in penaeid shrimp2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成PRRsSpeciesReceptor numberFeatured domainLigandsCTLsM. JaponicusPenaeus semisulcatus41CTLDLPS-SCRM. japonicus1CD36LPS？LTA?FREPM. japanicus1Fibrinogen-like domainPGNLPSTEPL. VannameiM. JaponicusP. Mono

9、donF. chinensis11132M-DSCAMP. MonodonL. vannamei11Ig-like domainfibronectin domain-GalectinM. japonicus1Carbohydratesrecognition domainLPSLTA2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成PRRsSpeciesReceptor numberFeatured domainLigandsSPHP. monodon1Trypsin-like serine proteaseLPSglucanPGNTRBPF. ChinensisM. japonicus1ds

10、RNA-binding domaindsRNAsTLRsF. ChinensisM. JaponicusP. MonodonL. vannamei1213LRRTIR-, Not characterized.2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成 通常情況下PRPs在異物入侵前位于血漿或血細(xì)胞表面，具有對多糖的親和性。當(dāng)微生物感染生物體時，PRPs 首先與微生物細(xì)胞壁上的多糖結(jié)合，然后通過與血細(xì)胞表面特異受體聯(lián)結(jié)促進(jìn)顆粒細(xì)胞擴(kuò)張，引發(fā)包裹、吞噬、proPO 系統(tǒng)級聯(lián)發(fā)應(yīng)等，實施機(jī)體的非特異性免疫反應(yīng)。2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成2.1.1 C型凝集素型凝集

11、素(C-type lectins) C-型凝集素幾乎存在于所有動植物體內(nèi)，其凝集活性具有鈣離子依賴性。C-型凝集素的主要特征是在蛋白質(zhì)分子的C 末端含有糖識別結(jié)構(gòu)域CRD。作為一種模式識別受體，C-型凝集素參與“非己”識別和對入侵病原的清除過程。據(jù)報道，無脊椎動物C-型凝集素可參與多種免疫反應(yīng)：激活酚氧化酶原、抗菌、吞噬、包囊、黑化作用以及結(jié)節(jié)的形成等, 在先天性免疫防御中具有重要作用。2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成近幾年，對蝦C-型凝集素的研究也逐漸開展起來, 目前已在中國明對蝦(F.chinensis)、凡納濱對蝦(L.vannamei)、日本囊對蝦(M.aponic

12、us)、墨吉明對蝦(F.merguiensis)等多種對蝦中發(fā)現(xiàn)C-型凝集素的存在。2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成Table 2 Different types of C-type lectins reported in Penaeid shrimp2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成 Fig. 2. Domain architectures of shrimp lectins.2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成 Fig. 3. The functions of shrimp C-type lectins2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的

13、基本組成的基本組成 2.1.2 Toll樣受樣受(Toll-like receptors，TLRs) TLRs是進(jìn)化中比較保守的一個受體家族。 TLRs由三部分組成：富含亮氨酸重復(fù)的胞外區(qū)(LRR) 、跨膜螺旋和胞內(nèi)的Toll-白介素1受體結(jié)構(gòu)域(TIR)，能特異識別PAMP，招募特異接頭蛋白，激活一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，在天然免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮著重要的作用，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。TLRs雖然在脊椎動物中作為一種模式識別受體發(fā)揮作用,但是在無脊椎動物中這類受體并不與病原體直接接觸,而是作為一種跨膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子行使功能。2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成 Fig

14、. 4. Phylogenetic tree analysis of TLRs2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成Note: G, gill; L, lymphoid organ; I: intestine; Hp: hepatopancreas; Hc, hemocytes; Ht, heart; up, differentially up-regulated; down, differentially down-regulated; modulated,different regulation trends at different post-infection time;

15、 none, no obvious difference; /, not available.Table 3 The canonical components of Toll signaling pathway identified in penaeid shrimp2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成 Fig. 5. Comparison of Toll pathways in shrimp and Drosophila.2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成2.2絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs) 絲氨酸蛋白酶(seri

16、ne proteinases, SPs)是一類以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，不僅參與機(jī)體消化、胚胎發(fā)育、組織重建、細(xì)胞分化及血管形成等過程，而且在抵御病原體入侵的過程中起著非常重要的作用。參與免疫反應(yīng)的SPs 通常以酶原的形式合成，儲存在膜泡內(nèi)或顆粒中，然后被轉(zhuǎn)運或釋放到細(xì)胞外，通過與特異的蛋白酶結(jié)合，在其活性位點水解斷裂，使之活化，形成級聯(lián)反應(yīng)，并快速啟動相應(yīng)的免疫防御系統(tǒng)，抵御病原體的感染。2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成 絲氨酸蛋白酶的活性部位都含有組氨酸、天冬氨酸和絲氨酸，形成催化三聯(lián)體。目前，已在昆蟲和甲殼動物中發(fā)現(xiàn)了幾種參與proPO系統(tǒng)激活的SPs，它們都屬

17、于含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶 (Clip-domain serine proteinase , Clip-SPs)。 Clip-SPs通常以酶原的形式合成，其N端具有12個Clip結(jié)構(gòu)域，C端起催化作用的SP結(jié)構(gòu)域。Clip結(jié)構(gòu)域通常由3755個氨基酸殘基組成，并通過3 個嚴(yán)格保守的二硫鍵相互連接，形成緊湊結(jié)構(gòu)，進(jìn)而通過2392 個氨基酸殘基與SP 結(jié)構(gòu)域連接。2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成Fig. 6. Schematic illustration of Prophenoloxidase-activating emzymes of the penaeid shrimp

18、 P. monodon2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成 Clip-SPs分為具催化活性的SPs和無催化活性的SPs絲氨酸蛋白酶同源物(Clip-SP homologs, Clip-SPHs)，二者的氨基酸序列相似，但Clip-SPHs由于一個或多個催化殘基的缺失或突變(如: Clip-SPHs催化三聯(lián)體中的絲氨酸被甘氨酸取代)導(dǎo)致其明顯缺乏酰胺酶活力。目前已有文獻(xiàn)證實，SPHs在節(jié)肢動物中參與酚氧化酶原系統(tǒng)的激活和抗微生物應(yīng)答。當(dāng)沒有SPHs時，proPO能夠被SPs在正確的位置裂解，但是卻不能顯現(xiàn)PO的活性。因此有人推斷，SPs和SPHs的發(fā)夾結(jié)構(gòu)域?qū)roPO的活化作用

19、很關(guān)鍵，SPHs很可能改變了PO的構(gòu)象而導(dǎo)致其活化，但目前SPHs與PO之間的直接反應(yīng)關(guān)系還沒有被確認(rèn)。2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成Fig. 7. Bootstrapped unrooted neighbor-joining tree of the serine proteinase domain of clip-SPs and clip-SPHs from arthropods2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成2.3酚氧化酶酚氧化酶(phenoloxidase, PO)和酚氧化酶原和酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO) 酚氧化

20、酶(phenoloxidase, PO)又稱為酪氨酸酶(tyrosinase)，在無脊椎動物和脊椎動物中都有發(fā)現(xiàn)，其活性部位含有2個銅原子(CuA和CuB)，能夠催化酚類物質(zhì)形成最終的反應(yīng)產(chǎn)物黑色素。無脊椎動物 PO 一般以無活性狀態(tài)的proPO存在，ProPO產(chǎn)生于血淋巴中成熟的血細(xì)胞，如顆粒細(xì)胞和半顆粒細(xì)胞，經(jīng)絲氨酸蛋白酶裂解變成有活性的 PO。1996 年，Sugumaran建議：酪氨酸酶這個名字應(yīng)專門用于哺乳類，而 PO 專門用于無脊椎動物。FujimotoK對它們進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示它們來源于兩個相對獨立的分支，從序列相似性考慮，酪氨酸酶可能起源于軟體動物的血藍(lán)蛋白，PO 可能起源

21、于節(jié)肢動物的血藍(lán)蛋白。 2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成 Fig. 8. Schematic illustration of Prophenoloxidase of P. monodonFig. 9. Bright-field photomicrographs showing the cytochemical localization ofphenoloxidase in Penaeus monodon hemocytes incubated with dopamine.A：Hyaline cell with none or few fine granules. B：Sem

22、igranular cell withmoderate and variable number of granules of various shapes and sizes.C： Granular cell whose cytoplasm is fully packed with granules. 2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成 PO能夠催化單酚羥化成二酚，并把二酚氧化成醌，醌在非酶促條件下形成最終的反應(yīng)產(chǎn)物黑色素。這些黑色素協(xié)同具有細(xì)胞毒性的醌類中間產(chǎn)物沉積到入侵的病原體周圍，起到隔離殺死病原體的作用，即所謂的黑化

23、包被反應(yīng)。在較高等的無脊椎動物如節(jié)肢動物中，PO 具有多種功能，它不僅參與黑色素形成、角質(zhì)的硬化和傷口愈合，而且在宿主的防御反應(yīng)中還作為非自身識別系統(tǒng)發(fā)揮功能，在識別異物、釋放調(diào)理素(opsonin)、促進(jìn)血細(xì)胞的吞噬和包囊反應(yīng)以及促進(jìn)顆粒細(xì)胞和半顆粒細(xì)胞釋放顆粒、產(chǎn)生多種介導(dǎo)凝集因子及抗菌肽等免疫功能方面發(fā)揮著重要的作用。PO活力的強(qiáng)弱與機(jī)體的免疫力直接相關(guān)，可作為衡量甲殼動物免疫功能大小的指標(biāo)之一。2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成 目前，已克隆了斑節(jié)對蝦(P.monodon)、凡納濱對蝦(L.vannamei)、日本囊對蝦(M.japonicus)及中國明對蝦(F.ch

24、inensis)及短溝對蝦(P.semisulcatus)proPO 的cDNA 序列。甲殼動物proPO 的cDNA序列長約2500bp，如凡納濱對蝦(L.vannamei)的為2471 bp，序列中含有高度保守的兩個銅結(jié)合位點，即5 個糖基化位點和6 個組氨酸殘基，整個序列沒有信號肽。ProPO 經(jīng)絲氨酸蛋白酶裂解轉(zhuǎn)變?yōu)榫呋钚缘腜O，一般會有一段約50 個氨基酸的肽鏈從proPO 上切除。而這個酶切位點及其周圍的氨基酸序列在同一物種中也是非常保守的，如斑節(jié)對蝦的酶切位點在Arg44Val45。2、 proPO激活系統(tǒng)激活系統(tǒng)的基本組成的基本組成Fig. 10. Neighbor-joini

25、ng phylogenetic trees of prophenoloxidase3、血藍(lán)蛋白血藍(lán)蛋白與與PO 在動物界進(jìn)化過程中, 出現(xiàn)了3 種重要的呼吸蛋白: 蚯蚓血紅蛋白(hemerythrin) 、血藍(lán)蛋白(hemocyanin) 和血紅蛋白( hemoglobin) 。這3 種呼吸蛋白是同功非同源關(guān)系, 尤其是血藍(lán)蛋白, 不僅在非線性分子進(jìn)化中具有承上啟下的重要意義, 而且至今依然是多數(shù)甲殼動物和軟體動物( 頭足類和腹足類) 的呼吸蛋白, 它在動物界中的分布范圍僅次于血紅蛋白。血藍(lán)蛋白是一類含有銅離子的寡聚蛋白，起著運送氧的重要功能。但是，最近的研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下血藍(lán)蛋白具有PO

26、的活性。 3、血藍(lán)蛋白血藍(lán)蛋白與與PO Fig. 11. Structure of crustacean and mollusc hemocyaninsA：甲殼動物血藍(lán)蛋白六聚體的形狀, 六個花瓣狀構(gòu)造分別為血藍(lán)蛋白的六個亞基； B： 甲殼動物血藍(lán)蛋白六聚體中第二結(jié)構(gòu)域集中在六聚體中央?yún)^(qū)域, 其它兩個結(jié)構(gòu)域分布在六聚體周圍；C： 軟體動物血藍(lán)蛋白的四級結(jié)構(gòu)；D: 美洲鱟血藍(lán)蛋白的活性部位，兩個藍(lán)色的圓球體為CuA 和CuB, 紅色圓球體為氧分子，綠色片段為組氨酸， 每三個組氨酸分別與一個Cu 結(jié)合。3、血藍(lán)蛋白血藍(lán)蛋白與與PO 血藍(lán)蛋白和PO 雖然在結(jié)構(gòu)上有相似點，如兩者都是含雙銅的蛋白，這兩

27、個銅位點就是它們的活性部位，且都分別與三個組氨酸殘基連在一起。但是，兩者卻有著許多不同點，如它們的生成器官是不同的，血藍(lán)蛋白在肝胰腺中生成，而proPO 在成熟血細(xì)胞中生成。另外，將螯蝦的PO 與血藍(lán)蛋白進(jìn)行理化特性比較發(fā)現(xiàn)，血藍(lán)蛋白的表面帶有較多的負(fù)電并較PO 的疏水性弱，血藍(lán)蛋白有信號肽，而PO 沒有信號肽。3、血藍(lán)蛋白血藍(lán)蛋白與與PO 對血藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血藍(lán)蛋白執(zhí)行攜氧功能時，由于一些重要的氨基酸殘基的阻擋，其活性部位只允許氧分子進(jìn)入，酚類底物不能進(jìn)入。對螯(Pacifastacus leniusculus)、黃道蟹(Cancer magister)等的研究表明，在血藍(lán)蛋白的N

28、末端發(fā)生蛋白質(zhì)水解或?qū)被釟埢龌钚圆课皇蛊浣Y(jié)構(gòu)改變或部分展開后，血藍(lán)蛋白的銅位點能與更大的底物，如酚類物質(zhì)結(jié)合，從而使之具有PO功能，完成黑化。4、環(huán)境因子對、環(huán)境因子對PO的影響的影響 海產(chǎn)甲殼動物極易受到多種環(huán)境因子的影響，其生存環(huán)境隨季節(jié)及晝夜更替而發(fā)生變化，且污染物及氣候等因素導(dǎo)致水環(huán)境的變化均能抑制甲殼動物的免疫力。已有研究報道環(huán)境因子變化，如溫度、鹽度及PH等均能導(dǎo)致甲殼動物血細(xì)胞數(shù)量的調(diào)整及酚氧化酶原活力的變化，導(dǎo)致免疫力下降，對病原菌易感。 甲殼動物酚氧化酶原激活系統(tǒng)可能存在多種不同的激活機(jī)制，由此引發(fā)免疫應(yīng)答的效應(yīng)也有所不同，環(huán)境刺激(如溫度、鹽度、PH)引起甲殼動物發(fā)

29、生一系列非特異性應(yīng)激反應(yīng)，能啟動酚氧化酶作用，這是機(jī)體代謝上的一種免疫應(yīng)激適應(yīng)，而與異物入侵、自發(fā)激活等具有不同的免疫應(yīng)答機(jī)制。4、環(huán)境因子對、環(huán)境因子對PO的影響的影響4.1 溫度溫度 溫度是養(yǎng)殖水環(huán)境中最重要環(huán)境因子之一，能直接影響對蝦的存活、生長和代謝強(qiáng)度等。對蝦屬于變溫動物，其體溫隨著環(huán)境溫度的變化而改變，而環(huán)境溫度的不同必然會影響機(jī)體的新陳代謝和生理調(diào)節(jié)機(jī)制。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)環(huán)境因子發(fā)生變化后，對蝦因應(yīng)激反應(yīng)，引起自身的免疫力下降，而對病原的易感性提高，從而導(dǎo)致蝦病暴發(fā)。 蝦類的生長發(fā)育存在最適溫度，同樣，蝦類的免疫反應(yīng)也有最適溫度，超出適溫范圍免疫反應(yīng)下降。溫度突變可阻礙機(jī)體的穩(wěn)定狀態(tài)，成為脅迫因子，使其免疫反