1、會計(jì)學(xué)1基因結(jié)構(gòu)及功能分析基因結(jié)構(gòu)及功能分析第1頁/共55頁第1頁/共55頁第2頁/共55頁第一節(jié) 基因結(jié)構(gòu)分析技術(shù) 第2頁/共55頁第3頁/共55頁一、基因一級結(jié)構(gòu)解析技術(shù) 基因的一級結(jié)構(gòu)是指脫氧核苷酸的排列順序，解析一級結(jié)構(gòu)最精確的技術(shù)就是DNA測序（DNA sequencing）。 第3頁/共55頁第4頁/共55頁（一）雙脫氧法和化學(xué)降解法是兩種常規(guī)的DNA測序方法 Sanger雙脫氧測序（dideoxy sequencing）法 第4頁/共55頁第5頁/共55頁Maxam-Gilbert化學(xué)降解測序法 第5頁/共55頁第6頁/共55頁（二）全自動激光熒光DNA測序技術(shù)的原理基于Sang

2、er雙脫氧法 1. 四色熒光法：采用四種不同的熒光染料標(biāo)記同一引物或4種不同的終止底物ddNTP，最終結(jié)果均相當(dāng)于賦予DNA片段4種不同的顏色。因此，一個樣品的4個反應(yīng)產(chǎn)物可在同一個泳道內(nèi)電泳。2. 單色熒光法：采用單一熒光染料標(biāo)記引物5-端或dNTP，所有產(chǎn)物的5-末端均帶上了同一種熒光標(biāo)記，一個樣品的四個反應(yīng)必須分別進(jìn)行，相應(yīng)產(chǎn)物也必須在四個不同的泳道內(nèi)電泳第6頁/共55頁第7頁/共55頁（三）焦磷酸測序是一種基于發(fā)光法測定焦磷酸的測序技術(shù) 焦磷酸測序技術(shù)操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）分析、等位基因頻率測定、細(xì)菌和病毒等微生物的分型鑒定、CpG甲基化分析、掃描

3、與疾病相關(guān)基因序列中的突變點(diǎn)等領(lǐng)域。該方法的測序長度一般短于Sanger法。 第7頁/共55頁第8頁/共55頁（四）循環(huán)芯片測序被稱為第二代測序技術(shù) 循環(huán)芯片測序（cyclic-array sequencing） 可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模并行化分析 不需電泳，設(shè)備易于微型化 樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本 優(yōu)勢：技術(shù)平臺：454測序、Solexa測序（Illumina測序）、SOLiD測序等。 第8頁/共55頁第9頁/共55頁基本流程： 將基因組DNA隨機(jī)切割成為小片段DNA； 在所獲小片段DNA分子的末端連上接頭，然后變性得到單鏈模板文庫； 將帶接頭的單鏈小片段DNA文庫固定于固體表面； 對固定

4、片段進(jìn)行克隆擴(kuò)增，從而制成polony芯片。 針對芯片上的DNA，利用聚合酶或連接酶進(jìn)行一系列循環(huán)反應(yīng)，通過讀取堿基連接到DNA鏈過程中釋放出的光學(xué)信號而間接確定堿基序列。第9頁/共55頁第10頁/共55頁（五）單分子測序技術(shù)被稱為第三代測序技術(shù) 主要策略： 通過摻入并檢測熒光標(biāo)記的核苷酸，來實(shí)現(xiàn)單分子測序，如單分子實(shí)時技術(shù)（single molecule real time technology，SMRT）； 利用DNA聚合酶在DNA合成時的天然化學(xué)方式來實(shí)現(xiàn)單分子測序； 直接讀取單分子DNA序列信息。 第10頁/共55頁第11頁/共55頁二、基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)分析技術(shù) 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)（transcri

5、ption start site，TSS） （一）用cDNA克隆直接測序法鑒定TSS 以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，同時利用逆轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在cDNA第一鏈的末端加上polyC尾，并以此引導(dǎo)合成cDNA第二鏈。將雙鏈cDNA克隆于適宜載體，通過對克隆cDNA的5-末端進(jìn)行測序分析即可確定基因的TSS序列。 該方法比較簡單，尤其適于對特定基因TSS的分析。但可導(dǎo)致5-末端部分缺失，從而影響對TSS的序列測定。 第11頁/共55頁第12頁/共55頁（二）用5-cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)鑒定TSS 常用的技術(shù)包括5-末端基因表達(dá)系列分析（5-end serial analys

6、is of gene expression，5-SAGE）和帽分析基因表達(dá)（cap analysis gene expression，CAGE）技術(shù)。 第12頁/共55頁第13頁/共55頁（三）用數(shù)據(jù)庫搜索TSS 利用對寡核苷酸帽法構(gòu)建的全長cDNA文庫5-末端測序所得的數(shù)據(jù)信息建立了一個TSS數(shù)據(jù)庫（database of transcription start sites，DBTSS），并在此基礎(chǔ)上，通過將寡核苷酸帽法和大量平行測序技術(shù)相結(jié)合開發(fā)了一種TSS測序法，從而實(shí)現(xiàn)了一次測試可產(chǎn)生1107 個TSS的數(shù)據(jù)。 第13頁/共55頁第14頁/共55頁三、基因啟動子結(jié)構(gòu)分析技術(shù) （一）用P

7、CR結(jié)合測序技術(shù)分析啟動子結(jié)構(gòu) 該方法最為簡單和直接，即根據(jù)基因的啟動子序列，設(shè)計(jì)一對引物，然后以PCR法擴(kuò)增啟動子，經(jīng)測序分析啟動子序列結(jié)構(gòu)。 第14頁/共55頁第15頁/共55頁（二）用核酸-蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)分析啟動子結(jié)構(gòu) 1. 用足跡法分析啟動子中潛在的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn) 足跡法（footprinting）是利用DNA電泳條帶連續(xù)性中斷的圖譜特點(diǎn)判斷與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)域，它是研究核酸-蛋白質(zhì)相互作用的方法，而不是專門用于研究啟動子結(jié)構(gòu)的方法。 分類：分類：酶足跡法化學(xué)足跡法 第15頁/共55頁第16頁/共55頁（1）用核酸酶進(jìn)行足跡分析 酶足跡法（enzymatic footprin

8、ting）是利用DNA酶處理DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后通過電泳分析蛋白質(zhì)結(jié)合序列。常用的酶有DNA酶I（DNase I）和核酸外切酶III。 第16頁/共55頁第17頁/共55頁（2）用化學(xué)試劑進(jìn)行足跡分析 化學(xué)足跡法（chemical footprinting）是利用能切斷DNA骨架的化學(xué)試劑處理DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于化學(xué)試劑無法接近結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA區(qū)域，因此在電泳上形成空白區(qū)域的位置就是DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。最常用的化學(xué)足跡法是羥自由基足跡法（hydroxyl radical footprinting）。 第17頁/共55頁第18頁/共55頁2. 用電泳遷移率變動分析和染色質(zhì)免

9、疫沉淀技術(shù)鑒定啟動子 電泳遷移率變動分析（EMSA）和染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）只能確定DNA序列中含有核蛋白結(jié)合位點(diǎn)，故尚需結(jié)合DNA足跡實(shí)驗(yàn)和DNA測序等技術(shù)來確定具體結(jié)合序列。 第18頁/共55頁第19頁/共55頁（三）用生物信息學(xué)預(yù)測啟動子 1. 用啟動子數(shù)據(jù)庫和啟動子預(yù)測算法定義啟動子 在定義啟動子或預(yù)測分析啟動子結(jié)構(gòu)時應(yīng)包括啟動子區(qū)域的3個部分 核心啟動子（core promoter）； 近端啟動子（proximal promoter）：含有幾個調(diào)控元件的區(qū)域，其范圍一般涉及TSS上游幾百個堿基； 遠(yuǎn)端啟動子（distal promoter）：范圍涉及TSS上游幾千個堿基，含有增強(qiáng)

10、子和沉默子等元件。 第19頁/共55頁第20頁/共55頁2. 預(yù)測啟動子的其他結(jié)構(gòu)特征 啟動子區(qū)域的其他結(jié)構(gòu)特征包括GC含量、CpG比率、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、堿基組成及核心啟動子元件等。 用于啟動子預(yù)測的數(shù)據(jù)庫：EPD（eukaryotic promoter databases）數(shù)據(jù)庫，主要預(yù)測真核RNA聚合酶型啟動子，數(shù)據(jù)庫中的所有啟動子數(shù)據(jù)信息都經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)；TRRD（transcription regulatory region databases）是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)來源于已發(fā)表的科學(xué)論文。 第20頁/共55頁第21頁/共55頁四、基因編碼序列分析技術(shù) （一）用cDNA文庫法分析

11、基因編碼序列 cDNA克隆測序或構(gòu)建cDNA文庫是最早分析基因編碼序列的方法。全長cDNA文庫可以通過mRNA的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行判斷，mRNA的序列基本都由3部分組成，即5-UTR、編碼序列和3-UTR。 cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)是高效釣取未知基因編碼序列的一種方法。核酸雜交法可從cDNA文庫中獲得特定基因編碼序列的cDNA克隆。第21頁/共55頁第22頁/共55頁（二）用RNA剪接分析法確定基因編碼序列 高通量分析RNA剪接的方法： 基于DNA芯片的分析法 交聯(lián)免疫沉淀法 體外報告基因測定法選擇性剪接的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以通過基因表達(dá)序列標(biāo)簽（expression sequence tag,

12、 EST）的比較進(jìn)行鑒定，但這種方法需進(jìn)行大量的EST序列測定；同時由于大多數(shù)EST文庫來源于非常有限的組織，故組織特異性剪接變異體也很可能丟失。 第22頁/共55頁第23頁/共55頁（三）用數(shù)據(jù)庫分析基因編碼序列在基因數(shù)據(jù)庫中，對各種方法所獲得的cDNA片段的序列進(jìn)行同源性比對，通過染色體定位分析、內(nèi)含子外顯子分析、ORF分析及表達(dá)譜分析等，可以初步明確基因的編碼序列，并可對其編碼產(chǎn)物的基本性質(zhì)進(jìn)行分析。利用有限的序列信息即可通過同源性搜索獲得全長基因序列，然后，利用NCBI的ORF Finder軟件或EMBOSS中的getorf軟件進(jìn)行ORF分析，并根據(jù)編碼序列和非編碼序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，便可

13、確定基因的編碼序列。 第23頁/共55頁第24頁/共55頁五、基因拷貝數(shù)分析技術(shù) 分析某種基因的種類及拷貝數(shù)，實(shí)質(zhì)上就是對基因進(jìn)行定性和定量分析，常用的技術(shù)包括DNA印跡（Southern印跡）、實(shí)時定量PCR技術(shù)等。 DNA印跡是根據(jù)探針信號出現(xiàn)的位置和次數(shù)判斷基因的拷貝數(shù) 實(shí)時定量PCR是通過被擴(kuò)增基因在數(shù)量上的差異推測模板基因拷貝數(shù)的異同DNA測序是最精確的鑒定基因拷貝數(shù)的方法第24頁/共55頁第25頁/共55頁第二節(jié) 基因表達(dá)產(chǎn)物分析技術(shù) 第25頁/共55頁第26頁/共55頁一、通過檢測RNA而在轉(zhuǎn)錄水平分析基因表達(dá) 根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因轉(zhuǎn)錄水平分析分為封閉和開放性系

14、統(tǒng)研究方法。 封閉性系統(tǒng)研究方法（如DNA芯片、RNA印跡、實(shí)時RT-PCR等）的應(yīng)用范圍僅限于已知基因。開放性系統(tǒng)研究方法（如差異顯示PCR、雙向基因表達(dá)指紋圖譜、分子索引法、隨機(jī)引物PCR指紋分析等）可用于發(fā)現(xiàn)和分析未知基因。 第26頁/共55頁第27頁/共55頁（一）用核酸雜交法檢測RNA表達(dá)水平 1. 用RNA印跡分析RNA表達(dá) RNA印跡被廣泛應(yīng)用于RNA表達(dá)分析，并作為鑒定RNA轉(zhuǎn)錄本、分析其大小的標(biāo)準(zhǔn)方法。 2. 用核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)分析RNA水平及其剪接情況 RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（ribonuclease protection assay，RPA）是一種基于雜交原理分析RNA的方法

15、，既可進(jìn)行定量分析，又可研究其結(jié)構(gòu)特征。 第27頁/共55頁第28頁/共55頁第28頁/共55頁第29頁/共55頁3. 用原位雜交進(jìn)行RNA區(qū)域定位 原位雜交（ISH）是通過設(shè)計(jì)與目標(biāo)RNA堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針，利用雜交原理在組織原位檢測RNA的技術(shù)，其可對細(xì)胞或組織中原位表達(dá)的RNA進(jìn)行區(qū)域定位，同時也可作為定量分析的補(bǔ)充。 第29頁/共55頁第30頁/共55頁（二）用PCR技術(shù)檢測RNA表達(dá)水平 1. 用逆轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行RNA的半定量分析 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）一般用于RNA的定性分析；如果設(shè)置陽性參照，則可對待測RNA樣品進(jìn)行半定量分析。2. 用實(shí)時定量PCR進(jìn)行RNA的定量

16、分析 實(shí)時定量PCR是定量分析RNA的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，具有很高的靈敏度和特異性。 第30頁/共55頁第31頁/共55頁（三）用基因芯片和高通量測序技術(shù)分析RNA表達(dá)水平 1. 基因芯片已成為基因表達(dá)譜分析的常用方法 基因芯片主要采用cDNA芯片，其便于對不同狀態(tài)下的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，揭示轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的規(guī)律，對探索發(fā)病機(jī)制、評價治療效果、篩選藥物靶標(biāo)具有重要意義。 2. 用循環(huán)芯片測序技術(shù)分析基因表達(dá)譜 運(yùn)用循環(huán)芯片測序技術(shù)，可對基因表達(dá)譜進(jìn)行高通量分析，一次可完成幾十萬到幾百萬個DNA分子片段的序列測定，從而快速獲得轉(zhuǎn)錄組或基因組的全貌。 第

17、31頁/共55頁第32頁/共55頁二、通過檢測蛋白質(zhì)/多肽而在翻譯水平分析基因表達(dá) （一）用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測蛋白質(zhì)/多肽 （二）用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)分析蛋白質(zhì)/多肽 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）也是一種建立在抗原-抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)/多肽分析方法，其主要用于測定可溶性抗原或抗體， 第32頁/共55頁第33頁/共55頁（三）用免疫組化實(shí)驗(yàn)原位檢測組織/細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)/多肽 免疫組化實(shí)驗(yàn)包括免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)，二者原理相同，都是用標(biāo)記的抗體在組織/細(xì)胞原位對目標(biāo)抗原（目標(biāo)蛋白質(zhì)/多肽）進(jìn)行定性、定量、定位檢測。 （四）用流式細(xì)胞術(shù)分析表達(dá)特異蛋白質(zhì)的陽性細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù)（flo

18、w cytometry）通常利用熒光標(biāo)記抗體與抗原的特異性結(jié)合，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析熒光信號，根據(jù)細(xì)胞表達(dá)特定蛋白質(zhì)的水平對某種蛋白質(zhì)陽性細(xì)胞做出判斷。 第33頁/共55頁第34頁/共55頁（五）用蛋白質(zhì)芯片和雙向電泳高通量分析蛋白質(zhì)/多肽表達(dá)水平 1. 用蛋白質(zhì)芯片分析蛋白質(zhì)/多肽的表達(dá)譜 根據(jù)制作方法和用途不同，可將其分為蛋白質(zhì)檢測和功能芯片兩大類。蛋白質(zhì)檢測芯片包括抗體芯片、抗原芯片、配體芯片等，它是將具有高親和力的特異性探針分子固定在基片上，用以識別生物樣品溶液中的目標(biāo)多肽；蛋白質(zhì)功能芯片可用來研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-DNA蛋白質(zhì)-RNA，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、酶與

19、底物、蛋白質(zhì)-小分子等的相互作用。 第34頁/共55頁第35頁/共55頁蛋白質(zhì)芯片可用于檢測組織細(xì)胞來源的樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)譜；其精確程度、信息范疇取決于芯片上已知多肽的信息多寡。 2. 用雙向電泳分析蛋白質(zhì)/多肽表達(dá)譜 雙向電泳可同時分離成百上千的蛋白質(zhì)，對差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。 第35頁/共55頁第36頁/共55頁第三節(jié) 基因的生物學(xué)功能鑒定技術(shù)第36頁/共55頁第37頁/共55頁一、用功能獲得策略鑒定基因功能 基因功能獲得策略的本質(zhì)是將目的基因直接導(dǎo)入某一細(xì)胞或個體中，使其獲得新的或更高水平的表達(dá)，通過細(xì)胞或個體生物性狀的變化來研究基因功能。 方法： 轉(zhuǎn)基因技術(shù)基因敲入技術(shù) 第37頁

20、/共55頁第38頁/共55頁（一）用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因功能 轉(zhuǎn)基因技術(shù)（transgenic technology）是指將外源基因?qū)胧芫鸦蚺咛ジ杉?xì)胞（embryonic stem cell），即ES細(xì)胞，通過隨機(jī)重組使外源基因插入細(xì)胞染色體DNA，隨后將受精卵或ES細(xì)胞植入假孕受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細(xì)胞分裂遺傳給后代。 轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animal）是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動物，其制備步驟主要包括轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建、外源基因的導(dǎo)入和鑒定、轉(zhuǎn)基因動物的獲得和鑒定、轉(zhuǎn)基因動物品系的繁育等。轉(zhuǎn)基因小鼠最為常見。 第38頁/共55頁第3

21、9頁/共55頁第39頁/共55頁第40頁/共55頁（二）用基因敲入技術(shù)獲得基因的功能 基因敲入（gene knock-in）是通過同源重組的方法，用某一基因替換另一基因，或?qū)⒁粋€設(shè)計(jì)好的基因片段插入到基因組的特定位點(diǎn)，使之表達(dá)并發(fā)揮作用。通過基因敲入可以研究特定基因在體內(nèi)的功能；也可以與之前的基因的功能進(jìn)行比較；或?qū)⒄；蛞牖蚪M中置換突變基因以達(dá)到靶向基因治療的目的。 第40頁/共55頁第41頁/共55頁基因敲入是基因打靶（gene targeting）技術(shù)的一種?；虼虬惺且环N按預(yù)期方式準(zhǔn)確改造生物遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段。除基因敲入外，基因打靶還包括基因敲除、點(diǎn)突變、缺失突變、染色體大片段

22、刪除等?；虼虬信c轉(zhuǎn)基因技術(shù)均可用于基因功能研究，但二者的最大區(qū)別就是基因打靶能去除和/或替換生物體內(nèi)的固有基因，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)則未去除或替換固有基因。目前，基因打靶已成為研究基因功能最直接和最有效的方法之一。 第41頁/共55頁第42頁/共55頁二、用功能失活策略鑒定基因功能 基因功能失活策略的本質(zhì)是將細(xì)胞或個體的某一基因功能部分或全部失活后，通過觀察細(xì)胞生物學(xué)行為或個體遺傳性狀表型的變化來鑒定基因的功能。 方法： 基因敲除基因沉默 第42頁/共55頁第43頁/共55頁基因敲除（gene knock-out）屬于基因打靶技術(shù)的一種，其利用同源重組的原理，在ES細(xì)胞中定點(diǎn)破壞內(nèi)源基因，然后利用E

23、S細(xì)胞發(fā)育的全能性，獲得帶有預(yù)定基因缺陷的雜合子，通過遺傳育種最終獲得目的基因缺陷的純合個體。 （一）用基因敲除技術(shù)使基因功能完全缺失 條件性基因敲除（conditional gene knock-out）可以更加明確地在時間和空間上操作基因靶位，敲除效果更加精確可靠，理論上可達(dá)到對任何基因在不同發(fā)育階段和不同器官、組織的選擇性敲除。 第43頁/共55頁第44頁/共55頁第44頁/共55頁第45頁/共55頁（二）用基因沉默技術(shù)可使基因功能部分缺失 1. 用RNA干擾技術(shù)研究基因功能 2. 用miRNA技術(shù)研究基因功能 3. 用反義RNA技術(shù)研究基因功能 4. 核酶（ribozyme）技術(shù) 利用

24、RNAi能在短時間內(nèi)高效特異地抑制靶基因表達(dá)的特點(diǎn)，可以很方便地研究基因的功能。 通過與mRNA不完全互補(bǔ)配對結(jié)合而抑制翻譯，一種miRNA可沉默多個靶基因。 通過反義RNA與細(xì)胞中的mRNA特異性結(jié)合，從而抑制相應(yīng)mRNA的翻譯。 核酶通過剪切靶RNA分子而抑制基因的表達(dá)。 第45頁/共55頁第46頁/共55頁三、用隨機(jī)突變篩選策略鑒定基因功能 隨機(jī)突變篩選策略的第一步是通過物理誘變、化學(xué)誘變或生物技術(shù)產(chǎn)生大量的基因組DNA突變。乙基亞硝基脲（ENU）是一種化學(xué)誘變劑，它通過對基因組DNA堿基的烷基化修飾，誘導(dǎo)DNA在復(fù)制時發(fā)生錯配而產(chǎn)生突變。它主要誘發(fā)單堿基突變，造成單個基因發(fā)生突變。EN

25、U的突變效率非常高?；虿东@（gene trapping）技術(shù)也是一種產(chǎn)生大規(guī)模隨機(jī)插入突變的便利手段，對于揭示基因序列所對應(yīng)的基因功能具有重要的應(yīng)用價值。 第46頁/共55頁第47頁/共55頁（五）單分子測序技術(shù)被稱為第三代測序技術(shù) 主要策略： 通過摻入并檢測熒光標(biāo)記的核苷酸，來實(shí)現(xiàn)單分子測序，如單分子實(shí)時技術(shù)（single molecule real time technology，SMRT）； 利用DNA聚合酶在DNA合成時的天然化學(xué)方式來實(shí)現(xiàn)單分子測序； 直接讀取單分子DNA序列信息。 第47頁/共55頁第48頁/共55頁四、基因編碼序列分析技術(shù) （一）用cDNA文庫法分析基因編碼序列 cDNA克隆測序或構(gòu)建cDNA文庫是最早分析基因編碼序列的方法。全長cDNA文庫可以通過mRNA的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行判斷，mRNA的序列基本都由3部分組成，即5-UTR、編碼序列和3-UTR。 cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)是高效釣取未知基因編碼序列的一種方法。核酸雜交法可從cDNA文庫中獲得特定基因編碼序列的cDNA克隆。第48頁/共55頁第49頁/共55頁（一）用核酸雜交法檢測RNA表達(dá)水平 1. 用RNA印跡分析RNA表達(dá) RNA印跡被廣泛應(yīng)用于RNA表達(dá)分析，并作為鑒定RNA轉(zhuǎn)錄本、分析其大小的標(biāo)準(zhǔn)方法。 2. 用核糖核酸酶保護(hù)實(shí)