1、RNA replicationReverse transcription=replication逆轉(zhuǎn)錄酶 （reverse transcription) 1964年，Temin發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制劑遏制。 表明：RNA腫瘤病毒的RNA復制過程中要合成DNA。 Temin又發(fā)現(xiàn)放線菌素D能抑制致癌RNA病毒的復制，但不能抑制一般RNA病毒的復制。 表明：轉(zhuǎn)錄對于RNA病毒增殖是必需的。 Temin提出前病毒假說：原病毒DNA是RNA腫瘤病毒在復制和致癌中的中間物。 1970年，Temin 在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶

2、。多功能酶：1、RNA指導的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA雜交體上的RNA3、DNA指導的DNA聚合酶活性：合成互補DNA。4、沒有35外切酶活性。特點：1. 含有Zn2+（是否有鋅指結(jié)構(gòu)、DNA結(jié)合功能？）2. DNA合成反應要求有模板和引物。3. 需適當濃度的二價陽離子（Mg2+、Mn2+）4. 5 3合成方向逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組復制過程 第一階段：合成負股cDNA的大部分 第二階段：以負股DNA為模板合成一小部分正股DNA鏈。 第三階段：完成cDNA的全部復制。乙肝病毒基因組的復制 其復制需通過逆轉(zhuǎn)錄過程經(jīng)RNA中間體實現(xiàn) ，其DNA聚合酶也是一種逆

3、轉(zhuǎn)錄酶。 逆轉(zhuǎn)錄病毒：RNA DNA RNA 乙肝病毒：DNARNA DNA試管內(nèi)cDNA的合成 常用于獲得或研究真核生物基因的方法。提取某一種特定的mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA可代表某一特定基因。 常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：* 來自鳥類成髓細胞瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒稱為AMV-RT；* 來自鼠白血病毒稱為MMLV-RT。病毒RNA復制的主要方式 1、病毒含有正鏈RNA，如灰質(zhì)炎病毒。RNA（+） 蛋白質(zhì)（酶） RNA復制 2、病毒含有負鏈RNA和復制酶如狂犬病毒。RNA（-） RNA（+） 蛋白質(zhì)、復制病毒RNA（-）。 3、病毒含有雙鏈RNA和復制酶。如呼腸孤病毒。雙鏈RNA RNA（+） 蛋白質(zhì)

4、RNA（-） 雙鏈RNA 4、逆轉(zhuǎn)錄病毒。討論題 如何知道DNA復制中先要有RNA引物的合成？ (原料/新合成DNA序列分析/專一核酸酶水解)病毒的復制病毒的復制 病毒在活細胞內(nèi)，以其基因為模板，在酶的作用下，分別合成病毒基因及蛋白質(zhì)，再組裝成完整的病毒顆粒，這種方式稱為復制（replication)。 從病毒進入宿主細胞開始，經(jīng)過基因組復制和病毒蛋白合成，至釋放出子代病毒的全過程，稱為一個復制周期。 病毒的復制周期主要包括吸附和穿入、脫殼、生物合成、組裝和釋放四個連續(xù)步驟。復制周期復制周期病毒的一步生長曲線病毒的一步生長曲線病毒的一步生長曲線病毒的一步生長曲線：以感染時間為橫坐標，病毒效價為

5、：以感染時間為橫坐標，病毒效價為 縱坐標，繪制出的病毒特征曲線。縱坐標，繪制出的病毒特征曲線。一、吸附和穿入（一）吸附（一）吸附(adsorption)分兩個階段：分兩個階段：1. 靜電吸附：靜電吸附：病毒體與細胞接觸，進行病毒體與細胞接觸，進行靜電結(jié)合靜電結(jié)合。非特異性、可逆。非特異性、可逆。2. 真正的吸附真正的吸附：病毒體表面位點（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)）與病毒體表面位點（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)）與宿主細胞膜上相應的宿主細胞膜上相應的受體結(jié)合受體結(jié)合。是決定病毒感染的。是決定病毒感染的真正開始。真正開始。裸露病毒的吸附裸露病毒的吸附 囊膜病毒的吸附囊膜病毒的吸附 （二）穿入（二）穿入(penetration)

6、病毒體吸附在宿主細胞膜上后，可通過數(shù)種穿病毒體吸附在宿主細胞膜上后，可通過數(shù)種穿入方式進入細胞：入方式進入細胞：1.1.無囊膜的病毒無囊膜的病毒 一般經(jīng)過細胞膜吞入，稱為病毒胞飲一般經(jīng)過細胞膜吞入，稱為病毒胞飲, ,如腺如腺病毒、小病毒、小RNARNA病毒等病毒等病毒胞飲病毒胞飲2. 2. 有囊膜的病毒有囊膜的病毒 囊膜與宿主細胞膜融合，病毒的核衣殼直接囊膜與宿主細胞膜融合，病毒的核衣殼直接 進入細胞漿內(nèi)進入細胞漿內(nèi) 病毒胞飲病毒胞飲: : 細胞膜吞入細胞膜吞入(1) 膜融合后進入膜融合后進入(2) 病毒胞飲病毒胞飲二、脫殼二、脫殼(uncoating)(uncoating) 不同病毒脫殼方式

7、不一，多數(shù)在宿主細胞溶酶體酶不同病毒脫殼方式不一，多數(shù)在宿主細胞溶酶體酶作用下脫殼，釋放出基因組核酸。作用下脫殼，釋放出基因組核酸。三、生物合成三、生物合成(biosynthesis) 病毒基因組一旦從衣殼中釋放后，就利用宿主細胞提病毒基因組一旦從衣殼中釋放后，就利用宿主細胞提供的低分子物質(zhì)合成大量的供的低分子物質(zhì)合成大量的病毒核酸和結(jié)構(gòu)蛋白病毒核酸和結(jié)構(gòu)蛋白。 早期，根據(jù)病毒基因組轉(zhuǎn)錄成早期，根據(jù)病毒基因組轉(zhuǎn)錄成mRNA、指令合成轉(zhuǎn)錄、指令合成轉(zhuǎn)錄合成所必需的合成所必需的復制酶復制酶和一些和一些抑制蛋白；抑制蛋白； 生物合成階段，病毒處于生物合成階段，病毒處于隱蔽期隱蔽期 病毒的生物合成過程

8、可基本歸為病毒的生物合成過程可基本歸為6大類：大類：雙股雙股DNA病病毒、單股毒、單股DNA病毒、單正股病毒、單正股RNA病毒、單負股病毒、單負股RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和雙股病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和雙股RNA病毒病毒。 病毒病毒DNA早期早期mRNA早期蛋白（酶等）早期蛋白（酶等）子代病毒子代病毒DNA晚期晚期mRNA病毒結(jié)構(gòu)蛋白病毒結(jié)構(gòu)蛋白子代病毒子子代病毒子雙股雙股DNA病毒病毒復制復制宿主細胞宿主細胞轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄酶單鏈正股單鏈正股RNARNA病毒病毒（-）ssRNA親代病毒（親代病毒（+）ssRNA早期蛋白早期蛋白（+）ssRNAdsRNA復制中間型復制中間型（-）ssRNA（+）ssRNA大量

9、子代（大量子代（+）ssRNA晚期蛋白晚期蛋白裝配子代病毒裝配子代病毒單股負股單股負股RNA病毒病毒病毒自身攜帶依賴病毒自身攜帶依賴RNA的的RNA多聚酶。多聚酶。親代（親代（-ssRNA）（+）mRNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)（+）ssRNA子代（子代（-）sRNA子代病毒子代病毒多聚酶多聚酶逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雙股雙股DNA整合至宿主細胞（前病毒）整合至宿主細胞（前病毒）mRNA病毒病毒RNA結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白裝配子代病毒裝配子代病毒RNA:DNA轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄酶聚合酶聚合酶四、組裝四、組裝病毒核酸與衣殼裝配在一起，形成病毒子。病毒核酸與衣殼裝配在一起，形成病毒子。絕大多數(shù)絕大

10、多數(shù)DNADNA病毒均在細胞核病毒均在細胞核內(nèi)組裝內(nèi)組裝; ;RNARNA病毒和痘病毒在細胞漿病毒和痘病毒在細胞漿內(nèi)組裝。內(nèi)組裝。絕大多數(shù)絕大多數(shù)無囊膜病毒無囊膜病毒釋放，一次同步，破壞宿主細釋放，一次同步，破壞宿主細胞膜，細胞裂解釋放病毒顆粒，細胞迅速死亡。胞膜，細胞裂解釋放病毒顆粒，細胞迅速死亡。絕大多數(shù)絕大多數(shù)有囊膜病毒有囊膜病毒以以出芽方式出芽方式釋出時包上釋出時包上細胞核細胞核膜或細胞膜膜或細胞膜而成為成熟病毒。逐個釋出，非一次同而成為成熟病毒。逐個釋出，非一次同步，細胞死亡緩慢。步，細胞死亡緩慢。五、釋放五、釋放Virus Obtaining Its Envelope from Host Cell Membrane by Budding 復制周期復制周期思考題1 某種病毒DNA的堿基組成（摩爾百分比）如下： A=32；G=16；T=40；C=12 該病毒DNA的特點如何？思考題2 簡要說明怎樣進行構(gòu)建cDNA文庫？ 思考題3 組織培養(yǎng)的哺乳動物細胞S期長達5 小時，經(jīng)放射自顯影測定DNA復制的速度是0.5微米/分，已知哺乳動物細胞DNA全長1.2米，計算染色