1、質(zhì)粒型表達(dá)載體質(zhì)粒型表達(dá)載體病毒型表達(dá)載體病毒型表達(dá)載體真核生物細(xì)胞常用的表達(dá)載體真核生物細(xì)胞常用的表達(dá)載體 腺病毒表達(dá)載體腺病毒表達(dá)載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體病毒表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)病毒表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)n高轉(zhuǎn)染效率高轉(zhuǎn)染效率n高蛋白表達(dá)水平高蛋白表達(dá)水平n對(duì)轉(zhuǎn)染效率很低的細(xì)胞進(jìn)行高效轉(zhuǎn)染對(duì)轉(zhuǎn)染效率很低的細(xì)胞進(jìn)行高效轉(zhuǎn)染 ( (原原代細(xì)胞等代細(xì)胞等) )n穩(wěn)定穩(wěn)定, ,可遺傳的表達(dá)可遺傳的表達(dá) ( (逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒) )n可控制拷貝數(shù)可控制拷貝數(shù)如何選擇合適的病毒表達(dá)載體？如何選擇合適的病毒表達(dá)載體？ 可適用的宿主細(xì)胞類型可適用的宿主細(xì)胞

2、類型 選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記 插入片段的大小插入片段的大小 調(diào)控元件調(diào)控元件 報(bào)告基因報(bào)告基因病毒表達(dá)載體的用途病毒表達(dá)載體的用途基因治療基因治療1990年French等把腺嘌呤脫氨酶基因?qū)氲揭幻?歲小女孩的T淋巴細(xì)胞中治療了腺嘌呤脫氨酶基因缺失病,開(kāi)創(chuàng)了人類利用人體基因治療疾病的先例。1992年復(fù)旦大學(xué)薛京倫等首次把人凝血因子基因成功用于治療血友病。2005年第一個(gè)批準(zhǔn)上市的基因治療制品Adv-P53在中國(guó)上市。病毒載體疫苗病毒載體疫苗重組腺病毒的作用重組腺病毒的作用 n在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，AdV已被成功應(yīng)用于表達(dá)各種病毒和細(xì)胞的基因，腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)出蛋白的生物化學(xué)特性，可用于商業(yè)價(jià)值的開(kāi)

3、發(fā)，它可用來(lái)生產(chǎn)亞單位疫苗，和新型診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)。nAdV可以通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)表達(dá)蛋白，除基因治療的相關(guān)實(shí)驗(yàn)外還可用做體內(nèi)特性研究。 被注射Ad5.CMV-LacZ的大鼠脊髓 純化腺病毒的電子顯微照片 被注射Ad5.CMV-GFP的大鼠紋狀體的切片 用AdV轉(zhuǎn)染基因的優(yōu)點(diǎn)n 速度快，簡(jiǎn)單，不需要任何特殊的裝備。n 相對(duì)其它方法，它非常容易被接受。事實(shí)上，這種感染后細(xì)胞生存率幾乎為100%。因此，AdV有向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)而忽視毒性作用的能力。n 許多細(xì)胞類型均可被轉(zhuǎn)染。n 感染后的數(shù)小時(shí)，基因表達(dá)便可被分析。n 刺激后，可有一種以上的基因被同時(shí)表達(dá)。腺病毒顆粒比較穩(wěn)定,病毒基因組較少發(fā)生重排

4、。插入外源基因的病毒基因組在連續(xù)傳代中一般保持不變。腺病毒基因組較易操作。制備大量的腺病毒較為容易?？筛腥痉至鸭?xì)胞和非分裂細(xì)胞。rAds可轉(zhuǎn)導(dǎo)肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨細(xì)胞、血管、肌肉、腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。重組腺病毒表達(dá)系統(tǒng)重組腺病毒表達(dá)系統(tǒng)n 通過(guò)對(duì)本體蛋白的同樣的翻譯后的修飾，在細(xì)胞中表達(dá)真核蛋白。n 一系列腺病毒轉(zhuǎn)換因素允許產(chǎn)生高水平的異種蛋白。重組蛋白代表了整個(gè)細(xì)胞蛋白的最豐富的多肽（20%-30%）。n 在較好的條件下，表達(dá)系統(tǒng)在數(shù)升的293細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中可以按比例地增加，產(chǎn)量可達(dá)90mg/L。 腺病毒表達(dá)系統(tǒng)腺病毒表達(dá)系統(tǒng)腺病毒屬于無(wú)包膜病毒,外殼由240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體構(gòu)成二十面

5、體結(jié)構(gòu),內(nèi)部有約36kb的線性雙鏈基因組,屬于DNA病毒。外殼的五鄰體分別位于二十面體結(jié)構(gòu)的頂角、均有一個(gè)纖突蛋白(fiber)突起與其相連,腺病毒的組織親合性與纖維蛋白頭部密切相關(guān)。 腺病毒的特性腺病毒的特性 腺病毒基因組編碼數(shù)十個(gè)腺病毒的結(jié)構(gòu)和功能蛋白腺病毒基因組編碼數(shù)十個(gè)腺病毒的結(jié)構(gòu)和功能蛋白,分為早分為早期表達(dá)和晚期表達(dá)。期表達(dá)和晚期表達(dá)。早期表達(dá)的蛋白是功能蛋白、晚期表達(dá)的有早期表達(dá)的蛋白是功能蛋白、晚期表達(dá)的有功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白,并且早期的功能蛋白調(diào)控晚期蛋白的表達(dá)。并且早期的功能蛋白調(diào)控晚期蛋白的表達(dá)。早期表達(dá)的早期表達(dá)的1區(qū)蛋白區(qū)蛋白(甚至包括甚至包括2區(qū)蛋白

6、區(qū)蛋白)是腺病毒基因組復(fù)制、是腺病毒基因組復(fù)制、病毒包裝和其他蛋白表達(dá)翻譯所必需的病毒包裝和其他蛋白表達(dá)翻譯所必需的,但其對(duì)細(xì)胞的毒性也是但其對(duì)細(xì)胞的毒性也是很強(qiáng)的。很強(qiáng)的。E2E2蛋白涉及蛋白涉及AdDNAAdDNA復(fù)制復(fù)制, E3, E3蛋白對(duì)抗宿主的抗病毒防御蛋白對(duì)抗宿主的抗病毒防御系統(tǒng)系統(tǒng), , E4E4調(diào)節(jié)有效的晚期基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有效的晚期基因轉(zhuǎn)錄。腺病毒的基因及其功能腺病毒的基因及其功能腺病毒感染細(xì)胞的第一步是通過(guò)纖突蛋白與細(xì)胞表面腺病毒感染細(xì)胞的第一步是通過(guò)纖突蛋白與細(xì)胞表面柯薩奇柯薩奇病毒和腺病毒受體病毒和腺病毒受體( (CARCAR) )結(jié)合。腺病毒粘附后結(jié)合。腺病毒粘附后,

7、,五鄰體蛋白上五鄰體蛋白上的精氨酸的精氨酸- -谷氨酸谷氨酸- -天門冬氨酸（天門冬氨酸（) )與細(xì)胞表面的整合與細(xì)胞表面的整合素素33和和55結(jié)合并相互作用使病毒進(jìn)入細(xì)胞。結(jié)合并相互作用使病毒進(jìn)入細(xì)胞。 病毒的受體與入侵細(xì)胞的過(guò)程病毒的受體與入侵細(xì)胞的過(guò)程第一代腺病毒載體中第一代腺病毒載體中, ,1 1、3 3基因表達(dá)盒已經(jīng)去除了基因表達(dá)盒已經(jīng)去除了, ,這這樣可以插入長(zhǎng)約樣可以插入長(zhǎng)約8kb8kb的外源的外源DNADNA。去除去除1 1區(qū)還有一個(gè)優(yōu)勢(shì)區(qū)還有一個(gè)優(yōu)勢(shì), ,就是阻止了依賴就是阻止了依賴1 1區(qū)和區(qū)和2 2區(qū)功區(qū)功能蛋白的轉(zhuǎn)錄和隨后病毒能蛋白的轉(zhuǎn)錄和隨后病毒DNADNA的復(fù)制及病

8、毒外殼蛋白的產(chǎn)生。的復(fù)制及病毒外殼蛋白的產(chǎn)生。1 1區(qū)缺失的腺病毒可以在能夠反式提供區(qū)缺失的腺病毒可以在能夠反式提供1 1區(qū)基因蛋白的區(qū)基因蛋白的293293細(xì)胞中得到增殖。細(xì)胞中得到增殖。 第一代腺病毒載體第一代腺病毒載體腺病毒基因組結(jié)構(gòu)與載體改造腺病毒基因組結(jié)構(gòu)與載體改造nHEK 293 cells have been engineered to include Adenovirus HEK 293 cells have been engineered to include Adenovirus E1a/E1b genesE1a/E1b genesnE1a/E1b genes (integ

9、rated into 293 genome) allow E1a/E1b genes (integrated into 293 genome) allow replication and transcription of Adenovirusreplication and transcription of Adenovirus構(gòu)建重組腺病毒構(gòu)建重組腺病毒 構(gòu)建重組腺病毒的傳統(tǒng)方法是以同源重組為基礎(chǔ)的。n其一用修飾的腺病毒DNA與穿梭載體在HEK 293細(xì)胞中進(jìn)行同源重組；n通過(guò)Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體，在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒中都插入loxP位點(diǎn)，然后將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá)Cre重組酶

10、的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過(guò)Cre介導(dǎo)兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的DNA發(fā)生重組，可獲得重組腺病毒，這種重組效率比一般的細(xì)胞內(nèi)同源效率高30倍。 n更為流行的方法采用了穿梭載體與腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一種特殊的菌株(BJ 5183)。然后從細(xì)菌中收集重組腺病毒，用其感染HEK 293細(xì)胞。Adeno-X Expression SystemAdeno-X Expression System 同源重組體外連接法Viral DNAPlasmid-based 制備穿梭載體和腺病毒載體7-14天7-14天2-3天目的基因從穿梭載體克隆到腺病毒載體-0-15天4天獲得重組腺病毒14-21天17-22天4-7天噬斑純化5-10天

11、0-5天-總計(jì)26-45天24-56天10-17天構(gòu)建重組腺病毒不同方法比較構(gòu)建重組腺病毒不同方法比較 Ad5腺病毒可感染的寄主腺病毒可感染的寄主人體各類組織的細(xì)胞，除造血細(xì)胞外人體各類組織的細(xì)胞，除造血細(xì)胞外多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞：多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞：Plate 293 cells 5x105/wellInfect cells w/ virus dilutionsHexon proteinsexpressedFixAdd primaryanti-hexon AbAdd HRP conj.secondaryDevelopCountAdeno-XTM Rapid Titration Kit 簡(jiǎn)單的免疫染

12、色方法簡(jiǎn)單的免疫染色方法 整個(gè)過(guò)程只需整個(gè)過(guò)程只需4848小時(shí)小時(shí). . 而傳統(tǒng)繁瑣的方法需要而傳統(tǒng)繁瑣的方法需要2 2個(gè)星期個(gè)星期才能完成才能完成 對(duì)所有重組的對(duì)所有重組的Ad5Ad5病毒能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確而快速的滴度測(cè)定病毒能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確而快速的滴度測(cè)定Adeno-XTM Rapid Titration Kit 的特點(diǎn)的特點(diǎn)Adeno-XTM Rapid Adenoviral purification System第二代腺病毒載體是病毒基因組的E2A區(qū)缺失,并突變或缺失E4區(qū)基因。這種載體裝載容量有所增加(可達(dá)11kb) ,細(xì)胞毒性和免疫原性有所減弱,而目的基因的表達(dá)時(shí)間更長(zhǎng)。第二代腺病毒載體第二代腺

13、病毒載體一種研究方向：改造腺病毒囊膜表面五鄰體纖維蛋白的結(jié)構(gòu)。根據(jù)Adv5纖突蛋白結(jié)節(jié)區(qū)的結(jié)構(gòu)特征,去除病毒與受體(CAR,柯薩奇2腺病毒受體)的親和性,經(jīng)特異性細(xì)胞結(jié)合分子模擬腺病毒纖突衣殼蛋白,使載體選擇性靶向相應(yīng)細(xì)胞,減少載體的非特異性感染及免疫反應(yīng)。提高腺病毒載體的靶向特異性提高腺病毒載體的靶向特異性另一種改造策略：改造腺病毒的基因結(jié)構(gòu),置換上針對(duì)癌細(xì)胞的特異型啟動(dòng)子。如裝上AFP啟動(dòng)子,使載體特異性感染肝癌細(xì)胞。提高腺病毒載體的靶向特異性提高腺病毒載體的靶向特異性 宿主的免疫反應(yīng)仍然是獲得轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)期表達(dá)和重復(fù)使用腺病毒載體的主要障礙。大量研究已證實(shí),具有感染性的腺病毒載體本身就足以引

14、起免疫反應(yīng)。 更為“復(fù)雜”的腺病毒載體就是第三代腺病毒載體,在其構(gòu)建時(shí)去除了某些病毒基因,甚至是去除了全部的病毒基因。所謂的“空殼”載體起先只保留了和包裝信號(hào),且在產(chǎn)生中需要輔助病毒和合適的互補(bǔ)包裝細(xì)胞,更需要進(jìn)一步的純化。 第三代腺病毒載體第三代腺病毒載體第三代新型重組腺病毒載體刪除病毒基因中所有開(kāi)放閱讀框,僅含有必要的順式元件(即ITR和鄰近的包裝信號(hào)序列) ,需要在輔助病毒存在情況下,在包裝細(xì)胞中繁殖,其安全性很高。第三代腺病毒載體不但可容納較大的外源基因(32kb) ,而且較容易獲得高滴度( 109pfu /ml) 。第三代新型重組腺病毒載體第三代新型重組腺病毒載體腺病毒在寄主細(xì)胞中呈

15、游離腺病毒在寄主細(xì)胞中呈游離態(tài)，基因瞬時(shí)表達(dá)態(tài)，基因瞬時(shí)表達(dá)可侵染處于分裂期或非分裂可侵染處于分裂期或非分裂期的寄主細(xì)胞期的寄主細(xì)胞高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)雙載體系統(tǒng)的操作雙載體系統(tǒng)的操作病毒的效價(jià)可達(dá)病毒的效價(jià)可達(dá) 1012 pfu/ml平均可插入平均可插入8kb的外源片段的外源片段長(zhǎng)期、穩(wěn)定的基因表達(dá)，可長(zhǎng)期、穩(wěn)定的基因表達(dá)，可以遺傳以遺傳只能侵染分裂期的寄主細(xì)胞只能侵染分裂期的寄主細(xì)胞中度的蛋白表達(dá)水平中度的蛋白表達(dá)水平單一載體操作單一載體操作病毒效價(jià)達(dá)病毒效價(jià)達(dá) 106 pfu/ml平均可插入平均可插入6.5kb的外源片段的外源片段腺病毒表達(dá)系統(tǒng)腺病毒表達(dá)系統(tǒng) 逆轉(zhuǎn)錄病毒表

16、達(dá)系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng) AdenoAdeno-X-X VS Retrovirus Expression System VS Retrovirus Expression SystemRetroviral Expression System逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng) EnvEnv、polpol、gaggag為為RNARNA病病毒中控制復(fù)制和表達(dá)外毒中控制復(fù)制和表達(dá)外膜蛋白的基因。膜蛋白的基因。 重新構(gòu)建的反轉(zhuǎn)錄病毒重新構(gòu)建的反轉(zhuǎn)錄病毒載體將去除載體將去除gaggag、polpol、envenv基因，并將它們整基因，并將它們整合到包裝細(xì)胞株的基因合到包裝細(xì)胞株的基因組中。組中。 + +是

17、是RNARNA病毒包裝時(shí)的病毒包裝時(shí)的識(shí)別序列識(shí)別序列，保留在反轉(zhuǎn)，保留在反轉(zhuǎn)錄病毒載體中。錄病毒載體中。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建和改造逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建和改造逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝過(guò)程包裝過(guò)程Retro-X Retroviral Expression VectorsLRCX Retroviral Expression VectorsMSCV Retroviral Expression System小鼠干細(xì)胞病毒表達(dá)載體小鼠干細(xì)胞病毒表達(dá)載體造血細(xì)胞造血細(xì)胞胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞胚胎性癌細(xì)胞胚胎性癌細(xì)胞Pantropic Retroviral Expression System宿主范圍廣宿主

18、范圍廣泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)為什么泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒的宿主范圍如此廣？為什么泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒的宿主范圍如此廣？n外膜蛋白識(shí)別宿主細(xì)胞表面的受體外膜蛋白識(shí)別宿主細(xì)胞表面的受體nVSV-GVSV-G外膜蛋白不需識(shí)別宿主細(xì)胞表面的受體外膜蛋白不需識(shí)別宿主細(xì)胞表面的受體nPackage cell line GP2-293Package cell line GP2-293整合有整合有g(shù)ag-polgag-pol 基基因因npVSVpVSV-G -G 載體與載體與pLXRNpLXRN 載體共轉(zhuǎn)化載體共轉(zhuǎn)化Pantropic Retroviral Expression SystemPackage Cell Line GP-293 pLXRNpLXRN pVSVpVSV-G-GPantropic Retroviral Expression Vector泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體帶帶GFP報(bào)告基因的報(bào)告基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體RevTet-On & Off Gene E