1、主講人：劉立新西安電子科技大學(xué)1第第 5 章章生物光子學(xué)成像技術(shù)生物光子學(xué)成像技術(shù)25.1 光學(xué)成像光學(xué)成像5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù) 5.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù) 5.6 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù) 5.7 熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像技術(shù)5.8 熒光壽命成像顯微技術(shù)熒光壽命成像顯微技術(shù)5.9 光學(xué)相干層析成像技術(shù)光學(xué)相干層析成像技術(shù)5.10 非線性光學(xué)成像技術(shù)非線性光學(xué)成像技術(shù)5.11 生物光子學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)生物光子學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)本本

2、章章 內(nèi)內(nèi) 容容3激光掃描共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope， LSCM)是是20世紀(jì)世紀(jì)80年代年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的高科技新產(chǎn)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的高科技新產(chǎn)品，是當(dāng)今世界最先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器，品，是當(dāng)今世界最先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器，有有細(xì)胞細(xì)胞“CT”之稱(chēng)之稱(chēng)。激光共聚焦顯微鏡利用激光共聚焦顯微鏡利用激光激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦共軛聚焦的原理和裝置，以及通過(guò)的原理和裝置，以及通過(guò)針孔針孔的選擇和的選擇和PMT的收集，并帶有的收集，并帶

3、有一套對(duì)其所觀察到的對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖像分析處理的系統(tǒng)一套對(duì)其所觀察到的對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖像分析處理的系統(tǒng)軟件軟件。與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，它具有更與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，它具有更高的分辨率高的分辨率，實(shí)現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)觀察觀察并可形成清晰的并可形成清晰的三維圖像三維圖像等優(yōu)點(diǎn)。所以它問(wèn)世以來(lái)在等優(yōu)點(diǎn)。所以它問(wèn)世以來(lái)在形態(tài)學(xué)、分形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域中得到了廣泛研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。應(yīng)用。 5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)4 4全場(chǎng)和共焦熒光顯微技術(shù)全場(chǎng)和共焦熒光顯微技術(shù)在常規(guī)的在常規(guī)的

4、全場(chǎng)顯微鏡全場(chǎng)顯微鏡中，整個(gè)樣品都被光（汞燈、氙燈等光源）照射，可中，整個(gè)樣品都被光（汞燈、氙燈等光源）照射，可以用眼睛直接觀察圖像，或?qū)D像成像到圖像探測(cè)器如以用眼睛直接觀察圖像，或?qū)D像成像到圖像探測(cè)器如CCD相機(jī)上。相機(jī)上。在在共焦顯微鏡共焦顯微鏡中，用聚焦光（一般來(lái)自激光）沿著樣品進(jìn)行中，用聚焦光（一般來(lái)自激光）沿著樣品進(jìn)行逐點(diǎn)掃描逐點(diǎn)掃描、照、照明和探測(cè)（用點(diǎn)探測(cè)器如明和探測(cè)（用點(diǎn)探測(cè)器如PMT和和APD），用計(jì)算機(jī)），用計(jì)算機(jī)重構(gòu)重構(gòu)樣品的圖像。樣品的圖像。用光束掃描的方法得到的圖像是樣品的一個(gè)光學(xué)切片。用光束掃描的方法得到的圖像是樣品的一個(gè)光學(xué)切片。5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)

5、激光掃描共聚焦顯微技術(shù)5Wide-field Fluorescent MicroscopeObjectiveArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterObjectiveLaserEmission PinholeExcitation PinholePMTEmissionFilterExcitation FilterConfocal Microscope65.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù) LSCM原理示意圖原理示意圖Marvin Minsky (1950s)基本原理：相干光（激光）通過(guò)與基

6、本原理：相干光（激光）通過(guò)與樣品上掃描光點(diǎn)共軛（共焦）面上樣品上掃描光點(diǎn)共軛（共焦）面上的一個(gè)針孔；的一個(gè)針孔；光束被光束被DM反射到樣品上，光點(diǎn)在反射到樣品上，光點(diǎn)在某一個(gè)焦面上沿著樣品掃描；某一個(gè)焦面上沿著樣品掃描；照明點(diǎn)發(fā)出的熒光照明點(diǎn)發(fā)出的熒光 (同一焦面）通同一焦面）通過(guò)過(guò)DM后被聚焦成一點(diǎn)，成像到探后被聚焦成一點(diǎn)，成像到探測(cè)器前的共焦針孔上；測(cè)器前的共焦針孔上；焦面外的光不能到達(dá)焦面外的光不能到達(dá)PMT；PMT將聚焦光轉(zhuǎn)換成模擬電信號(hào)將聚焦光轉(zhuǎn)換成模擬電信號(hào)（電壓不同代表強(qiáng)度不同）；（電壓不同代表強(qiáng)度不同）；通過(guò)移動(dòng)顯微鏡的樣品臺(tái)，可以對(duì)通過(guò)移動(dòng)顯微鏡的樣品臺(tái)，可以對(duì)不同的焦面進(jìn)行

7、掃描。不同的焦面進(jìn)行掃描。5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)7 Marvin Minskys patent picture5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)8 8LSCM光路光路5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)9 9 全場(chǎng)顯微圖全場(chǎng)顯微圖(a,b,c) 共焦顯微圖共焦顯微圖(d,e,f)，5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)103D共焦與全場(chǎng)共焦與全場(chǎng)顯微圖比較顯微圖比較 115.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)共聚焦光共聚焦光學(xué)切片學(xué)切片3D3D重構(gòu)圖重構(gòu)圖 減少由于焦面外光散射產(chǎn)生的圖像模糊（背景消除）

8、減少由于焦面外光散射產(chǎn)生的圖像模糊（背景消除） 增加有效分辨率增加有效分辨率 控制景深，控制景深，提高信噪比提高信噪比 厚樣品光學(xué)切片的序列采集（厚樣品光學(xué)切片的序列采集（Z軸切片掃描軸切片掃描3D重建）重建） 可以實(shí)現(xiàn)數(shù)字放大倍率的調(diào)節(jié)可以實(shí)現(xiàn)數(shù)字放大倍率的調(diào)節(jié) 活體樣品成像活體樣品成像 多色標(biāo)記多色標(biāo)記共聚焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)共聚焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)12共焦顯微掃描系統(tǒng)共焦顯微掃描系統(tǒng)：樣品臺(tái)掃描樣品臺(tái)掃描-掃描光束靜止，載有樣品的樣品臺(tái)移動(dòng)掃描光束靜止，載有樣品的樣品臺(tái)移動(dòng)光束掃描光束掃描-樣品靜止，光束移動(dòng)樣品靜止，光束移動(dòng)1.單光束單光束 (c

9、LSM): 速度慢速度慢2.多光束多光束(旋轉(zhuǎn)盤(pán)旋轉(zhuǎn)盤(pán)): 速度快（幾乎實(shí)時(shí)速度快（幾乎實(shí)時(shí))1 12 25.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)13 序列數(shù)據(jù)采集序列數(shù)據(jù)采集 光學(xué)切片光學(xué)切片 圖像特征圖像特征 應(yīng)用應(yīng)用圖像采集的速度逐點(diǎn)重構(gòu)圖像x-y掃描和z切片縮放因子點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù) (PSF)動(dòng)態(tài)范圍3D-圖像重建4D-時(shí)序成像5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)1414序列數(shù)據(jù)采集：圖像采集速度序列數(shù)據(jù)采集：圖像采集速度掃描掃描意味著每一層的圖像通過(guò)序列取樣來(lái)進(jìn)行構(gòu)建，用移動(dòng)光束掃描意味著每一層的圖像通過(guò)序列取樣來(lái)進(jìn)行構(gòu)建，用移動(dòng)光束掃描樣品，與全場(chǎng)方法相比有一

10、些缺點(diǎn)：樣品，與全場(chǎng)方法相比有一些缺點(diǎn)：全場(chǎng)顯微鏡全場(chǎng)顯微鏡同時(shí)獲取整個(gè)圖像更適用于活細(xì)胞或運(yùn)動(dòng)細(xì)胞共焦顯微鏡共焦顯微鏡逐個(gè)照明各個(gè)區(qū)域，直至整個(gè)視野被取樣-圖像采集速度慢活細(xì)胞，運(yùn)動(dòng)細(xì)胞-Nipkow disk-type system與計(jì)算機(jī)圖像存貯技術(shù)兼容，在細(xì)胞或組織內(nèi)產(chǎn)生高空間分辨數(shù)與計(jì)算機(jī)圖像存貯技術(shù)兼容，在細(xì)胞或組織內(nèi)產(chǎn)生高空間分辨數(shù)字化數(shù)據(jù)集，反映標(biāo)記物的三維分布，或細(xì)胞的層析成像。字化數(shù)據(jù)集，反映標(biāo)記物的三維分布，或細(xì)胞的層析成像。5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)1515 目的是用盡可能小的聚焦光點(diǎn)在焦面上照明樣品。目的是用盡可能小的聚焦光點(diǎn)在焦面上照明樣品

11、。 將準(zhǔn)直的平面波從后方送入物鏡，被物鏡變成匯聚的球面波，形成將準(zhǔn)直的平面波從后方送入物鏡，被物鏡變成匯聚的球面波，形成衍射受限激發(fā)光點(diǎn)。衍射受限激發(fā)光點(diǎn)。 這樣，利用了物鏡的最大數(shù)值孔徑這樣，利用了物鏡的最大數(shù)值孔徑NA，將光聚焦成非常小的光點(diǎn)。，將光聚焦成非常小的光點(diǎn)。 照明光點(diǎn)沿著樣品做兩維柵掃描，將照明點(diǎn)的光信號(hào)按照照明光點(diǎn)沿著樣品做兩維柵掃描，將照明點(diǎn)的光信號(hào)按照對(duì)應(yīng)位置和亮度顯示在監(jiān)視器上。對(duì)應(yīng)位置和亮度顯示在監(jiān)視器上。 逐點(diǎn)構(gòu)成樣品的圖像。逐點(diǎn)構(gòu)成樣品的圖像。序列數(shù)據(jù)采集：逐點(diǎn)構(gòu)建圖像序列數(shù)據(jù)采集：逐點(diǎn)構(gòu)建圖像5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)1616光束掃描光

12、束掃描聚焦光束在樣品表面做橫向的聚焦光束在樣品表面做橫向的 (x-y平面平面)柵掃描，利用檢流計(jì)馬柵掃描，利用檢流計(jì)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)兩面鏡子的振動(dòng)來(lái)進(jìn)行光束掃描，產(chǎn)生掃描圖案。達(dá)驅(qū)動(dòng)兩面鏡子的振動(dòng)來(lái)進(jìn)行光束掃描，產(chǎn)生掃描圖案。5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)17172D 圖像：圖像：x-y掃描掃描5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)1818光學(xué)切片：光學(xué)切片：Z切片和樣品的切片和樣品的3-D重建重建在共焦圖像中沒(méi)有非焦面的光的干擾，因此可以對(duì)完整的在共焦圖像中沒(méi)有非焦面的光的干擾，因此可以對(duì)完整的固定或活體樣品進(jìn)行直接的非侵入序列光學(xué)切片觀察固定或活體樣品進(jìn)行直接的

13、非侵入序列光學(xué)切片觀察-對(duì)透明樣品如細(xì)胞和組織進(jìn)行對(duì)透明樣品如細(xì)胞和組織進(jìn)行3-D成像。成像。5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)1919花粉粒的花粉粒的3-D重建重建盡管只顯示了序列采集的盡管只顯示了序列采集的36幅圖像中的幅圖像中的12幅，但是這些圖像代表了相距幅，但是這些圖像代表了相距為大約為大約3m的不同焦面，顯示了花粉顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)。的不同焦面，顯示了花粉顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)。5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)2020全場(chǎng)成像和共聚焦全場(chǎng)成像和共聚焦全場(chǎng)成像全場(chǎng)成像共聚焦共聚焦5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)2121實(shí)際的樣品不是點(diǎn)源，而是

14、由無(wú)窮多的小于系統(tǒng)分辨率的物體組成的。實(shí)際的樣品不是點(diǎn)源，而是由無(wú)窮多的小于系統(tǒng)分辨率的物體組成的。圖像特征：點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)圖像特征：點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù) （PSF 和和愛(ài)里斑愛(ài)里斑）某一點(diǎn)的熒光團(tuán)被激發(fā)后，某一點(diǎn)的熒光團(tuán)被激發(fā)后，n熒光團(tuán)向空間各個(gè)方向發(fā)射熒光熒光團(tuán)向空間各個(gè)方向發(fā)射熒光n部分熒光被聚焦，形成一個(gè)愛(ài)里部分熒光被聚焦，形成一個(gè)愛(ài)里斑，中間亮，周?chē)忻靼迪嚅g并斑，中間亮，周?chē)忻靼迪嚅g并依次遞減的圖案。依次遞減的圖案。5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)2222PSF (x,y,z)基于樣品空間無(wú)限小的一點(diǎn)的光發(fā)射基于樣品空間無(wú)限小的一點(diǎn)的光發(fā)射當(dāng)收集到樣品三維圖像時(shí)，就得到每

15、一點(diǎn)的完整的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)。點(diǎn)擴(kuò)展當(dāng)收集到樣品三維圖像時(shí)，就得到每一點(diǎn)的完整的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)。點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)描述了樣品中每一點(diǎn)發(fā)出的光經(jīng)過(guò)光學(xué)成像系統(tǒng)后的變化情況。函數(shù)描述了樣品中每一點(diǎn)發(fā)出的光經(jīng)過(guò)光學(xué)成像系統(tǒng)后的變化情況。5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)2323圖像圖像 離散陣列離散陣列 關(guān)于亮度或色調(diào)的詳細(xì)信息關(guān)于亮度或色調(diào)的詳細(xì)信息 精確的位置信息，詳細(xì)的數(shù)值信息精確的位置信息，詳細(xì)的數(shù)值信息圖像特征：將連續(xù)圖像變成數(shù)字形式圖像特征：將連續(xù)圖像變成數(shù)字形式包含強(qiáng)度信息的小的包含強(qiáng)度信息的小的矩形塊組成的兩維陣矩形塊組成的兩維陣列列-像素像素5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共

16、聚焦顯微技術(shù)2424圖像特征：將連續(xù)圖像變成數(shù)字形式圖像特征：將連續(xù)圖像變成數(shù)字形式為了將連續(xù)圖像轉(zhuǎn)變成數(shù)字形式，采用兩個(gè)分別被稱(chēng)為為了將連續(xù)圖像轉(zhuǎn)變成數(shù)字形式，采用兩個(gè)分別被稱(chēng)為取樣取樣和和量化量化的過(guò)程，將模擬圖像被分成獨(dú)立的亮度值的過(guò)程，將模擬圖像被分成獨(dú)立的亮度值 。Sample area 100 x100 mImage area is 512x512 pixelsPixel size (m)=100/512取樣間隔取樣間隔在顯微鏡中，那些小于數(shù)字抽樣間隔的結(jié)構(gòu)在數(shù)字圖像上在顯微鏡中，那些小于數(shù)字抽樣間隔的結(jié)構(gòu)在數(shù)字圖像上無(wú)法表示出來(lái)無(wú)法表示出來(lái)- Nyquist取樣定理或標(biāo)準(zhǔn)取樣定理

17、或標(biāo)準(zhǔn)5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)2525圖像特征：取樣圖像特征：取樣如果在取樣過(guò)程中像素?cái)?shù)太少，那么，所有組成樣品的空間細(xì)節(jié)如果在取樣過(guò)程中像素?cái)?shù)太少，那么，所有組成樣品的空間細(xì)節(jié)將在圖像中無(wú)法表示出來(lái)。將在圖像中無(wú)法表示出來(lái)。如果取樣像素?cái)?shù)過(guò)多，那么也不能得到額外的空間信息，這時(shí)認(rèn)如果取樣像素?cái)?shù)過(guò)多，那么也不能得到額外的空間信息，這時(shí)認(rèn)為對(duì)樣品過(guò)取樣。為對(duì)樣品過(guò)取樣。5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)2626縮放因子縮放因子優(yōu)點(diǎn)：不需要更換物鏡，而通過(guò)改變激光掃描的區(qū)優(yōu)點(diǎn)：不需要更換物鏡，而通過(guò)改變激光掃描的區(qū)域來(lái)實(shí)現(xiàn)采用電子方式改變放大倍率域來(lái)實(shí)

18、現(xiàn)采用電子方式改變放大倍率縮放因子縮放因子通過(guò)減小掃描角度來(lái)減小掃描區(qū)域減小像素尺寸改善分辨率5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)2727應(yīng)用應(yīng)用3D重建重建沿著沿著Z方向采集一系列方向采集一系列2D 圖像，從而重構(gòu)出圖像，從而重構(gòu)出3D圖像圖像4D成像：時(shí)序采集成像：時(shí)序采集 在不同時(shí)間采集在不同時(shí)間采集 Z-序列圖像，得到序列圖像，得到4D數(shù)據(jù)，包括三維空數(shù)據(jù)，包括三維空間間 (x, y,z)和一維時(shí)間（第四維），采用和一維時(shí)間（第四維），采用4D可視化軟件進(jìn)可視化軟件進(jìn)行觀察。行觀察。5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù)2828參考資料：高分辨率激光共焦顯

19、微成像技術(shù)新進(jìn)展參考資料：高分辨率激光共焦顯微成像技術(shù)新進(jìn)展http:/ 5.1 光學(xué)成像光學(xué)成像5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù) 5.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù) 5.6 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù) 5.7 熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像技術(shù)5.8 熒光壽命成像顯微技術(shù)熒光壽命成像顯微技術(shù)5.9 光學(xué)相干層析成像技術(shù)光學(xué)相干層析成像技術(shù)5.10 非線性光學(xué)成像技術(shù)非線性光學(xué)成像技術(shù)5.11 生物光子學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)生物光子學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)本本 章章 內(nèi)內(nèi)

20、 容容29熒光顯微成像熒光顯微成像 原理：激發(fā)熒光本質(zhì)上是受激吸收和自發(fā)輻射的過(guò)程，原理：激發(fā)熒光本質(zhì)上是受激吸收和自發(fā)輻射的過(guò)程，組織吸收高能量的光子，電子躍遷到激發(fā)態(tài)，然后躍遷組織吸收高能量的光子，電子躍遷到激發(fā)態(tài)，然后躍遷回低能態(tài)（不一定是基態(tài)，有可能是較低能量水平的激回低能態(tài)（不一定是基態(tài)，有可能是較低能量水平的激發(fā)態(tài)），并自發(fā)輻射光子（熒光）。發(fā)態(tài)），并自發(fā)輻射光子（熒光）。 熒光顯微像信噪比高，能夠區(qū)分非常低濃度的生色團(tuán)的熒光顯微像信噪比高，能夠區(qū)分非常低濃度的生色團(tuán)的空間分布?？臻g分布。 主要有單光子熒光成像和雙光子熒光成像主要有單光子熒光成像和雙光子熒光成像。5.5 多光子激發(fā)

21、熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)30單光子熒光顯微成像單光子熒光顯微成像 單光子激發(fā)中，熒光分子每吸收一個(gè)照明光子，從基單光子激發(fā)中，熒光分子每吸收一個(gè)照明光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，經(jīng)過(guò)能量弛豫后釋放一個(gè)態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，經(jīng)過(guò)能量弛豫后釋放一個(gè)波長(zhǎng)比激波長(zhǎng)比激發(fā)光子波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光光子發(fā)光子波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光光子。單光子熒光在深層組織細(xì)。單光子熒光在深層組織細(xì)胞會(huì)發(fā)生光子擴(kuò)散，導(dǎo)致圖像背景模糊不清。胞會(huì)發(fā)生光子擴(kuò)散，導(dǎo)致圖像背景模糊不清。5.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)315.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù) 雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光雙光子熒

22、光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。 雙光子激發(fā)的基本原理：在高光子密度的情況下，熒光分雙光子激發(fā)的基本原理：在高光子密度的情況下，熒光分子同時(shí)子同時(shí)(10-16s)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子。雙光子熒光顯微成像雙光子熒光顯微成像32 光源要求：光源要求： 雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器

23、高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的。這種激光器發(fā)出的激光具有很激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度，其脈沖寬度只有只有 100 fs，而其周期可以達(dá)到，而其周期可以達(dá)到 80 至至 100 兆赫。兆赫。 在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是最高的，的焦點(diǎn)處的光子密度是最高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測(cè)效率。熒光檢測(cè)效率。雙光子熒光顯微成像雙光

24、子熒光顯微成像5.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)33多光子的優(yōu)點(diǎn)：多光子的優(yōu)點(diǎn)： 減小光譜串?dāng)_；減小光譜串?dāng)_； 不用共焦針孔實(shí)現(xiàn)固有的三維分辨；不用共焦針孔實(shí)現(xiàn)固有的三維分辨； 長(zhǎng)波長(zhǎng)光成像深度深；長(zhǎng)波長(zhǎng)光成像深度深； 不采用不采用UVUV光學(xué)器件對(duì)光學(xué)器件對(duì)UVUV染料成像；染料成像； 在焦點(diǎn)外區(qū)域的光漂白和光損傷小。在焦點(diǎn)外區(qū)域的光漂白和光損傷小。多光子的缺點(diǎn)（與共焦相比）多光子的缺點(diǎn)（與共焦相比） 操作復(fù)雜操作復(fù)雜 系統(tǒng)昂貴系統(tǒng)昂貴5.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)34 比較單光子熒光和雙光子熒光：比較單光子熒光和雙光子熒光： 1）在單光子激發(fā)狀態(tài)下，

25、發(fā)射波長(zhǎng)大于激發(fā)波長(zhǎng)，熒光發(fā)）在單光子激發(fā)狀態(tài)下，發(fā)射波長(zhǎng)大于激發(fā)波長(zhǎng)，熒光發(fā)射率與激發(fā)強(qiáng)度成正比，結(jié)果熒光在整個(gè)激發(fā)路徑上產(chǎn)生。射率與激發(fā)強(qiáng)度成正比，結(jié)果熒光在整個(gè)激發(fā)路徑上產(chǎn)生。 2）在雙光子激發(fā)過(guò)程中，利用波長(zhǎng)更長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)，熒）在雙光子激發(fā)過(guò)程中，利用波長(zhǎng)更長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)，熒光由同時(shí)吸收的兩個(gè)光子產(chǎn)生，這樣熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度光由同時(shí)吸收的兩個(gè)光子產(chǎn)生，這樣熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度的平方成比例。的平方成比例。 3）單光子激發(fā)只適用于對(duì)樣品表面進(jìn)行成像）單光子激發(fā)只適用于對(duì)樣品表面進(jìn)行成像; 雙光子激發(fā)能雙光子激發(fā)能夠?qū)悠繁砻嬉韵聨装傥⒚椎纳疃冗M(jìn)行成像。夠?qū)悠繁砻嬉韵聨装傥⒚椎纳疃冗M(jìn)行

26、成像。 5.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)35雙光子熒光顯微裝置雙光子熒光顯微裝置5.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)365.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)375.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)解掃探測(cè)，解掃探測(cè)，Descanned Detection (DDD)非解掃探測(cè)，非解掃探測(cè)，Non-Descanned Detection (NDD)掃描光路掃描光路3838光漂白光漂白395.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)39吸收截面大，吸收截面大，StokesStokes紅移大紅移大405.5 多光子激發(fā)熒光顯

27、微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)40活體神經(jīng)元細(xì)胞雙光子成像活體神經(jīng)元細(xì)胞雙光子成像415.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)41老鼠腎臟細(xì)胞的多通道雙光子熒光圖像老鼠腎臟細(xì)胞的多通道雙光子熒光圖像MPFM應(yīng)用425.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)42利用雙光子激光掃描顯微測(cè)量細(xì)胞質(zhì)中的利用雙光子激光掃描顯微測(cè)量細(xì)胞質(zhì)中的GSH水平水平Gutirrez-Alcal G et al. PNAS 2000;97:11108-11113Gutirrez-Alcal G et al. PNAS 2000;97:11108-11113MPFM應(yīng)用應(yīng)用435.5 多光子激發(fā)熒光

28、顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)43MPFM應(yīng)用應(yīng)用445.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)44MPFM應(yīng)用應(yīng)用-活體肺部組織活體肺部組織455.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)45MPFM應(yīng)用應(yīng)用-蕃紅精染色的斑馬魚(yú)蕃紅精染色的斑馬魚(yú)5.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)46465.1 光學(xué)成像光學(xué)成像5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù) 5.5 多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù) 5.6 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù) 5.7 熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像

29、技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像技術(shù)5.8 熒光壽命成像顯微技術(shù)熒光壽命成像顯微技術(shù)5.9 光學(xué)相干層析成像技術(shù)光學(xué)相干層析成像技術(shù)5.10 非線性光學(xué)成像技術(shù)非線性光學(xué)成像技術(shù)5.11 生物光子學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)生物光子學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)本本 章章 內(nèi)內(nèi) 容容47 1 c c : critical angle 1 1 3 3 2 2 5.6 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)全內(nèi)反射原理全內(nèi)反射原理48當(dāng)光從光密（折射率大）介質(zhì)入射到光疏（折射率?。┙橘|(zhì)的界面時(shí)，當(dāng)光從光密（折射率大）介質(zhì)入射到光疏（折射率?。┙橘|(zhì)的界面時(shí)，發(fā)生光的部分反射和折射現(xiàn)象；當(dāng)入射角大于臨界角時(shí)，光線會(huì)停止發(fā)生光

30、的部分反射和折射現(xiàn)象；當(dāng)入射角大于臨界角時(shí)，光線會(huì)停止進(jìn)入光疏介質(zhì)，而全部反射回光密介質(zhì)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為全反射。進(jìn)入光疏介質(zhì)，而全部反射回光密介質(zhì)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為全反射。2C1arcsinnn48倏逝波：倏逝波：通常是指由于全反通常是指由于全反射而在兩種不同介質(zhì)的分界面射而在兩種不同介質(zhì)的分界面上產(chǎn)生的一種電磁波，又叫消上產(chǎn)生的一種電磁波，又叫消逝波，其幅值隨與分界面相垂逝波，其幅值隨與分界面相垂直的深度的增大而呈指數(shù)形式直的深度的增大而呈指數(shù)形式衰減。衰減。5.6 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)49n1n2 穿透深度：穿透深度：1p22122sin(/)dnn0pexp(/)zEEz

31、d49全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)（total internal reflection fluorescence microscopy，TIRFM）是近年來(lái)新興的一種光學(xué)成像技術(shù)，它）是近年來(lái)新興的一種光學(xué)成像技術(shù)，它利用全利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的隱失場(chǎng)來(lái)照明樣品內(nèi)反射產(chǎn)生的隱失場(chǎng)來(lái)照明樣品，從而致使在百納米級(jí)厚的光學(xué)薄層，從而致使在百納米級(jí)厚的光學(xué)薄層內(nèi)的熒光團(tuán)受到激發(fā)，熒光成像的信噪比大大提高。內(nèi)的熒光團(tuán)受到激發(fā)，熒光成像的信噪比大大提高。TIRFM可以看到樣品表面單分子活動(dòng)的情況，成像裝置簡(jiǎn)單，易于可以看到樣品表面單分子活動(dòng)的情況，成像裝置簡(jiǎn)單，易于和其他成像技術(shù)、探測(cè)技術(shù)相結(jié)合，目前已成功實(shí)現(xiàn)和其他成像技術(shù)、探測(cè)技術(shù)相結(jié)合，目前已成功實(shí)現(xiàn)100nm甚至更低甚至更低的空間分辨率。的空間分辨率。5.6 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)505051發(fā)發(fā)展展歷歷史：史：5.6 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù) 全內(nèi)反射熒光顯微（全內(nèi)反射熒光顯微（TIRFM）：）：適用于探測(cè)固體基底上適用于探測(cè)固體基底上100nm范圍內(nèi)的細(xì)胞環(huán)境。范圍內(nèi)的細(xì)胞環(huán)境。 TIRFM原理：原理：依靠在離固體基底依靠在離固體