1、擬南芥漆酶基因AtLAC4參與生長及非生物脅迫響應(yīng)符曉婕摘要 植物漆酶基因家族在擬南芥中共有植物漆酶基因家族在擬南芥中共有1717個成個成員員, , 目前各基因的具體功能尚不十分清楚。目前各基因的具體功能尚不十分清楚。該研究利用過量表達(dá)的方法初步分析了擬該研究利用過量表達(dá)的方法初步分析了擬南芥南芥AtLAC4AtLAC4的功能。的功能。 GUSGUS染色顯示染色顯示AtLAC4AtLAC4在擬南芥的維管組織中在擬南芥的維管組織中有較強的表達(dá)有較強的表達(dá), , 并在葉片排水器中特異表并在葉片排水器中特異表達(dá)。達(dá)。 AtLAC4AtLAC4過量表達(dá)導(dǎo)致植株木質(zhì)素含量增多、過量表達(dá)導(dǎo)致植株木質(zhì)素含量

2、增多、次生壁加厚、植株變小和蓮座葉葉柄變短。次生壁加厚、植株變小和蓮座葉葉柄變短。 ABAABA對對AtLAC4AtLAC4的表達(dá)具有明顯的誘導(dǎo)作用的表達(dá)具有明顯的誘導(dǎo)作用, , AtLAC4AtLAC4過量表達(dá)植株對外源過量表達(dá)植株對外源ABAABA敏感敏感; ; 干旱干旱處理后處理后,AtLAC4,AtLAC4過量表達(dá)植株的耐旱能力比過量表達(dá)植株的耐旱能力比野生型明顯增強。野生型明顯增強。 漆酶漆酶(Laccase)(Laccase)是一種含銅的多酚氧化酶是一種含銅的多酚氧化酶, , 最早是最早是從漆樹從漆樹(Rhus venicifera)(Rhus venicifera)的分泌物中發(fā)現(xiàn)

3、的。按的分泌物中發(fā)現(xiàn)的。按其來源主要分為植物漆酶其來源主要分為植物漆酶(Rhus Laccase)(Rhus Laccase)和真菌和真菌漆酶漆酶(Fungal Laccase)(Fungal Laccase)兩大類。兩大類。 植物漆酶一般是由約植物漆酶一般是由約500500個氨基酸的單一多肽組成。個氨基酸的單一多肽組成。Cu2+Cu2+以配位鍵與特定的氨基酸相連以配位鍵與特定的氨基酸相連, , 并處于漆酶并處于漆酶的活性部位的活性部位, , 在漆酶的催化氧化過程中起決定作在漆酶的催化氧化過程中起決定作用。用。前言前言 作為多酚氧化酶家族的漆酶還能夠使酚類化合物作為多酚氧化酶家族的漆酶還能夠使

4、酚類化合物聚合聚合, , 參與對傷害的防御反應(yīng)參與對傷害的防御反應(yīng), , 使植物免受昆蟲使植物免受昆蟲和病原體的侵襲和病原體的侵襲。擬南芥中漆酶基因家族共。擬南芥中漆酶基因家族共有有1717個成員。個成員。McCaigMcCaig等運用構(gòu)建系統(tǒng)進化樹等生物信等運用構(gòu)建系統(tǒng)進化樹等生物信息學(xué)方法將此息學(xué)方法將此1717個基因歸類至個基因歸類至6 6個漆酶亞家族中。個漆酶亞家族中。 關(guān)于漆酶家族成員生物學(xué)功能的研究則報道較少。關(guān)于漆酶家族成員生物學(xué)功能的研究則報道較少。ZhouZhou和和BerthetBerthet等對擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)等對擬南芥的研究發(fā)現(xiàn), AtLAC4 , AtLAC4 可能在

5、木質(zhì)素及植物次生壁合成過程中起重要作可能在木質(zhì)素及植物次生壁合成過程中起重要作用。但是其在植物生長發(fā)育中的具體生物學(xué)功能用。但是其在植物生長發(fā)育中的具體生物學(xué)功能尚不十分清楚尚不十分清楚, , 需要更多的實驗數(shù)據(jù)來闡明。需要更多的實驗數(shù)據(jù)來闡明。 本文主要以過量表達(dá)本文主要以過量表達(dá)AtLAC4 AtLAC4 植株和植株和AtLAC4 AtLAC4 啟動啟動子與子與-glucuronidase(GUS)-glucuronidase(GUS)報告基因融合表達(dá)報告基因融合表達(dá)植株為材料植株為材料, , 研究在植物生長發(fā)育過程中和響應(yīng)研究在植物生長發(fā)育過程中和響應(yīng)外界環(huán)境時該基因的功能外界環(huán)境時該基

6、因的功能, , 為為AtLAC4AtLAC4基因及植物基因及植物漆酶基因家族的功能研究提供證據(jù)漆酶基因家族的功能研究提供證據(jù)。1.1 植物材料與處理 擬南芥種子先經(jīng)擬南芥種子先經(jīng)70%70%乙醇表面消毒乙醇表面消毒3030秒秒, , 之后加入之后加入10%10%次氯次氯酸鈉消毒酸鈉消毒1010分鐘分鐘, , 無菌水沖洗無菌水沖洗4545次后均勻播種于次后均勻播種于MSMS平板平板上。上。4 4C C保濕黑暗冷藏保濕黑暗冷藏3 3天打破休眠天打破休眠, , 之后移至擬南芥培之后移至擬南芥培養(yǎng)室中培養(yǎng)。養(yǎng)室中培養(yǎng)。1010天后移至土壤中生長天后移至土壤中生長, , 培養(yǎng)溫度為培養(yǎng)溫度為(22(22

7、2)2)C, C, 光暗周期為光暗周期為1616小時光照小時光照/8/8小時黑暗小時黑暗, , 光照強光照強度為度為120150 molm2s1120150 molm2s1。 取取MSMS培養(yǎng)基上生長培養(yǎng)基上生長1414天的野生型擬南芥天的野生型擬南芥, , 分別用無菌水、分別用無菌水、100 molL1100 molL1赤霉素、赤霉素、100 molL1100 molL1萘乙酸、萘乙酸、100 100 molL1molL1脫落酸、脫落酸、1 mmolL11 mmolL1水楊酸、水楊酸、30mmolL130mmolL1蔗糖、蔗糖、15%15%聚乙二醇、聚乙二醇、5 molL1 CuSO45 m

8、olL1 CuSO4以及以及4 4C C處理處理3 3個小時個小時, , 然后取樣然后取樣, , 用于提取用于提取RNARNA進行基因進行基因表達(dá)檢測。表達(dá)檢測。 以野生型為對照以野生型為對照, , 觀察各轉(zhuǎn)基因植株及突變體在觀察各轉(zhuǎn)基因植株及突變體在不同生長發(fā)育時期的生長狀況不同生長發(fā)育時期的生長狀況, , 拍照并測定相關(guān)拍照并測定相關(guān)數(shù)據(jù)。種子萌發(fā)以胚根突破種皮為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)。種子萌發(fā)以胚根突破種皮為標(biāo)準(zhǔn). . 葉柄長度統(tǒng)計時葉柄長度統(tǒng)計時, ,分別取分別取1616株野生型株野生型35S:AtLAC435S:AtLAC4植植株的第株的第510510片蓮座葉進行測定。取生長片蓮座葉進行測定。取生

9、長2020天左右天左右的野生型和過量表達(dá)植物進行干旱脅迫處理的野生型和過量表達(dá)植物進行干旱脅迫處理, , 連連續(xù)處理續(xù)處理1010天和天和2020天后進行表型觀察。所有表型分天后進行表型觀察。所有表型分析實驗均在相同條件下重復(fù)進行析實驗均在相同條件下重復(fù)進行3 3次。次。1.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得 GUSGUS基因的植物表達(dá)載體為基因的植物表達(dá)載體為pCAMBIA1303, pCAMBIA1303, 利用利用5 5- -ACTGAGCTCACCATAGTTTTCATTGGAC-ACTGAGCTCACCATAGTTTTCATTGGAC-33和和5 5- -ATACCATGGCTCCCTCTCTA

10、TCTTTCTC-ATACCATGGCTCCCTCTCTATCTTTCTC-33從植物基因組從植物基因組DNADNA中擴增中擴增AtLAC4AtLAC4的啟動的啟動子序列子序列; ; 測序正確后測序正確后, , 利用利用SacISacI和和NcoINcoI將將啟動子構(gòu)建到啟動子構(gòu)建到GUSGUS植物表達(dá)載體中。過量表植物表達(dá)載體中。過量表達(dá)載體為改造過的達(dá)載體為改造過的pCAMBIA-1390 pCAMBIA-1390 。 利用引利用引物物5AGTTCTAGAATGGGGTCTCATATGGTTTG-5AGTTCTAGAATGGGGTCTCATATGGTTTG-3 3 和和5-ATTGGATC

11、CTTAGCACTTGGGAAGATC-35-ATTGGATCCTTAGCACTTGGGAAGATC-3將將AtLAC4AtLAC4基因的基因的CDSCDS連接到連接到T T載體上載體上; ; 測序正確后測序正確后, , 利用利用XbaIXbaI和和BamHIBamHI將將CDSCDS連接到植物過量表達(dá)載體連接到植物過量表達(dá)載體中。分別以中。分別以pCAMB- IA1303pCAMB- IA1303和改造過的和改造過的pCAMBIA1390pCAMBIA1390質(zhì)粒為對照質(zhì)粒為對照, , 用連接成功的植物表達(dá)用連接成功的植物表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404, LBA440

12、4, 并用花粉管浸染法并用花粉管浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥轉(zhuǎn)化擬南芥, , 潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因植株并進行潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因植株并進行PCRPCR檢檢測測, , 選取單位點插入的純合轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)選取單位點插入的純合轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)實驗。實驗。1.3 半定量RT-PCR 利用利用TrizolTrizol試劑試劑(Invitrogen)(Invitrogen)提取總提取總RNARNA后后, , 用用DNAaseI (Takara)DNAaseI (Takara)處理以消除基因組處理以消除基因組DNADNA的污染。的污染。定量后定量后, , 吸取等量的吸取等量的RNARNA并用并用PrimeScriptTM

13、PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)反轉(zhuǎn)錄試劑盒錄試劑盒(Takara)(Takara)進行進行cDNAcDNA第第1 1鏈的合成鏈的合成; ; 再吸取再吸取等量的等量的cDNAcDNA為模板進行為模板進行PCRPCR反應(yīng)反應(yīng), , 進行進行2626個循環(huán)。個循環(huán)。取取15LPCR15LPCR產(chǎn)物進行電泳檢測。產(chǎn)物進行電泳檢測。 檢測目的基因檢測目的基因AtLAC4AtLAC4的引物為的引物為5TCATCGTTCTAGGTGAATGGTGG-3 5TCATCGTTCTAGGTGAATGGTGG-3 和和5TCTTGAAGGACAAGCTGAACAGTG-3; 5TCTTGAAGGACAAGCTGAA

14、CAGTG-3; 內(nèi)參內(nèi)參ActinActin基因的引物為基因的引物為5-GTATGTGGCTATTCAGGCTGT-3 5-GTATGTGGCTATTCAGGCTGT-3 和和5-CTGGCGGTGCTTCTTCTCTG-35-CTGGCGGTGCTTCTTCTCTG-3。1.4 GUS組織化學(xué)染色 在含有在含有1 mmolL1EDTA1 mmolL1EDTA、0.1% TritonX-1000.1% TritonX-100、100 gmL1100 gmL1氯霉素、氯霉素、2 mmolL12 mmolL1鐵氰化鉀鐵氰化鉀和和2 mmolL12 mmolL1亞鐵氰化鉀的亞鐵氰化鉀的50 mmo

15、lL150 mmolL1磷酸磷酸緩沖液緩沖液(pH7.0)(pH7.0)中中, , 加入加入100 mgmL1X-Gluc100 mgmL1X-Gluc母母液液(N,N-(N,N-二甲基甲酰胺溶解二甲基甲酰胺溶解), ), 使使X-GlucX-Gluc終濃度為終濃度為1 1 mgmL1mgmL1。取幼苗或組織剪成小塊置于。取幼苗或組織剪成小塊置于1 mL1 mL配制配制好的上述染色液中好的上述染色液中,37,37C C溫育溫育1212小時小時, , 期間搖動期間搖動數(shù)次數(shù)次, 70%, 70%乙醇脫色至透明。乙醇脫色至透明。1.5 木質(zhì)素相對含量的測定 稱取稱取1 g1 g間苯三酚溶于間苯三酚

16、溶于100 mL100 mL配好的配好的10.1molL1HCl/10.1molL1HCl/乙醇乙醇(25/75,v/v)(25/75,v/v)溶液中溶液中; ; 取取擬南芥花莖靠近基部的一節(jié)擬南芥花莖靠近基部的一節(jié), , 徒手制作橫截面切徒手制作橫截面切片片, , 切片厚度約為切片厚度約為100 m; 100 m; 將切片置于配好的間將切片置于配好的間苯三酚苯三酚- -鹽酸鹽酸- -乙醇溶液中乙醇溶液中, , 染色約染色約3030分鐘分鐘; ; 之后之后, , 倒出染色液倒出染色液, ,用清水沖洗用清水沖洗3 3次次, , 洗掉浮色洗掉浮色; ; 將切片將切片置于載玻片上制成臨時裝片。在顯微

17、鏡下觀察并置于載玻片上制成臨時裝片。在顯微鏡下觀察并拍照。拍照。2 結(jié)果與分析2.1 AtLAC4的時空表達(dá) 結(jié)果表明結(jié)果表明, AtLAC4, AtLAC4基因啟動子驅(qū)動基因啟動子驅(qū)動GUSGUS可以在萌發(fā)可以在萌發(fā)3 3天種子的子葉和胚根天種子的子葉和胚根( (圖圖1A)1A)、萌發(fā)、萌發(fā)5 5天幼苗的根天幼苗的根維管束維管束( (圖圖1 1B)B)、1010天幼苗的子葉葉脈天幼苗的子葉葉脈( (圖圖1C)1C)、4545天植株花器官中的萼片、雌蕊柱頭、雄蕊花絲以天植株花器官中的萼片、雌蕊柱頭、雄蕊花絲以及角果與果柄連接處及角果與果柄連接處( (圖圖1J, K)1J, K)等明顯表達(dá)等明顯

18、表達(dá), , 且且AtLAC4AtLAC4在以上部位的表達(dá)模式與在以上部位的表達(dá)模式與BerthetBerthet等等(2011)(2011)的研究結(jié)果基本一致。的研究結(jié)果基本一致。 此外此外, AtLAC4, AtLAC4基因啟動子驅(qū)動基因啟動子驅(qū)動GUSGUS在植物的莖尖在植物的莖尖( (圖圖1I)1I)、根與花序軸的維管組織、根與花序軸的維管組織( (圖圖1E, G)1E, G)、下胚、下胚軸與根的連接處以及根的維管組織中軸與根的連接處以及根的維管組織中( (圖圖1F)1F)也有也有非常強的表達(dá)非常強的表達(dá), , 并在真葉并在真葉( (圖圖1D)1D)和蓮座葉葉緣排和蓮座葉葉緣排水器水器(

19、 (圖圖1H)1H)中有非常特異的表達(dá)中有非常特異的表達(dá)。 (A), (B) 分別為3天和5天的幼苗; (C) 10天幼苗的子葉; (D) 10天幼苗真葉葉緣排水器; (E) 花序軸維管組織; (F), (G) 根維管組織; (H) 蓮座葉葉緣排水器; (I) 莖尖; (J) 幼嫩的角果; (K) 花器官。2.2 AtLAC4過量表達(dá)引起植株變小 我們利用轉(zhuǎn)基因方法共獲得我們利用轉(zhuǎn)基因方法共獲得2424個個AtLAC4AtLAC4過量表達(dá)過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系轉(zhuǎn)基因株系, , 并選取其中潮霉素篩選過程中幼苗并選取其中潮霉素篩選過程中幼苗黃綠比符合黃綠比符合1:31:3并且純合的并且純合的2 2個轉(zhuǎn)

20、基因株系進行后個轉(zhuǎn)基因株系進行后續(xù)的功能分析。續(xù)的功能分析。 首先首先, , 我們對篩選的純合我們對篩選的純合35S:AtLAC435S:AtLAC4轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)基因植株進行進行AtLAC4AtLAC4基因表達(dá)水平檢測?；虮磉_(dá)水平檢測。RT-PCRRT-PCR結(jié)果結(jié)果( (圖圖2B)2B)表明表明, , 轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)基因植株中AtLAC4AtLAC4基因表達(dá)水平明顯升基因表達(dá)水平明顯升高。表型分析發(fā)現(xiàn)高。表型分析發(fā)現(xiàn), , 與野生型擬南芥相比與野生型擬南芥相比, , AtLAC4AtLAC4過量表達(dá)會引起植株變小。過量表達(dá)會引起植株變小。 (A) 35(A) 35天和天和4040天的天的3

21、5S:AtLAC435S:AtLAC4轉(zhuǎn)基因植株的表型轉(zhuǎn)基因植株的表型, , 其中其中4040天為去天為去除花莖的植株除花莖的植株(1) (1) 在由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)化為生殖生長的過程中在由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)化為生殖生長的過程中, , 特別特別是在抽薹后是在抽薹后(3040(3040天天), AtLAC4), AtLAC4過量表達(dá)植株的花莖比野生型伸過量表達(dá)植株的花莖比野生型伸長得慢長得慢, , 蓮座葉的直徑明顯小于野生型蓮座葉的直徑明顯小于野生型( (圖圖2A); (2)402A); (2)40天的植株天的植株去除花莖后去除花莖后, AtLAC4, AtLAC4過量表達(dá)植株各蓮座葉所形成的蓮座大小明過量表

22、達(dá)植株各蓮座葉所形成的蓮座大小明顯小于野生型顯小于野生型( (圖圖2A)2A)。 由于蓮座直徑的大小主要與第由于蓮座直徑的大小主要與第510510片蓮座葉葉片蓮座葉葉柄的長短有關(guān)柄的長短有關(guān), , 因此因此, , 我們測定了擬南芥的第我們測定了擬南芥的第510510片蓮座葉葉柄的長度。結(jié)果表明片蓮座葉葉柄的長度。結(jié)果表明, AtLAC4, AtLAC4過過量表達(dá)植株的葉柄長度明顯比野生型的短量表達(dá)植株的葉柄長度明顯比野生型的短, , 所選所選野生型的平均葉片葉柄長度一般為野生型的平均葉片葉柄長度一般為1.01.2 cm, 1.01.2 cm, 而而AtLAC4AtLAC4過量表達(dá)植株的葉柄長度

23、僅為過量表達(dá)植株的葉柄長度僅為0.8 cm0.8 cm左左右右( (圖圖2C)2C)。2.3 AtLAC4過量表達(dá)植株木質(zhì)素相對含量增多 在在AtLAC4AtLAC4過量表達(dá)植株變小的同時過量表達(dá)植株變小的同時, , 我們還發(fā)現(xiàn)我們還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的葉片硬度比野生型的要大。已有的轉(zhuǎn)基因植株的葉片硬度比野生型的要大。已有的研究表明研究表明, , 漆酶基因可能與木質(zhì)素的合成有關(guān)漆酶基因可能與木質(zhì)素的合成有關(guān)。因此我們推測因此我們推測, AtLAC4, AtLAC4過量表達(dá)植株葉片變硬可過量表達(dá)植株葉片變硬可能與木質(zhì)素的含量增加有關(guān)。能與木質(zhì)素的含量增加有關(guān)。 木質(zhì)素是一種復(fù)雜的酚類聚合物主要存在于

24、植物木質(zhì)素是一種復(fù)雜的酚類聚合物主要存在于植物木質(zhì)組織中的次生壁上。在鹽酸存在的情況下木質(zhì)組織中的次生壁上。在鹽酸存在的情況下, , 木質(zhì)素可與間苯三酚聚合形成一種紫紅色化合物。木質(zhì)素可與間苯三酚聚合形成一種紫紅色化合物。染色愈深且染色細(xì)胞愈多說明木質(zhì)素含量越高染色愈深且染色細(xì)胞愈多說明木質(zhì)素含量越高. . 取取4040天的野生型和天的野生型和35S:AtLAC435S:AtLAC4擬南芥的花序軸靠擬南芥的花序軸靠近基部一節(jié)的相同部位近基部一節(jié)的相同部位, , 進行徒手切片進行徒手切片, , 然后以然后以鹽酸為介質(zhì)分別對其進行間苯三酚染色。鹽酸為介質(zhì)分別對其進行間苯三酚染色。 結(jié)果表明結(jié)果表明

25、, AtLAC4, AtLAC4過量表達(dá)植株木質(zhì)部中的木質(zhì)素含量明過量表達(dá)植株木質(zhì)部中的木質(zhì)素含量明顯比野生型的高顯比野生型的高( (圖圖3A, B, 3A, B, 方框所示方框所示), ), 并且其細(xì)胞的次并且其細(xì)胞的次生壁亦變厚生壁亦變厚( (圖圖3C, D)3C, D)。 AtLAC4AtLAC4的過量表達(dá)可以引起植株的過量表達(dá)可以引起植株出現(xiàn)變小、葉柄變短和葉片硬度增大的表型出現(xiàn)變小、葉柄變短和葉片硬度增大的表型, ,并且這些表并且這些表型的出現(xiàn)可能與木質(zhì)素含量的增加有關(guān)。型的出現(xiàn)可能與木質(zhì)素含量的增加有關(guān)。圖圖3 3 35S:AtLAC435S:AtLAC4植株中木質(zhì)植株中木質(zhì)素的相

26、對含素的相對含量增加量增加(A), (C) (A), (C) Col-0; Col-0; (B), (D) (B), (D) 35S:AtLAC435S:AtLAC4。Bar=50 mBar=50 m。2.4 非生物脅迫和激素對AtLAC4表達(dá)的影響 首先首先, ,我們對我們對AtLAC4AtLAC4基因的啟動子區(qū)域進行了生物基因的啟動子區(qū)域進行了生物信息學(xué)分析信息學(xué)分析, , 發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)域含有大量與植物發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)域含有大量與植物激素以及非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件。我們激素以及非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件。我們推測推測AtLAC4AtLAC4可能與激素及其它非生物脅迫相關(guān)可能與激素及

27、其它非生物脅迫相關(guān), , 并進一步考察了相關(guān)激素及非生物脅迫對并進一步考察了相關(guān)激素及非生物脅迫對AtLAC4AtLAC4表達(dá)的影響。表達(dá)的影響。 選取在選取在MSMS培養(yǎng)基上生長培養(yǎng)基上生長1414天的擬南芥幼苗天的擬南芥幼苗, , 經(jīng)經(jīng)GA3GA3、NAANAA、ABAABA、SASA、蔗糖、蔗糖(Suc)(Suc)、聚乙二醇、聚乙二醇(PEG)(PEG)和和CuSO4CuSO4等各種激素和非生物脅迫因素處理等各種激素和非生物脅迫因素處理3 3小時小時, ,利利用用RT-PCRRT-PCR檢測檢測AtLAC4AtLAC4基因的表達(dá)情況?；虻谋磉_(dá)情況。結(jié)果表明, 與對照相比, ABA和SA

28、能夠促進AtLAC4的表達(dá),而蔗糖、低溫和Cu2+則抑制其表達(dá)(圖4)。其中ABA對AtLAC4基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用最為明顯, ABA處理組AtLAC4的表達(dá)量與對照相比增加了3倍多(圖4B),表明AtLAC4基因可能在響應(yīng)ABA信號過程中起作用。圖圖4 外界因素與激素外界因素與激素對對AtLAC4表達(dá)的影響表達(dá)的影響(A) RT-PCR電泳檢測電泳檢測(4C(無菌水無菌水), CuSO4(5 molL1); (B)RT-PCR結(jié)果的量化結(jié)果的量化, 比值比值=目的帶吸光度峰值目的帶吸光度峰值/Actin吸光度峰值。吸光度峰值。CK: 對照對照(無菌水無菌水); GA: 赤霉赤霉(100molL

29、1); NAA: 萘萘乙酸乙酸(100 molL1); ABA: 脫落酸脫落酸(100 molL1); SA: 水楊酸水楊酸(1 mmolL1); Suc: 蔗蔗糖糖(30 mmolL1); PEG: 15%聚乙二醇聚乙二醇2.5 AtLAC4過表達(dá)植株對外源ABA敏感 已有的研究表明已有的研究表明, , 植物種子的正常萌發(fā)需要適當(dāng)植物種子的正常萌發(fā)需要適當(dāng)?shù)牡腁BAABA含量。當(dāng)內(nèi)源或者外界含量。當(dāng)內(nèi)源或者外界ABAABA含量過高時含量過高時, , 植植物種子的萌發(fā)過程就會延長或者受到抑制。通過物種子的萌發(fā)過程就會延長或者受到抑制。通過對啟動子的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)對啟動子的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)

30、, AtLAC4, AtLAC4啟動子啟動子中應(yīng)答中應(yīng)答ABAABA的順式作用元件最多。此外的順式作用元件最多。此外, , 通過通過RT-RT-PCRPCR檢測激素處理過的擬南芥檢測激素處理過的擬南芥, , 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)AtLAC4AtLAC4的表達(dá)的表達(dá)受受ABAABA的影響最明顯的影響最明顯( (圖圖4)4). . 為了進一步研究為了進一步研究AtLAC4AtLAC4基因在響應(yīng)基因在響應(yīng)ABAABA脅迫中的功脅迫中的功能能, , 我們將我們將ColCol與與35S:AtLAC435S:AtLAC4同時播種于含同時播種于含5 5 molL1 ABAmolL1 ABA的的MSMS培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上(

31、 (對照組種植于不對照組種植于不含含ABAABA的的MSMS培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上), ), 每天統(tǒng)計其萌發(fā)率。結(jié)果每天統(tǒng)計其萌發(fā)率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn), 35S:AtLAC4, 35S:AtLAC4種子的萌發(fā)受到種子的萌發(fā)受到ABAABA的明顯抑制。的明顯抑制。 在含有ABA的培養(yǎng)基上萌發(fā)4天后, 野生型種子的萌發(fā)率可達(dá)40%, 而AtLAC4過量表達(dá)植株種子的萌發(fā)率僅為8%(圖5B)。到萌發(fā)12天時, 雖然二者的萌發(fā)率已基本相近, 但是AtLAC4過量表達(dá)植株的胚根生長明顯受到抑制(圖5A)。以上結(jié)果表明, AtLAC4過量表達(dá)植株對外源ABA的敏感性增加, 進一步說明At-LAC4基因可能在植物響應(yīng)

32、ABA過程中起一定作用。2.6 AtLAC4過量表達(dá)植株耐旱能力增強 一般來說一般來說, , 對對ABAABA敏感的植物往往耐旱能力較強。敏感的植物往往耐旱能力較強。為了進一步研究為了進一步研究AtLAC4AtLAC4過量表達(dá)植株對過量表達(dá)植株對ABAABA敏感性敏感性的增加是否通過的增加是否通過ABAABA信號途徑增強了植物的耐旱能信號途徑增強了植物的耐旱能力力, , 我們分析了我們分析了AtLAC4AtLAC4過量表達(dá)植株在干旱條件過量表達(dá)植株在干旱條件下與野生型植株的差異下與野生型植株的差異. . 結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), ,生長生長2020天的植株經(jīng)過干旱處理天的植株經(jīng)過干旱處理1010天后

33、天后, , AtLAC4AtLAC4過量表達(dá)植株的表型與野生型相比差別更過量表達(dá)植株的表型與野生型相比差別更加明顯加明顯, , 過量表達(dá)植株的蓮座葉明顯變小過量表達(dá)植株的蓮座葉明顯變小, , 葉柄葉柄變短變短( (圖圖6A, B), 6A, B), 可能是因為干旱脅迫誘導(dǎo)可能是因為干旱脅迫誘導(dǎo)ABAABA合合成后成后, ABA, ABA進一步上調(diào)了進一步上調(diào)了AtLAC4AtLAC4基因的表達(dá)量基因的表達(dá)量, , 從從而引起木質(zhì)素的含量增加而引起木質(zhì)素的含量增加, ,導(dǎo)致過量表達(dá)植株的表導(dǎo)致過量表達(dá)植株的表型更加明顯型更加明顯。 當(dāng)干旱脅迫處理當(dāng)干旱脅迫處理第第2020天時天時, , 相同生長

34、時期的野生相同生長時期的野生型擬南芥基本上已經(jīng)全部萎蔫型擬南芥基本上已經(jīng)全部萎蔫, , 而而AtLAC4AtLAC4過量表過量表達(dá)植株仍然能夠正常生長達(dá)植株仍然能夠正常生長( (圖圖6C), 6C), 表明表明AtLAC4AtLAC4過過量表達(dá)植株的耐旱能力比野生型明顯增強。量表達(dá)植株的耐旱能力比野生型明顯增強。圖圖6 AtLAC4過量表達(dá)植株過量表達(dá)植株耐旱能力增強耐旱能力增強(A) 生長生長30天天的幼苗的幼苗; (B) 經(jīng)經(jīng)干旱處理干旱處理10天天的的30天齡幼苗天齡幼苗; (C)經(jīng)干旱處理經(jīng)干旱處理20天的天的40天齡植天齡植株株3 討論3.1 AtLAC4參與植物木質(zhì)素的合成 植物的

35、維管組織起源于原形成層細(xì)胞植物的維管組織起源于原形成層細(xì)胞, , 這些細(xì)胞來源于植這些細(xì)胞來源于植物的頂端分生組織。木質(zhì)素是維管組織細(xì)胞次生壁的重要物的頂端分生組織。木質(zhì)素是維管組織細(xì)胞次生壁的重要組分組分, , 主要存在于次生細(xì)胞壁中主要存在于次生細(xì)胞壁中, , 影響維管的厚度和硬度。影響維管的厚度和硬度。 木質(zhì)素含量越高木質(zhì)素含量越高, , 細(xì)胞的次生壁也越厚細(xì)胞的次生壁也越厚, , 其含量的高低對其含量的高低對植物維管系統(tǒng)的發(fā)育起重要決定作用。植物維管系統(tǒng)的發(fā)育起重要決定作用。 AtLAC4AtLAC4基因在莖、葉柄、根以及胚軸維管組織中的表達(dá)非基因在莖、葉柄、根以及胚軸維管組織中的表達(dá)

36、非常明顯常明顯, , 并且在莖尖頂端分生組織處有非常強烈的表達(dá)并且在莖尖頂端分生組織處有非常強烈的表達(dá), , 這些表達(dá)部位與維管組織的起始和發(fā)育部位十分一致這些表達(dá)部位與維管組織的起始和發(fā)育部位十分一致, ,表表明明AtLAC4AtLAC4可能在維管系統(tǒng)的發(fā)育過程中起重要作用。在我可能在維管系統(tǒng)的發(fā)育過程中起重要作用。在我們的研究中們的研究中, ,采用間苯三酚對花序軸橫切面進行染色采用間苯三酚對花序軸橫切面進行染色, , 發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn) At-LAC4 At-LAC4過量表達(dá)植株的木質(zhì)化細(xì)胞與野生型相比明顯過量表達(dá)植株的木質(zhì)化細(xì)胞與野生型相比明顯增多增多, , 木質(zhì)素含量明顯升高且次生壁明顯加厚木質(zhì)

37、素含量明顯升高且次生壁明顯加厚. .以上研究以上研究結(jié)果表明結(jié)果表明, AtLAC4, AtLAC4在調(diào)控木質(zhì)素的合成過在調(diào)控木質(zhì)素的合成過程中確實起著重程中確實起著重要作用要作用3.2 AtLAC4與外源激素及非生物脅迫的關(guān)系 對漆酶家族啟動子順式作用元件的生物信息學(xué)分對漆酶家族啟動子順式作用元件的生物信息學(xué)分析表明析表明, AtLAC4, AtLAC4的啟動子中的啟動子中ABAABA應(yīng)答元件的數(shù)目最應(yīng)答元件的數(shù)目最多。我們通過多。我們通過RT-PCRRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)檢測發(fā)現(xiàn), ABA, ABA能使能使AtLAC4AtLAC4表表達(dá)明顯增強達(dá)明顯增強( (圖圖4)4)。因此。因此, , 我們研究了我們研究了ABAABA對對AtLAC4AtLAC4轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)的影響轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)的影響, , 結(jié)果表明結(jié)果表明, , AtLAC4AtLAC4過量表達(dá)植株種子的萌發(fā)受到明顯抑制且過量表達(dá)植株種子的萌發(fā)受到明顯抑制且對對ABAABA的敏感性增強的敏感性增強(