1、山 地 農(nóng) 業(yè) 生 物 學(xué) 報2 7 ( 3 ) : 2 4 1 2 4 6 , 2 0 0 8Jou rna lof Moun ta inA gricu ltu reandB io logy紅曲霉產(chǎn)麥角固醇液體培養(yǎng)基篩選 3寧瑋霽 1 ,譚艾娟 1 33 ,劉愛英 1 ,呂世明 23( 1. 貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 , 貴州 貴陽550025; 2. 貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院 , 貴州 貴陽550025 )摘 要 : 對紅曲霉 M onascus菌株 - ZZ產(chǎn)麥角固醇的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行單因子篩選試驗 ,結(jié)果表明 ,最佳碳源是 310g / dL 乳糖 ,最佳氮源是 210 g / dL 牛

2、肉膏 ,最佳無機鹽為 1100 g / dL 硫酸鎂 ; 對碳源 、氮源和無機鹽進(jìn)行正交 優(yōu)化試驗 ,結(jié)果顯示 ,不同因子對麥角固醇含量的影響為 :牛肉膏 乳糖 硫酸鎂 ;最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為 :315 g / dL 乳糖 、210g / dL 牛 肉 膏 、 0175 g / dL M gSO4 ; 優(yōu) 化 后 菌 體 中 麥 角 固 醇 的 含 量 從 61514g / g 提 高 到1 12711g / g,是原有含量的 183 % ;菌體中麥角固醇含量達(dá)細(xì)胞干重的 1113% 。關(guān)鍵詞 : 紅曲霉 ;麥角固醇 ;培養(yǎng)基篩選 ;正交優(yōu)化 ;液體發(fā)酵中圖分類號 : TQ92517; Q

3、93 - 335文章編號 : 1008 - 0457 ( 2008) 03 - 0241 - 06文獻(xiàn)標(biāo)識碼 : AScreen in g the m ed ium in gred ien ts of M on a scu s sp. ZZ ferm en ted ergo stero l3N I N G W e i2ji1 , TAN A i2ju an133 , L I U A i2y ing1 , LU S h i2m ing2 ( 1. In stitu te of L ife S c iences, Gu izhou U n ive rs ity, Gu iy an g, Gu iz

4、h ou 550025, C h in a; 2. In s titu te of A n im a l S c ien ces, Gu izh ou U n ive rs ity, Gu iy a ng, Gu izh ou 550025,C h in a)A b stra c t: The m ed ium ingred ien ts of fe rm en ting e rgo ste ro l by M onascus sp. ZZ we re sc reened by single2fac to r te st. The re su lts we re de te rm ined t

5、ha t the op tim um ca rbon sou rce wa s lac to se 310 g / dL , the op tim um n itrogen sou rce wa s the beef extrac t 210 g / dL , the op tim um m ine ra l sa lt wa s M g SO4 1100 g / dL. The op tim um b ro th of fe rm en ting e rgo ste ro l of M onas2 cus sp. ZZ wa s op tim ized by o rthogona l te

6、st. The re su lt of o rthogona l te st showed tha t the con tribu tion of fac to rs to fe rm en t e rgo ste ro l we re the beef extrac t lac to se M g SO4 , and the op tim um b ro th wa s compo sed of the lac to se 315g / dL , the beef extrac t 210 g / dL , M g SO4 0175 g / dL. The e rgo ste ro l co

7、ncen tra tion in the b iom a ss of M onascus sp. ZZ wa s ra ised from61514g / g to 1 127. 1g / g, the con ten t of e rgo ste ro l wa s 1. 13% d ry we igh t of the b iom a ss.Key word s: M onascus; e rgo ste ro l; sc reen ing of m ed ium; o rthogona l te st; liqu id fe rm en ta tion麥角固醇 ( C2 8 H4 3 O

8、 H ) 又名麥角甾醇 ,化學(xué)名 稱 為 2 4 - 甲 基 膽 固 醇 - 5 , 7 烯 - 3 - 羥 基 , 是 脂溶性維生素 D2 的前體 ,當(dāng)受到紫外 線 照 射 時 可 轉(zhuǎn) 化 為 維 生 素 D2 ; 麥 角 甾 醇 是 一 種 重 要 的 醫(yī) 藥 化 工原料 ,可用于“可的松 ”、“黃體酮 ”等藥物的生 產(chǎn) 1 。目 前 國 外 主 要 采 用 微 生 物 發(fā) 酵 法 生 產(chǎn) , 所 用 菌 種有酵母菌 、曲霉和青霉 ,其產(chǎn)量可分別達(dá)到細(xì)胞干重的 2 17 % 、2 10 % 和 1 18 %左右 2 - 3 。國內(nèi)對于 酵母產(chǎn)麥角 固 醇 的 研 究 始 于 上 個 世 紀(jì)

9、 5 0 年 代 。朱 效 剛 等 4 利 用 固 態(tài) 發(fā) 酵 紅 曲 霉 SJ S - 2 0 產(chǎn) 得0 18 %左右的麥角固醇 ; 陳松生等 5 以液體發(fā)酵 M on a scu s pu rpu reu s 7 2 1 得到 1 %左 右的 麥角 固 醇 , 且 液體發(fā)酵較固體發(fā)酵而言周期較短 。筆者 經(jīng)過 前期 試 驗篩 選得 到麥 角固 醇 高產(chǎn) 菌株 M on ascus sp. ZZ, 液 體 發(fā)酵 條件 優(yōu)化 得 到接 種量10 % ;在此基礎(chǔ)上 ,本研究考察了不同碳源 、氮源 、無機鹽對紅曲霉菌株中麥角固醇含量的影響 ,并進(jìn)行 了三因素三水平的正交優(yōu)化試驗 ,現(xiàn)將結(jié)果報告如下

10、 :收稿日期 : 2008 - 03 - 27;修回日期 : 2008 - 04 - 18基金項目 : 貴州省科技廳資助項目 黔科合 GY字 ( 2005 ) 3027 作者簡介 : 寧瑋霽 ( 1983 - ) ,女 ,貴州貴陽人 ,在讀碩士研究生 ,從事天然活性產(chǎn)物研究 。33 通訊作者 : E2m a il a jtan gzu. edu. cn1材料與方法1 11 材料1 11111 1112菌種紅曲霉 M onascus sp. ZZ,采自福建漳州 ,保存于貴州大學(xué)真菌研究所 。培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基為 PDA;液體種子培養(yǎng)基為 PSA;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖 215 g / dL、蛋白胨

11、115 g / dL , pH 值自然 。1 1113 主要藥品堿性鉀醇用 300 g /L KOH 和 40 %乙醇按體積比 VKOH V乙醇 = 2 1 配制 ;麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品由 Sigm a公司生產(chǎn) 。1 1114 主要儀器紫外分光光度計為北京普析通用儀器 TU - 1901雙光束紫外可見分光光度計 。1 12 方法1 1211 菌種準(zhǔn)備1 121111 菌種活化方法將接種好的斜面培養(yǎng)基置于 30 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 57 d。1 121112 液體 種 子 培 養(yǎng) 方 法將 培 養(yǎng) 好 的 斜 面 孢 子 用 Tw een 80 輕 輕 洗 下 , 無 菌 水 調(diào) 整 濃 度 至106個

12、mL- 1 , 250mL 三角 瓶 裝 PDA 50mL , 按 10 % 接 種 量 接 入 孢 子 液 , 30 , 200 r /m in 振 蕩 培 養(yǎng) 48 50 h。1 121113 基礎(chǔ)發(fā)酵方法250mL 三角瓶裝基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 50mL ,將液體種子按 10 %接種量接入培養(yǎng)基中 , 30 , 200 r /m in培養(yǎng) 5 d,設(shè) 3個平行試驗 ,測麥角固醇含量 ,取平均值 。1 1212 麥角固醇提取 參照文獻(xiàn) 6 方法改進(jìn) 。1 121211 麥角固醇提取 皂化 萃取法 將全部發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)入離心管內(nèi) , 4 000 r /m in 離心至發(fā)酵液 澄清 ,取沉淀物于烘箱中

13、40 烘干 3 5 h,稱取一定重量 (約 50m g左右 )加入堿性鉀醇 20mL , 85 90 水 浴皂化 215 h,冷卻至室溫 。加入 20mL 乙醚 ,劇烈振蕩 15m in,靜置 215 h,取乙醚層 ,加入 95 %乙醇定容至50mL , 28115 nm 測吸光度 ,按公式計算 : 麥角固醇 % = ( C V N ) /W 100 % 。1 121212 麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 稱取麥角固醇 2124m g,用 95 %乙醇定容至 200mL 成為母液 ,配制一 系列濃度梯度溶液 。用 201000 0g /mL 標(biāo)準(zhǔn)樣品在 250 400 nm 進(jìn)行光譜掃描 ,以確定最大吸

14、收值 。在最 大吸收值處測定各管吸光度 ,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 。1 1213 碳源篩選1 121311 不同碳源對麥角固醇含量的影響將果糖 、乳糖 、大米粉 、蔗糖分別以 215 g / dL 濃度取代基礎(chǔ) 發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖進(jìn)行單因子篩選試驗 ,每種碳源設(shè) 3個平行試驗 ,取平均值 。1 121312 不同碳源濃度對麥角固醇含量的影響 將 115 g / dL、210 g / dL、215 g / dL、310 g / dL、315 g / dL 最佳碳源分別取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖進(jìn)行濃度篩選試驗 ,每個濃度設(shè) 3個平行試驗 ,取平均值 。1 1214 氮源篩選1 121411 不同氮源對麥角

15、固醇含量的影響將牛肉膏 、酵母膏 、NH4 NO3 、(NH4 ) 2 SO4 分別以 115 g / dL 濃 度分別取代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨進(jìn)行單因子篩選試驗 ,每種氮源設(shè) 3個平行試驗 ,取平均值 。1 121412 不同氮源濃度對麥角固醇含量的影響 將 110 g / dL、115 g / dL、210 g / dL、215 g / dL、310 g / dL 最佳氮源分別取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨進(jìn)行濃度篩選試驗 ,每個濃度設(shè) 3個平行試驗 ,取平均值 。1 1215 無機鹽篩選1 121511 不同無機鹽對麥角固醇含量的影響將 K2 H PO4 、KH2 POM4 、N aH2

16、PO4 、CaC l2 、M gSO4 、FeSO4分 別按 110 g / dL 添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行無機鹽試驗 ,每種無機鹽設(shè) 3個平行試驗 ,取平均值 。1 121512 不同無機鹽濃度對麥角固醇含量的影響 將 015g / dL、0175g / dL、110g / dL、1125g / dL、115g / dL 最佳無機鹽分別添加到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行無機鹽濃度影響試驗 ,每個濃度設(shè) 3個平行試驗 ,取平均值 。第 3 期寧瑋霽 ,等 :紅曲霉產(chǎn)麥角固醇液體培養(yǎng)基篩選2431 1216 正交試驗每組設(shè) 3個平行試驗 ,取平均值 。將篩選出來的碳源 、氮源 、無機鹽進(jìn)行正交優(yōu)化試驗 ,

17、按三因素三水平設(shè)計正交試驗 ,用比較極差的方法進(jìn)行最佳培養(yǎng)基配方的篩選 ,并對試驗結(jié)果進(jìn)行穩(wěn) 定性試驗 (見表 1 ) 。3表 1 L9 ( 3 )正交設(shè)計因素水平3Ta b11L9 ( 3 ) le ve l o f o rtho go n a l de s ig n fa c to r水 平碳 源氮 源無 機 鹽123最佳碳源 215 g / dL最佳碳源 310 g / dL最佳碳源 315 g / dL最佳氮源 115 g / dL最佳氮源 210 g / dL最佳氮源 215 g / dL最佳無機鹽 0175 g / dL最佳無機鹽 1100 g / dL最佳無機鹽 1125 g /

18、 dL2結(jié)果與分析2 11 麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線2 1111 麥角固醇光譜掃描結(jié)果光譜掃描的結(jié)果中 ,麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品呈現(xiàn)3 個吸收峰 , 2 個較小的吸收峰中間有一個最大 吸 收峰 , 其 中最 大吸 收峰 為 28115 nm , 符 合麥 角固 醇最 大理 論 吸收 值的 范圍 280 282 nm。所以試驗在 28115 nm 波長下測定麥角固醇的含量 。2 1112 麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線配制不同濃度的 10 個標(biāo)準(zhǔn)樣品 ,在 28115 nm 下測定吸收值 ,作麥角固醇標(biāo) 準(zhǔn)曲線 ,結(jié)果見圖 2。在圖 2 的標(biāo)準(zhǔn)曲線中 , 回歸方程 : 吸光度 = 01025 7 C + 01013 5 ,

19、相 關(guān)系 數(shù) : R2 =01999 7。方程表明 ,麥角固醇在 121210918g /mL 范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系 ?？梢杂脕頇z測樣品中的麥角固醇含量 。2 1113 基礎(chǔ)發(fā)酵菌體中麥角固醇的含量為 61514g / g。2 12 不同碳源對麥角固醇含量的影響從表 2可見 ,當(dāng)乳糖為碳源時 ,麥角固醇含量最高 ,菌體含 92411g / g麥角固醇 ,因此在上述 5種碳源 中乳糖為最佳碳源 。2 13 不同濃度乳糖對麥角固醇含量的影響從表 3可見 ,隨乳糖濃度升高 ,麥角固醇的含量逐漸升高 。當(dāng)乳糖為 310 g / dL 時 ,菌體中所含的麥角 固醇達(dá)到最大值 ( 1 0241

20、1g / g) ,之后有降低趨勢 ,這和菌體中麥角固醇富集產(chǎn)生對合成過程中 HM G - CoA 還原酶的抑制有關(guān) ,也和菌體中和乳糖分解代謝相關(guān)的酶趨于飽和不再結(jié)合底物有關(guān) 。表 2 不同碳源對麥角固醇含量的影響表 3 不同濃度乳糖對麥角固醇含量的影響Ta b13 E ffe c t o f la c to se co n c e n tra tio n o n the co n te n t o f e rgo s te ro lTa b12E ffe c t o f ca rbo n so u rc e s o n theco n te n t o f e rgo s te ro l麥角

21、固醇含量 (g / g)乳糖濃度 ( g / dL )生物量 ( g)麥角固醇含量 (g / g)碳 源生物量 ( g)1152102153107971690818922141 024110110011601180122大米粉417148011758514924116101901990139019801170144果蔗乳糖糖糖葡萄糖 315 1 01411 0114 2 14 不同氮源對麥角固醇含量的影響從表 4可見 ,不同氮源對菌體中麥角固醇的含量影響更為明顯 。在 5種氮源中 ,牛肉膏最有利于菌體 產(chǎn)生麥角固醇 ,菌體中麥角固醇可達(dá) 1 12818g / g,因此 ,牛肉膏為最佳氮源 。2

22、 15 不同濃度牛肉膏對麥角固醇含量的影響從表 5可見 ,隨著牛肉膏濃度的增加 ,菌體中麥角固醇的含量隨之增高 。當(dāng)牛肉膏濃度為 210 g / dL時 ,達(dá)到高峰值 ( 1 35111g / g) ,以后 ,麥角固醇的含量隨之降低 。這與麥角固醇的產(chǎn)物抑制有關(guān) ,因此 ,210 g / dL牛肉膏有利于麥角固醇的產(chǎn)生 。表 4 不同氮源對麥角固醇含量的影響表 5 不同濃度牛肉膏對麥角固醇含量的影響Ta b15 E ffe c t o f b e e f e x tra c t co nc e n tra tio n o n the co n te n t o f e rgo s te ro

23、lTa b14E ffe c t o f n itro g e n so u rce s o n theco n te n t o f e rgo s te ro l麥角固醇含量 (g / g)牛肉膏濃度 ( g / dL )生物量 ( g)氮 源麥角固醇含量 (g / g)生物量 ( g)1101152102151 071191 123101 351111 109140132014801550142酵母膏牛肉膏 蛋白胨N aNO3739141 1281861115362170199014701421175 310 97019 0131 (NH4 ) 2 SO 4 94218 0158 2 1

24、6 不同無機鹽對麥角固醇含量的影響從表 6可見 , 6種無機鹽中 ,能釋放出 H + 的無機鹽都有利于菌體生物量的增加 ,這和紅曲霉是一種嗜酸2 +性真菌有關(guān) 。試驗中的無機鹽均有利于麥角固醇的產(chǎn)生 ,其中 M gSO4 效果最好 。這與 M g 是大多數(shù)還原酶的輔酶 ,因而能增強麥角固醇合成代謝中的多種還原酶活性有關(guān) 。因此 ,選擇 M gSO4 為最佳無機鹽 。2 17 不同濃度 M gSO 4 對麥角固醇含量的影響從表 7可見 ,隨著 M gSO4 濃度的增加 ,麥角固醇的含量和菌體生物量也不斷增加 。在 M gSO4 濃度為1100 g / dL 時達(dá)到最大值 ( 95719g / g

25、) ,之后 ,麥角固醇含量呈現(xiàn)下降趨勢 。因此 , 1100 g / dL M gSO4有利于 麥角固醇的產(chǎn)生 。單因子篩選試驗結(jié)果表明 ,最佳碳源為乳糖 、最佳氮源為牛肉膏 、最佳無機鹽為 M gSO4 。表 7 不同濃度 M g SO 4 對麥角固醇含量的影響Ta b17 E ffe c t o f M gSO 4 co nc e n tra tio n o n the co n te n t o f e rgo s te ro l表 6Ta b16不同無機鹽對麥角固醇含量的影響E ffe c t o f d iffe re n t ino rga n ic sa lt o n the c

26、o n te n t o f e rgo s te ro l無 機 鹽麥角固醇含量 (g / g)生物量 ( g)M gSO4 濃度 ( g / dL )麥角固醇含量 (g / g)生物量 ( g)K2 H PO4KH2 PO4N aH2 PO4CaC l2M gSO4FeSO48151678614864128301195714813141105110011210138015501980150017511001125761148651895719849140142014601500165 1150 76113 0121 第 3 期寧瑋霽 ,等 :紅曲霉產(chǎn)麥角固醇液體培養(yǎng)基篩選2452 18 正

27、交試驗從表 8的正交試驗極差分析結(jié)果可見 ,牛肉膏對麥角固醇含量產(chǎn)生的影響最大 ,其次是乳糖 , M gSO4對麥角固醇產(chǎn)生影響最小 ;經(jīng)方差檢驗發(fā)現(xiàn) ,各個因素對麥角固醇在菌體中含量的影響顯著 ,其主次為 :牛 肉膏 乳糖 M gSO4 ; 2種數(shù)據(jù)檢驗得到的結(jié)果一致 。因此 ,優(yōu)化后培養(yǎng)基配方為 : 315 g / dL 乳糖 、210 g / dL 牛肉膏 、0175 g / dL M gSO4 ,自然 pH 值 。表 8 正交試驗結(jié)果及極差分析Ta b18O rtho go na l te s t re su lts a nd ra ng e a na ly s is麥 角 固 醇 含

28、 量 (g / g)試 驗 號碳 源氮 源無 機 鹽123456789 R SS M SF1112223332 265182 902162 867186361885 446120742 72311036113431231231232 370153 283152 382119121985 233157242 61617866121932132313122 877192 693142 464184131135 439104517 7191523611033655199701363916924121 0341894316790141 2781479819用優(yōu)化后培養(yǎng)基配方進(jìn)行 3次重復(fù)試驗 ,得到較

29、為穩(wěn)定的結(jié)果 (見表 9 ) 。表 9 正交穩(wěn)定性試驗討論3Ta b19 O rtho go na l s ta b ility te s t試驗號麥角固醇含量 (g / g)生物量 ( g)3 11 因為有機氮源不僅僅提供培養(yǎng)基中氮元素 ,其氨基酸碳 骨 架 也 能 以 乙 酰 Co - A、 - 酮 戊 二 酸 、琥珀酰 Co - A 等形式進(jìn)入碳素循環(huán) , 所以 , 有 機氮源同時可以提供碳素和氮素 ,因此在液體發(fā)酵123平均值1 125131 184141 071181 127110181018001790180培養(yǎng)基中添加氮源能促使菌體進(jìn)一步生長 。經(jīng)過單因子篩選和正交試驗 ,發(fā)現(xiàn)不

30、同氮源對菌體中麥角固醇的含量影響最大 ,說明氮源在菌體生長發(fā)育和麥角固醇合成代謝中有著重要作用 。3 12 通過培養(yǎng)基的優(yōu)化使得菌株 - ZZ的生物量從優(yōu)化前的 014 g提高到 018 g;麥角固醇的含量從優(yōu)化前 的 61514g / g提高到 1 12711g / g,是原有含量的 183 % ; 菌體中麥角固醇含量達(dá)細(xì)胞干重的 11127 % , 符 合課題“新型三高一低 優(yōu)質(zhì)紅曲產(chǎn)品研發(fā) ”(即高莫納可林 、高麥角固醇 、高色價和低橘霉素 )的要求 , 具有較好的市場應(yīng)用前景 。3 13 有研究表明 ,麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組分 ,其在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性 、與膜結(jié)合酶的活性 、膜

31、的流動性 、細(xì)胞活力及物質(zhì)運輸?shù)确矫嫫鹬匾饔?7 。一旦麥角甾醇缺乏 ,必將引起真菌細(xì)胞膜功能異常 ,甚至發(fā)生細(xì)胞破裂 8 - 9 。真菌中甾醇必須保持一定水平才能起到生理作用 ,細(xì)胞中過量甾醇在甾醇 ?；D(zhuǎn)移酶作用下酯化為甾醇酯儲存在胞液內(nèi) ,也就是說 ,甾醇?；D(zhuǎn)移酶的活性關(guān)系到菌體細(xì)胞中麥角 固醇含量的提高 。何秀萍等 10 通過克隆甾醇?；D(zhuǎn)移酶基因并構(gòu)建質(zhì)粒 ,質(zhì)粒中的基因在菌體中得到了表達(dá) ,使細(xì)胞內(nèi)甾醇酯化水平升高 ,致使細(xì)胞麥角固醇含量的提高 。這為今后的紅曲霉菌株 - ZZ的研究 方向有一定的提示作用 。參考文獻(xiàn) : 1 鄧玉清 ,王 紀(jì) , 虞 龍. 微生物麥角甾醇的研

32、究進(jìn)展 J . 微生物學(xué)雜志 , 2001, 21 ( 3) : 45 - 47. 2 楊 婉 ,梁如玉. 麥角固醇高產(chǎn)酵母菌的快速篩選方法 J . 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 , 1997, 15 ( 3) : 304 - 306. 3 許旭萍 ,李慧珍 ,余晨興 ,等. 麥角固醇產(chǎn)生菌 Toru llopsis fam a ta 優(yōu)化發(fā)酵條件的研究 J . 生物學(xué)雜志 , 2002 , 18 ( 2 ) :15 - 17. 4 朱效剛 ,許贛榮 ,李穎茵 ,等. 紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)麥角甾醇工藝條件的優(yōu)化 J . 食品研究與開發(fā) , 2005 , 26 ( 2 ) : 72 - 75. 5 陳松生 ,毛

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