1、第七章 免疫診斷與防治 王 慧 第一節(jié) 免疫診斷免疫學技術是當今生命科學實驗研究的重要手段之一，臨床上免疫學檢測技術被廣泛用于與免疫相關疾病的診斷、發(fā)病機制研究、免疫狀態(tài)監(jiān)測及療效評估。 一、抗原與抗體的檢測(一)抗原抗體反應的原理和特點1、特異性 2、可見性 3、可逆性 (二)抗原與抗體的檢測方法1、凝集反應 (1)直接凝集反應 不溶性顆粒Ag + Ab 電解質(zhì) 凝集成團塊 （凝集原） 凝集素）(2)間接凝集反應 2、沉淀反應 (1)單向瓊脂擴散 (2)雙向瓊脂擴散 (3)免疫電泳 (4)免疫比濁 單向免疫擴散半固體凝膠（摻入Ab）孔中加入Ag抗原擴散到孔外，與凝膠中抗體相互作用，起初形成可

2、溶性復合物，當抗原擴散達到與抗體等量時，產(chǎn)生晶格和沉淀。沉淀環(huán)直徑與抗原濃度相關，可用標準曲線定量抗原。在此基礎上，引入電場使Ag由負極向正極擴散，形成錐形沉淀峰，即為火箭電泳。雙向免疫擴散在雙擴基礎上加電泳，Ag孔置負極端，Ab孔置正極端，Ag帶負電荷多于Ab，向正極泳動，Ab由正極向負極泳動，形成對流，比例適宜處形成沉淀線，為對流電泳。免疫標記技術1.免疫熒光法（immunofluorescence，IF）2.酶免疫測定（enzyme immunoassay，EIA）3.放射免疫測定法（radio immunoassay，RIA）4.化學發(fā)光免疫分析 （chemiluminescence

3、immunoassay，CLIA） 5 免疫印跡法 （immunoblotting, Western blot)(1)免疫熒光法 ：直接法間接法 抗核抗體(FITC-IgG）)抗原抗體反應特異性酶催化反應高效性(2)酶免疫測定 酶聯(lián)免疫吸附試驗 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)免疫組織化學技術 (immunohistochemistry technique) 定性、定量和定位AgELISA雙抗體夾心法(測Ag) 間接法(測Ab)加Ab,清洗加Ag形成復合物，洗滌加該Ag的另一Ab（酶標），洗滌加底物，讀數(shù)加Ag，清洗加Ab形成復合物，洗滌加酶

4、標二抗加底物，讀數(shù)聚苯乙烯微量反應板免疫印跡法二、免疫細胞及其功能檢測(一)免疫細胞的類型與數(shù)量檢測1、E花結試驗 2、尼龍棉分離法 3、免疫磁珠分離法4、流式細胞術 (二)免疫細胞功能測定1、T細胞功能測定 (1)T細胞增殖試驗 (2)細胞毒試驗 (3)皮膚試驗 2、B細胞功能測定(1)B細胞增殖試驗 (2)抗體形成細胞測定 3、細胞因子檢測 外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要指淋巴細胞和單核細胞，是免疫學實驗中最常用的細胞群，也是進行T細胞和B細胞分離純化的重要環(huán)節(jié)。外周血單個核細胞的分離分離液1.0

5、70g/l1.0770.002g/l1.092g/l血液中PBMC的密度與其他成分不同：血小板的密度為1.0301.035，粒細胞為1.092，紅細胞為1.093，淋巴細胞和單核細胞的密度為1.0751.090。利用一種密度介于1.0751.092之間、近于等滲的溶液(分層液)進行密度梯度離心，可使不同類別的血細胞按其相應密度分布，從而被分離。常用的分層液有聚蔗糖-泛影葡胺分層液法和Ficol分層液法兩種。單核細胞的獲得1粘附法 單核細胞和粒細胞具有粘附玻璃、塑料和葡聚糖凝膠的特性，通過PBMC與玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的粘附細胞即為淋巴細胞。2羰基鐵粉吞噬法 單核細胞具有吞噬羰基鐵粉的

6、能力，吞噬羰基鐵粉后的單核細胞密度增大，再經(jīng)聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心后，則單核細胞沉積于管底而被去除。也可在單核細胞懸液內(nèi)加入羰基鐵粉顆粒，待單核細胞充分吞噬羰基鐵粉后，用磁鐵將細胞吸至管底，上層液中即含較純的淋巴細胞。淋巴細胞亞群的分離淋巴細胞是復雜的不均一的細胞群體，它包括了許多形態(tài)相似而表面標志和功能各異的細胞群和亞群。根據(jù)細胞的表面標志和功能等不同，借助多種方法分離淋巴細胞亞群。E花結實驗T細胞表面CD2分子+綿羊血紅細胞玫瑰花結尼龍棉柱分離法將淋巴細胞懸液加入尼龍棉柱內(nèi)，B細胞易粘附于尼龍棉纖維(聚酰胺纖維)表面，而T細胞則不易粘附，由此可將T細胞與B細胞分離。 該法簡便易

7、行，不需特殊儀器，淋巴細胞活性不受影響，所獲T細胞純度可達90%以上，B細胞純度可達80%。 免疫磁珠分離法包括直接法和間接法。直接法是將特異性抗體與磁性微粒(平均直徑小于1.5m)交聯(lián)，形成免疫磁珠(IMB)。IMB與表達相應膜抗原的細胞結合，用強磁場分離磁珠結合細胞與磁珠非結合細胞，從而對特定細胞進行陽性或陰性分選。間接法是用羊(或兔)抗鼠IgG抗體(第二抗體)包被磁性微珠，可與任何已結合鼠源性單克隆抗體(第一抗體)的細胞發(fā)生反應，從而對細胞進行分離。 磁分離技術原理：流式細胞術(Flow Cytometry, FCM) 是七十年代發(fā)展起來的高科學技術,它集計算機技術、激光技術、流體力學、

8、細胞化學、細胞免疫學于一體, 同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內(nèi)DNA、RNA含量等,在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應用。 流式細胞儀實驗方法細胞分選 細胞凋亡研究 血液學應用：包括DNA倍體分析及細胞周期分析，淋巴細胞亞群測定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，紅細胞疾病診斷，血小板功能分析和血小板病診斷，微小殘留白血病檢測，白細胞吞噬功能測定，NK和LAK細胞活性測定，造血干/祖細胞測定等 胞內(nèi)細胞因子的檢測：淋巴細胞的功能檢測T細胞功能檢測 B細胞功能檢測 NK細胞活性測定1、T細胞功能檢測 T細胞

9、增殖試驗 細胞毒試驗 皮膚試驗（一）T細胞增殖試驗T細胞在體外受到有絲分裂原或抗原的刺激后，細胞的代謝和形態(tài)發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，發(fā)生一系列增殖反應，如細胞變大、胞質(zhì)增多、胞質(zhì)現(xiàn)空泡、核染色質(zhì)疏松、核仁明顯，并轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞。淋巴細胞增殖反應又稱淋巴細胞母細胞轉(zhuǎn)化。常用刺激物體外刺激T細胞增殖反應的刺激物包括植物血凝素 (PHA)刀豆素A(ConA)美洲商陸(PWM)白喉類毒素破傷風類毒素純化蛋白衍生物(PPD)白色念珠菌檢測T細胞增殖反應 1形態(tài)學檢查法 23H-TdR摻入法3MTT比色法 1形態(tài)學檢查法分離PBMC，與適量PHA混合，置37培養(yǎng)72h。取培養(yǎng)細胞作

10、涂片染色，借助光學顯微鏡進行檢測。根據(jù)細胞的大小、核與胞質(zhì)的比例、胞質(zhì)的染色性以及有無核仁等特征(見圖24-6)，分別計數(shù)未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞和轉(zhuǎn)化的淋巴細胞，每份標本計數(shù)200個細胞，按公式計算淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率在一定程度上可反映細胞免疫功能，正常人的T細胞轉(zhuǎn)化率為60%80%，小于50%可視為降低。形態(tài)學方法簡便易行，普通光學顯微鏡便能觀察結果，適于基層實驗室應用。缺點是依靠肉眼觀察形態(tài)學變化，判斷結果易受主觀因素影響，重復性和準確性較差。2、B細胞功能檢測B細胞增殖試驗 溶血空斑試驗（抗體形成細胞測定）酶聯(lián)免疫斑點法 3、NK細胞活性測定NK細胞表面至少存在CD2、CD11b、CD11c

11、、CD16、CD56和CD59等多種抗原，但均非NK細胞所特有，現(xiàn)今極少以CD系列抗原為指標鑒定和計數(shù)NK細胞，而多檢測NK細胞活性。NK細胞具有細胞介導的細胞毒作用，能直接殺傷靶細胞。測定人NK細胞活性多以K562細胞株作為靶細胞，而測定小鼠NK細胞活性常采用YAC-1細胞株作為靶細胞。4、吞噬細胞功能檢測吞噬細胞的吞噬運動大致分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺傷作用三個階段，可分別對這三個階段進行功能檢測。NBT還原試驗中性粒細胞在吞噬殺菌過程中，能量消耗劇增，耗氧量也隨之增相應增加，磷酸己糖旁路的代謝活性增強，6-磷酸葡萄糖脫氫酶使葡萄糖的中間代謝產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖氧化脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)槲焯?。如加入硝基藍四

12、氮唑 (nitroblue tetrazolium , NBT)，則可被吞噬或滲透到中性粒細胞胞質(zhì)中，接受所脫的氫，使原來呈淡黃色的NBT還原成點狀或塊狀的藍黑色甲月替顆粒，沉積于中性粒細胞胞質(zhì)中，稱NBT陽性細胞。NBT陽性細胞百分率可反映中性粒細胞殺菌功能，正常參考值為7%15%，平均為10%。慢性肉芽腫病患者NBT陽性細胞百分率顯著降低，甚至為零。 第二節(jié) 免疫防治天花天花病毒Smallpox virus出疹的木乃伊（疑為天花）軀干皮膚天花損傷患天花的小兒 （Infant with smallpox） 1979年WHO宣布在全球范圍內(nèi)消滅了天花病毒。脊髓灰質(zhì)炎患脊髓灰質(zhì)炎的兒童 （Chi

13、ld with polio sequelae WHO）WHO 宣稱將在2003年在全球消滅脊髓灰質(zhì)炎中毒黑寡婦蜘蛛 黑寡婦癥候群（影響神經(jīng)）Jenner 和 Pasteur , 著名的免疫學家，公認為免疫接種和主動免疫的先驅(qū)。Edward JennerLouis Pasteur疫苗接種實際效果0 10 100 1,000 10,000 100,000 1,000000 白喉 Diphtheria1921風疹 Rubella1969脊髓灰質(zhì)炎 Polio (paralytic)1952百日咳 pertussis1934腮腺炎 Mumps1968麻疹 Measles1941報道的病例數(shù) Numbe

14、r of reported cases0 例美國報道的幾種病在高峰年 和1996年 的病例數(shù)相比一、免疫預防（immunoprophylaxis）免疫預防人工主動免疫人工被動 免疫輸入抗原（疫苗）輸入免疫效應物質(zhì)（抗體）主動建立長期的免疫應答被動獲得短期的免疫效應能力慢、持久快、短暫主動免疫被動免疫疫苗抗毒素人免疫球蛋白滅活疫苗減毒活疫苗類毒素病原體滅活減毒活病原體細菌外毒素體液免疫體液免疫、細胞免疫抗細菌毒素抗體（動物血清）1、安全 活疫苗要求遺傳形狀穩(wěn)定，無返祖，無致癌性， 無熱原性及過敏原。2、有效 大多數(shù)人有保護性免疫，群體抗感染能力強。 理想的疫苗： 誘導體液和細胞免疫 維持時間長3

15、、實用 接種程序簡化如：口服疫苗 無不適反應 易保存和運輸（一）、疫苗的基本要求疫苗的應用新型疫苗及其發(fā)展基因工程疫苗*重組抗原疫苗：用DNA重組技術制備只含保 護性抗原的純化疫苗。 疫苗不含活病原體和病毒核酸，安全有效，成本低*重組載體疫苗：將編碼病原體有效免疫原的基因插入載體 （病毒或細菌）的基因中，接種后隨疫苗株在體內(nèi)增殖而表達抗原* DNA疫苗：將編碼病原微生物有效的免疫原的基因插入到細菌質(zhì) 粒 DNA中，建成重組質(zhì)粒，再將其導入 組織細胞，使其表達保護性抗原，產(chǎn)生特異性免疫。如：HIV的疫苗*轉(zhuǎn)基因植物疫苗：將編碼病原生物有效蛋白抗原基因和高表達 的質(zhì)粒一同植入到植物的基因中，產(chǎn)生的

16、轉(zhuǎn)基 因植物，食用后能產(chǎn)生免疫力* 細胞因子基因工程疫苗：將某些細胞因子（如IL-2、4、IFN-r、 TNF等） 導入腫瘤細胞，誘發(fā)腫瘤抗原的遞呈，活化腫瘤 特異性淋巴細胞，達到抗瘤目的根據(jù)某些特定傳染病的疫情監(jiān)測和人群免疫狀況分析，按規(guī)定的程序有計劃地進行人群預防接種，達到控制和消滅傳染病的目的，稱計劃免疫。（四）、計劃免疫第二節(jié)、免疫治療免疫系統(tǒng)免疫應答免疫耐受免疫防御免疫監(jiān)視免疫自穩(wěn)免疫調(diào)節(jié)超敏反應免疫缺陷或免疫低下腫瘤自身免疫病移植排斥免疫治療1.免疫治療基本概念各種治療因子調(diào)節(jié)免疫功能直接發(fā)揮免疫效應功能治療疾病2. 分類：免疫增強療法免疫抑制療法感染、腫瘤、免疫缺陷超敏反應、自身

17、免疫病、移植排斥、炎癥免疫治療的方法細胞治療分子治療生物應答調(diào)節(jié)劑與免疫抑制劑分子治療分子疫苗合成肽疫苗、重組載體疫苗和DNA疫苗可作為腫瘤和感染性疾病的治療性疫苗抗體多克隆抗體抗感染的免疫血清、抗淋巴細胞丙種球蛋白；單克隆抗體與基因工程抗體抗細胞表面分子、CK單抗及抗體靶向治療細胞因子外源性CK治療如IFNa對毛細胞白血病療效顯著；IFNb可延緩多發(fā)性硬化癥CK拮抗療法如用TNFa單抗治療類風濕關節(jié)炎；rsIL-1R可抑制器官移植排斥微生物抗原疫苗人類許多腫瘤與微生物相關，如HP或HPV，使用這些微生物疫苗或抗病毒制劑可防治相應腫瘤tumorprodrugdrugtoxinradioisotope Enzyme細胞治療過繼免疫治療細胞疫苗造血干細胞移植包括腫瘤細胞疫苗(滅活、異構)、基因修飾的瘤苗、DC疫苗。取自體淋巴細胞經(jīng)體外激活、增殖后回輸患者，直接殺傷腫瘤或激發(fā)機體抗腫瘤免疫，如TIL和CIK。是癌癥、造血系統(tǒng)疾病、自身免疫病等的重要治療手段，可取自