1、 1971年瑞典學(xué)者 Engvall 和Perlmann，荷蘭學(xué)者Van Weeman和 Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA） 三、免疫檢測(cè)技術(shù)3.1.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）ELISA原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān) ELISA原理圖YYELISA 常用的酶和底

2、物辣根過氧化物酶，底物為OPD, 深桔黃色 ，檢測(cè)波長(zhǎng)492nm TMB， 藍(lán)綠色，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm 堿性磷酸酶，底物為PNPP（對(duì)消基苯磷酸酯）, 黃色 檢測(cè)波長(zhǎng)405nm ELISA各步驟的反應(yīng)時(shí)間 包被：2436h，蛋白濃度為15ug/ml 封閉：37C 2h 或4C過夜（3BSA） 樣本反應(yīng)時(shí)間：37C 45min-1h 酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間： 37C 45min-1h 顯色時(shí)間：15min(避光） 設(shè)對(duì)照 可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗

3、體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色結(jié)果判定若待檢孔顯色淺于或等于陰性對(duì)照判定為陰性若待檢孔顯色深于或等于陽(yáng)性對(duì)照孔則判定為陽(yáng)性若待檢孔顯色介于陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔之間則判定為弱陽(yáng)性 3.2.Western(印跡)雜交* 蛋白質(zhì)水平上的雜交技術(shù)，又稱為免疫印跡，即檢測(cè)蛋白質(zhì)與標(biāo)記的特定蛋白抗體結(jié)合，經(jīng)放射自顯影或顏色反應(yīng)顯示條帶，根據(jù)條帶密度確定蛋白質(zhì)表達(dá)量。* 與DNA、RNA水平上的Southern雜交、Northern雜交相對(duì)應(yīng)，稱為Western雜交。* 常結(jié)合Northern印跡技術(shù)，檢測(cè)基因表達(dá)調(diào)控。一、聚丙烯酰胺凝膠的原理聚丙烯

4、酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethyl ethylenedia mine，簡(jiǎn)稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡(jiǎn)稱AP)或核黃素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，

5、簡(jiǎn)稱PAGE)。聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；(3)對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)。 表3.4

6、分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋 白 質(zhì) 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。 目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。圖1 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖(A為正面,B為剖面)(1)樣品膠pH6.7 (2)濃縮膠pH6.7 (3)分離膠pH8.9 (4)電極緩沖液pH8.3圖2 夾心垂直板電泳槽示意圖 圖3

7、凝膠模示意圖1.樣品槽模板 2.長(zhǎng)玻璃板 1.導(dǎo)線接頭 2.下貯槽 3.凹形橡膠框 4.樣品槽模板 5.固定螺絲 6.上貯槽 7.冷凝系統(tǒng) 不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。聚丙烯酰胺凝膠電泳的不連續(xù)體系圖5 不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應(yīng)示意圖 （1）樣品濃縮效應(yīng) (

8、a)凝膠孔徑不連續(xù)性： (b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性； 在pH6.7的凝膠緩沖體系中前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-) 尾隨離子(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)； （c)電位梯度的不連續(xù)性：(2)分子篩效應(yīng)(3)電荷效應(yīng)不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應(yīng) 圖4 電泳過程示意圖A為電泳前3層凝膠排列順序 B顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。C顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個(gè)區(qū)帶。

9、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS） ：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,簡(jiǎn)稱SDS)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。因此可以利用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。 Western Blot1 原理： 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識(shí)別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識(shí)別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非

10、特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量。 Western Blotting基本原理 在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測(cè)。通過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法:針對(duì)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn):對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大 western及 IP細(xì)胞裂解液+PMSF 有機(jī)溶劑提取法:分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì) 乙醇、丙酮和丁醇通過層析或電洗脫法制備目的蛋白蛋白樣品的制備抑制蛋白酶2 操作過程SDS電泳 轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖

11、維素膜） 封閉 一抗 洗滌 酶標(biāo)二抗反應(yīng) 洗滌 顯色或化學(xué)發(fā)光顯影操作過程蛋白的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離不同的蛋白質(zhì)制備三明治負(fù)極三層濾紙膠PVDF膜三層濾紙正極注意事項(xiàng):1.膜和濾紙避免蛋白污染; 2.PVDF膜在甲醇中活化1min左右;3.膠和濾紙?jiān)赥BST中浸泡10min左右;4.上下三層濾紙避免接觸,以防短路;5.避免氣泡產(chǎn)生.轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)麗春紅S染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過程。 封閉封閉液(5脫脂奶粉):5g脫脂奶粉+100mlTBST目的:降低膜與抗體的非特異性結(jié)合

12、.方法:膜浸浸泡于封閉液中,于室溫輕輕搖動(dòng)2-4h或4過夜.注意事項(xiàng):封閉時(shí),膜的正面不能有氣泡.一抗孵育一抗稀釋液:封閉液+一抗(按說明書)把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入一抗稀釋液(一般5ml)與濾膜溫育。37,4小時(shí)或4 ,過夜。用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。二抗孵育二抗稀釋液:封閉液+二抗加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)， 37, 2-3小時(shí)。用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。顯色方法:1.增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL) 2.底物DAB呈色原理:利用二抗上標(biāo)記的過氧化物酶或辣根過氧化物酶，使底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而發(fā)出熒光。成分: 氨基苯二酰肼類:主要

13、是魯米諾、異魯米諾衍生物原理: 魯米諾在免疫測(cè)定中既可用作標(biāo)記物,也可用作過氧化物酶的底物.在Ecl底物中,含有H2O2和魯米諾,在HRP(辣根過氧化物酶)的作用下,發(fā)出熒光來.ECL 顯色:底物DAB顯色成分: DAB(3,3二氨基聯(lián)苯胺)原理: DAB與HRP反應(yīng)產(chǎn)生棕色的不溶終產(chǎn) 物0h 4h 8h 16hWestern Blot analysis of cytochrome C release. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells we

14、re treated with 10M gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody. Cyto-CX-ProteinDNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip)是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上 。四、基因芯片基因芯片(gene chip)基因芯片一、什么是基因芯片（Genech

15、ip） 1、所謂基因芯片是指將大量探針以很的高密度分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的核酸樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量，也可還可以用于核酸樣品的序列分析。以達(dá)到快速、高效、高通量的分析生物信息的目的。 基因芯片技術(shù)和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)操作：準(zhǔn)備探針：RNA提取標(biāo)記熒光染料雜交反應(yīng)雜交后的處理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：異種DNA平行試驗(yàn)；RNA質(zhì)量檢測(cè)對(duì)照；封閉對(duì)照；規(guī)整化對(duì)照成像分析 基因芯片雜交結(jié)果圖基因芯片基因芯片掃描結(jié)果不同的顏色代表一個(gè)探針點(diǎn)雜交上的帶熒光標(biāo)記的核酸分子數(shù)的差異。紅黃綠蘭紫四、基因芯片的特點(diǎn)微型化和自動(dòng)化。現(xiàn)已出現(xiàn)的芯片面積最大不過525cm,最小僅有1cm,;每個(gè)

16、陣列中陣點(diǎn)樣品DNA的用量?jī)H為5nl(0.5g/L)左右;同時(shí)雜交和洗片等過程都可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,工作效率大幅度提高。高度平行性?；蛐酒夹g(shù)是將待研究的基因制作成芯片,并在同一張芯片上同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料進(jìn)行雜交分析,從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性.巨大的信息產(chǎn)出率。在一張芯片上不僅可以獲得組織、細(xì)胞、血液等基因表達(dá)信號(hào)的定性、定量分析，還可實(shí)現(xiàn)全局檢測(cè)靜態(tài)到動(dòng)態(tài)、時(shí)間與空間上的差異及遺傳信息。高度敏感性和專一性。能可靠并準(zhǔn)確檢測(cè)出10 pg/L的DNA樣品。 高度重復(fù)性。一張由尼龍膜制作的微陣列，可以重復(fù)雜交使用多達(dá)20次。強(qiáng)大的類比性。使得以往需多次處理的遺傳分析在同一時(shí)間和條件下快速完成。哺

17、育新的實(shí)驗(yàn)方法。此技術(shù)易與其它常規(guī)生物技術(shù)相融合交叉。基因芯片這些獨(dú)一無二的特點(diǎn)也代表了后基因組時(shí)代技術(shù)的發(fā)展方向。 基因芯片技術(shù)和應(yīng)用基因芯片的應(yīng)用： 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究；藥物篩選；臨床診斷；指導(dǎo)用藥；預(yù)防醫(yī)學(xué)研究；環(huán)境保護(hù)；軍事、司法；農(nóng)業(yè)等基因芯片使用應(yīng)注意的問題： 類型的選擇；基因芯片數(shù)量；取材；取材量；結(jié)果分析；多種芯片結(jié)合應(yīng)用疾病的診斷與治療：尋找和檢測(cè)與疾病相關(guān)的基因及在RNA水平上檢測(cè)致病基因的表達(dá)基因芯片在感染性疾病、遺傳性疾病和腫瘤等疾病的臨床診斷方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，它可以在一張芯片同時(shí)對(duì)多個(gè)病人進(jìn)行多種疾病的檢測(cè)；無需機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，能及早診斷，待測(cè)樣品用

18、量??；能檢測(cè)病原微生物的耐藥性，病原微生物的亞型；極高的靈敏度和可靠性；檢測(cè)成本低，自動(dòng)化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。這些特點(diǎn)使得醫(yī)務(wù)人員在短時(shí)間內(nèi)，可以掌握大量的疾病診斷信息，這些信息有助于醫(yī)生在短時(shí)間內(nèi)找到正確的治療措施。 藥物研究與開發(fā)：芯片技術(shù)具有高通量、大規(guī)模、平行性等特點(diǎn)可以進(jìn)行新藥的篩選，尤其對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)的中藥有效成分進(jìn)行篩選。目前，國(guó)外幾乎所有的主要制藥公司都不同程度地采用了基因芯片技術(shù)來尋找藥物靶標(biāo)，查檢藥物的毒性或副作用，用芯片作大規(guī)模的篩選研究可以省略大量的動(dòng)物試驗(yàn)，縮短藥物篩選所用時(shí)間，在基因組藥學(xué)（pharmacogenomics）領(lǐng)域帶動(dòng)新藥的研究和開發(fā)。 基因功能研究：在基因組學(xué)和后基因組學(xué)研究中，基因芯片也起到重要的作用。應(yīng)用基因芯片可以開展DNA測(cè)序、基因表達(dá)檢測(cè)、基因突變性、基因功能研究、尋找新基因、單核苷酸多態(tài)性（SNP）測(cè)定等研究。與傳統(tǒng)的Northern blot雜交或點(diǎn)雜交方法相比，基因芯片技術(shù)具有大規(guī)模平行處理的能力。在營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用：采用基因芯片技術(shù)研究營(yíng)養(yǎng)素與蛋白和基因表