1、全部實驗步驟1取新鮮組織于4%多聚甲醛固定24小時30%蔗糖脫水48小時以上-250C包埋（冰凍切片機內(nèi)）4冰凍切片冰凍切片步驟冰凍切片免疫組化染色步驟：冰凍切片48pm,室溫放置30分鐘后，入4。丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘x3次。用3%過氧化氫 孵育510分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗，5分鐘x2次。下接石蠟切片免疫組化染色 操作步驟。（見我發(fā)的前面的帖子）你確定你是冰凍切片嗎？ ？冰凍切片不能用熱修復(fù)?。∫韵率俏业牟襟E：1冰凍切片室溫放置30分鐘后，入4。丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘x3。用3%過氧化氫孵育510 分鐘，PBS洗，5分鐘x2o510%正常山羊血

2、清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一 抗或一抗工作液，37r孵育12小時或4C過夜。PBS沖洗，5分鐘、3次。4滴加滴加第二代生物素標記二抗工作液，37C或室溫孵育30分鐘。PBS沖洗，5分鐘x3次。5滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37C或室溫孵育1030分鐘。6 PBS沖洗，5分鐘、3次。7顯色劑顯色（DAB）。8自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。冰凍切片免疫組化染色用的滅活內(nèi)源性過氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇 溶液，室溫20分鐘。此配方不易產(chǎn)生脫片。配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混勻后使用，每次新鮮配制。冰凍切片免疫組化染色步

3、驟冰凍切片48mm，室溫放置30分鐘后，入4。丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘x3。用3%過氧化氫孵 育510分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘x2。下接免疫組化染色操作步驟。免疫組化染色步驟：（SP試劑盒為例）1冰凍切片48um,室溫放置30分鐘后，入4。丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘x3。用3%過氧化氫 孵育510分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘x2o510%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一 抗或一抗工作液，37r孵育12小時或4C過夜。PBS沖洗，5分鐘、3次。4滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗

4、（1%BSA-PBS稀釋），37C孵育1030分鐘；或滴加第二代生物素 標記二抗工作液，37C或室溫孵育1030分鐘。PBS沖洗，5分鐘x3次。5滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37C孵育1030分鐘；或第二代辣根酶標記 鏈霉卵白素工作液，37C或室溫孵育1030分鐘。6 PBS沖洗，5分鐘、3次。7顯色劑顯色（DAB或AEC）。8自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。冰凍切片4um左右，室溫25 C復(fù)溫30min，浸入4 C預(yù)冷的丙酮固定10min，PBS （PH為7.2-7.4）在9cm皿內(nèi)搖床沖洗3次，每次5min （第一次沖洗時間短些，約 1min后更換）用3%過氧化氫一份

5、，純甲醇50份（需要現(xiàn)配，避光條件封閉，可以用紙盒蓋住皿）30minPBS （PH為7.2-7.4，酸性）在9cm皿內(nèi)搖床沖洗3次，每次5min （第一次沖洗時間短 些，約1min后更換），甩去PBS，擦干切片周圍的水分，用免疫組化筆或蠟筆在組織周 圍畫一適當大小的圈，距離組織不宜太近，與切片組織保持5mm左右距離，太近會導(dǎo)致 邊緣效應(yīng)。5%BSA，室溫孵育20min，期間注意觀察，以免BSA干燥而導(dǎo)致背景太高，請注意在皿內(nèi) 玻片兩側(cè)放置浸濕的衛(wèi)生紙或棉球。甩去血清，PBS洗1min，擦干周邊水分，圈內(nèi)可不擦，但盡量要甩干，以免導(dǎo)致抗體濃 度不均。配置一抗工作液用5%BSA （抗體濃度為1:1

6、00），懸空加入一抗工作液50-100ul，槍頭不 要觸及組織，以免損傷組織結(jié)構(gòu)，滴加一抗后在水平桌面畫圈方式振蕩，混勻一抗，否 則抗體可能附著不勻。放入濕盒內(nèi)，置于4 C冰箱過夜（最長不可超過48h），注意蓋蓋，放入后觀察玻片是 否處于水平位（否則抗體可能流失，導(dǎo)致玻片組織干掉，出現(xiàn)背景高和假陽性），孵育 期間觀察抗體是否干，若干了趕快用PBS清洗浸泡。第二天上午取出玻片，置常溫復(fù)溫30min，后PBS沖洗1+5+5+5min，滴加1:100生物素標記的二抗（注意選擇核對一抗來源，抗體加入稀釋后在EP管內(nèi)彈 勻，掌上離心機離心）室溫孵育30min-1h，后PBS沖洗1+5+5+5min。滴加

7、1 ：100比例稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素PBS稀釋液（SABC）室溫1h， 后PBS沖洗1+5+5+5min，甩干，以免顯色不均。DAB顯色，顯色時放置在白色紙上，觀察顯色程度以終止DAB反應(yīng)，最好把玻片置于顯 微鏡上找到可能的陽性顯色區(qū)域滴加DAB，觀察到陽性區(qū)和陰性區(qū)差異后終止，此時最 好有計時，以便于今后重復(fù)試驗控制顯色時間（一般顯色時間2s-10min，顯色時間過長背景高，且可靠性低）終止DAB顯色可將玻片置于染色缸內(nèi)，用自來水流水稀釋終止5min，后在顯微鏡下觀察 是否有DAB顆粒附著。甩干水分，蘇木素復(fù)染（如為加汞的蘇木素，顯色時間為6-10s，可不用酒精分化，直 接用

8、PBS返藍，如為非加汞蘇木素，需在鹽酸酒精分化），蘇木素終止亦可用自來水沖 洗終止反應(yīng)。水洗后梯度酒精脫水二甲苯透明（75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯1-二甲苯2）個3min， 滴加中性樹膠封片，中性樹膠濃度以不拉絲為宜封片后干燥1h（或者在通風(fēng)櫥吹風(fēng)的情況下15min），用棉球沾濕二甲苯擦去溢出的樹膠 觀察照相。針對脫片問題，我做了如下處理。但仍存在脫片現(xiàn)象，麻煩您給我提 一些相關(guān)的建議。自來水沖洗玻片，晾干后，多聚賴氨酸的涂膠以下兩種方法我都試過單涂膠：往一張玻片上加0.01%的多聚賴氨酸80ul，用另一張玻片推片，然后 疊加其上，停留5分鐘，中間推動玻片數(shù)次，使液體涂抹

9、均勻，分開兩張玻片， 濾紙吸干玻片下緣，置玻片架上600C烤干山備用。雙涂膠：往一張玻片上加0.01%多聚賴氨酸80ul，單涂膠600C烤干，同樣方法重 復(fù)涂膠1次600C烤干,備用。我用過的尼氏染色的方法，效果不錯。溶液配制：（1）溶液A：焦油固紫0.2g,純水500ml 溶液B： 0.1M冰醋酸 冰醋酸3ml，純水500ml（3）溶液C： 0.1M無水醋酸鈉 無水醋酸鈉4.1g，純水500ml（4）溶液D： PH3.54.5醋酸緩沖液B液94ml+C液6ml 工作液：A液10ml + D液90ml過濾后使用，避光保存注：焦油固紫遇光分解，整個過程應(yīng)避光操作，可以用黑色塑料袋罩著。具體步驟：

10、如果為石蠟切片，先進行脫蠟處理，然后從步驟開始；如果為冰凍切片，從步驟開始。將涼干的切片放入純水中35min。切片放入焦油固紫染色液中11.5h。切片放入純水中洗去浮色。 切片放入70%80%95%的酒精分色，各幾秒鐘，時間自己掌握，以不見掉色為好。切片放入特殊分色液中褪背底（1： 1： 1的無水乙醇，氯仿，乙醚）。 切片放入100%乙醇，5minx3次；二甲苯5minx3次，透明封固。整個過程要保證切片不能干掉。結(jié)果 尼氏小體：深藍紫色；核、核仁：淺紫色；背底：潔白無色。我個人覺得特殊分色液挺重要的Highman甲醇剛果紅染色法(類淀粉染色)1、試劑配制：甲醇剛果紅染液：剛果紅0.5 g甲醇

11、80 ml甘油20 ml堿性乙醇分化液：氫氧化鉀0.2 g 80%乙醇100 ml2、染色步驟：切片脫蠟至水甲醇剛果紅染液染1020分鐘用堿性乙醇分化液分化數(shù)秒水洗蘇木素復(fù)染2分鐘水洗脫水，透明，封固3、結(jié)果：淀粉樣物呈桔紅色。4、類淀粉染色的應(yīng)用：確定淀粉樣變性及玻璃樣變性的膠原組織，后者在剛果紅法染色后呈淡桔色，冰凍切片脫脂問題：0.5鹽酸乙醇分化液配置直接免疫熒光法測抗原基本原理將熒光素標記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光 染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微 生物的快速檢查和腎炎活檢、皮

12、膚活檢的免疫病理檢查。試劑與儀器入磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）： 0.01mol/L，pH7.4入熒光標記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋入緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制入搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）入有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）入熒光顯微鏡入玻片架入濾紙入37C溫箱等。實驗步驟滴加0.01mol/L, pH7.4的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持一定濕度。滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其完全覆蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時間（參考：30min

13、）。取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度，一般可用、+”表示：（-）無熒光；（士）極弱的可疑熒光；（+ ）熒光較弱，但清楚可見；（+）熒光明亮；（+）熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達+”以上，而各種對照顯示為（士）或（-），即可判定為陽性。注意事項對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1： 20，抗體濃度過 低，

14、會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10 min到數(shù)小時，一般30 min巳足夠。染色溫度多采用室溫（25C左右），高于37C可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2C的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37C30 min效果好的多。為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。（1）標本自發(fā)熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。（2）特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。（3）陽性對照：巳知的陽

15、性標本加熒光標記的特異性抗體。如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性 陽性染色。一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標本最好在當天觀察，隨著 時間的延長，熒光強度會逐漸下降。免疫熒光的標本制作的基本程序同DAB顯色的免疫組化：不同的是1免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其它相同2免疫熒光的二抗使用不同熒光標記的二抗孵育，孵育時間根據(jù)抗體的工作濃度確定3二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察4、免疫熒光在封片使用專用封片劑或甘油：0.01MPBS （1： 1）5條件許可可以購買防淬滅的試劑加入封片劑

16、中，標本可以保存更久6熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要閉光87熒光抗體染色假陽性可能會多，需要設(shè)定陽性和陰性對照注意事項熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4C保存4h，時間過長，會使熒光減弱。每次試驗時，需設(shè)置以下三種對照:（1）陽性對照：陽性血清+熒光標記物（2）陰性對照：陰性血清+熒光標記物（3）熒光標記物對照：PBS+熒光標記物免疫熒光組織（細胞）化學(xué)技術(shù)：如何設(shè)置對照（直接法、間接法和補體法）cyh（2010-07-28 11:23:08）為了保證免疫熒光組織化學(xué)染色的準確性，排除某些非特異性染色，必須在初次試 驗時設(shè)置對照：1、直接法（1）標本自發(fā)熒光對照標本只加PBS或緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察組織內(nèi)如果有熒光，稱為自發(fā)熒光。（2）抑制試驗可分為一步方法和二步方法。一步抑制方法：先將熒光抗體與過量未標記特異性抗體作等量混合，再加在標本上 染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。二步抑制方法：標本先加未標記的特異性抗體，水洗后再加標記熒光抗體，結(jié)果應(yīng) 呈陰性或明顯減弱的熒光。（3）陽性對照用已知陽性標本做直接法免疫熒光組織化學(xué)染色，結(jié)果應(yīng)呈陽性熒光。如對照1和 2無熒光或弱熒光，3待檢查標本呈強熒光即為特異性陽性熒光。2、間接法（1）自發(fā)熒光對照：同直接法。（2）熒光抗體對照：標本只加間接熒光抗體染色，