1、實(shí)驗(yàn)八 微生物遺傳實(shí)驗(yàn)-抗藥性突變株的分離1一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆瘴⑸镒儺惖脑砹私庾贤饩€誘變篩選突變菌株的方法學(xué)習(xí)用梯度平板法分離抗藥性突變株2二 實(shí)驗(yàn)原理基因突變可分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。許多物理、化學(xué)、生物因素對微生物都有誘變作用。1、自發(fā)突變-（抗藥性突變）1）基因中堿基順序的改變可導(dǎo)致微生物細(xì)胞的遺傳變異。這種變異有時(shí)能使細(xì)胞在有害的環(huán)境中存活下來，抗藥性突變就是一個(gè)例子。32）微生物的抗藥性突變是DNA分子的某一特定位置的結(jié)構(gòu)改變所致，與藥物的存在無關(guān)，某種藥物的存在只是作為分離某種抗藥性菌株的一種手段，而不是引發(fā)突變的誘導(dǎo)物。3）因而在含有一定抑制生長藥物濃度的平板上涂布大量的細(xì)胞群

2、體，極個(gè)別抗性突變的細(xì)胞會在平板上生成菌落。44）將這些菌落挑取純化，進(jìn)一步進(jìn)行抗性試驗(yàn)，就可以得到所需要的抗藥性菌株。5）抗藥性突變常用作遺傳標(biāo)記，因而掌握分離抗藥性突變株的方法是非常重要的。6）為了便于選擇適當(dāng)?shù)乃幬餄舛?，分離抗藥性突變株常用梯度平板法。本實(shí)驗(yàn)用梯度平板法分離大腸桿菌抗氨芐青霉素突變株。52、紫外線誘發(fā)突變紫外線是一種常用的物理誘變因素，主要作用于DNA，引起DNA損傷；為避免光修復(fù)，處理后的微生物應(yīng)放暗處培養(yǎng)。6三 實(shí)驗(yàn)步驟 1、抗藥性菌株的篩選(p.167) （1）取一個(gè)已經(jīng)滅菌的空大平皿，把培養(yǎng)皿斜放(一邊墊起)，在無菌條件下倒入不含藥物的底層培養(yǎng)基（10mL LB培

3、養(yǎng)基,已分裝好，保溫在滅菌鍋中，要快）； (在超凈工作臺做)7（2）待平板中的培養(yǎng)基凝固后將平皿放平，再倒入含有鏈霉素的上層培養(yǎng)基10mL（含有鏈霉素200u/mL：現(xiàn)配現(xiàn)用，原液20萬單位，吸50微升加入50 ML培養(yǎng)基）；2個(gè)組做，8個(gè)組用。 (在超凈工作臺做) 在皿底用箭頭標(biāo)記,示藥物濃度從低到高。注意：抗生素要在培養(yǎng)基冷卻到50度左右再加； 8（3）取一支大腸桿菌液體培養(yǎng)物，用移液槍移取200微升菌液到梯度平板上，進(jìn)行涂布。（實(shí)驗(yàn)室做）（4）將平板倒置于37培養(yǎng)2天；觀察經(jīng)一次培養(yǎng)的梯度平板上大腸桿菌的生長情況。9后續(xù)實(shí)驗(yàn)（不做）（5）選擇平板上12個(gè)生長在梯度平板中部的單個(gè)菌落，用無

4、菌接種環(huán)接觸單個(gè)菌落朝高藥物濃度的方向劃線。（6）將平板倒置于37培養(yǎng)2天；觀察經(jīng)二次培養(yǎng)的梯度平板上大腸桿菌的生長情況。102、紫外線誘變枯草桿菌（在實(shí)驗(yàn)室做）1）取菌懸液5ml，放入無菌空平皿（大平皿），去蓋置于紫外燈下照射3min（15W,距離30cm）；2個(gè)組做，8個(gè)組用。2）稀釋：用10倍稀釋法把經(jīng)過照射的菌懸液在無菌水中（已分裝好，每試管9mL）稀釋成10-1-10-6。同樣將未處理的菌液進(jìn)行同樣稀釋做對照；3）分別取10-4，10-5，10-6稀釋菌液150微升各涂一個(gè)小平板(3個(gè)對照，3個(gè)實(shí)驗(yàn))；需用淀粉培養(yǎng)基4）培養(yǎng)： 將上述平板用黑紙包好，置37培養(yǎng)48h。5）觀察誘變效應(yīng) 選取菌落較少的平板，加幾滴碘液，觀察透明圈大小，同時(shí)與對照平板比較