1、叔丁基對苯二酚及其氧化產物與牛血清蛋白的相互作用李軍 畢艷蘭 孫尚德 丁一冉（河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南鄭州 450001）摘要 采用紫外吸收光譜和熒光光譜法研究叔丁基對苯二酚（TBHQ）及其氧化產物叔丁基對苯二醌（TQ）與牛血清蛋白（BSA）的結合作用。結果表明，TBHQ和TQ與BSA之間發(fā)生了相互作用并形成新的聚合體；TBHQ和TQ與BSA的熒光猝滅均屬于靜態(tài)猝滅機制。TBHQ和TQ與BSA之間的結合常數均大于104 L/mol，表明它們之間形成的配合物結合較為牢固；TBHQ和TQ與BSA之間的結合位點數均為1；通過熱力學參數方程計算得出：H0和G0.98，由此表明在這一系列濃度下存在

2、單一的猝滅機制，即靜態(tài)猝滅或動態(tài)猝滅8。表1 不同溫度下TBHQ/TQ與BSA相互作用的Stern-Vorlmer曲線方程和相關系數T/BSA-TBHQBSA-TQ回歸方程R回歸方程R15y=0.251 4CTBHQ+0.999 70.993 1y=0.273 7CTQ+1.002 50.990 025y=0.205 6CTBHQ+0.998 00.995 5y=0.211 5CTQ+0.998 50.996 637y=0.177 3CTBHQ+0.996 80.980 8y=0.170 5CTQ+0.997 70.989 8動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅可以溫度來區(qū)分9。動態(tài)猝滅由于與擴散有關，當溫度升

3、高時溶液的黏度下降，同時分子的運動加速，其結果將使分子的擴散系數增大，從而增大分子猝滅常數。反之，溫度升高可能引起配合物穩(wěn)定性的下降，靜態(tài)猝滅常數減小。根據表1中BSA-TBHQ和BSA-TQ三個體系在不同溫度下的Stern-Vorlmer曲線方程的斜率和截距算出三個體系在在不同溫度下的動態(tài)猝滅常數Ksv和猝滅速率常數Kq，結果如表2所示。表2 不同溫度下BSA-TBHQ/BSA-TQ體系的動態(tài)猝滅常數（Ksv）、猝滅速率常數（Kq）T/BSA-TBHQBSA-TQKsv103/（L/mol）Kq1011/（Lmol-1s-1）Ksv103/（L/mol）Kq1011/（Lmol-1s-1）1

4、52.514.052.744.41252.063.322.123.41371.782.861.712.75由表2可以看出，BSA-TBHQ和BSA-TQ三個體系的Ksv均隨著溫度的升高而減小，表明BSA與TBHQ及BSA與TQ的反應過程都是靜態(tài)猝滅過程。另外，由表2也可以看出，BSA-TBHQ和BSA-TQ體系的猝滅速率常數Kq的值約為1011 Lmol-1s-1。由于各種熒光猝滅劑對于生物大分子的最大動態(tài)熒光猝滅速率常數Kq約為1010 Lmol-1s-110。顯然，BSA與TBHQ、TQ作用引起的猝滅常數大于最大動態(tài)熒光猝滅速率常數。進一步表明BSA與TBHQ、TQ反應的猝滅過程不是由動態(tài)

5、碰撞引起的，而是因為它們之間通過靜態(tài)結合形成配合物產生的。2.3.2 結合常數和結合位點數對于靜態(tài)猝滅過程，如果生物分子中存在相似的和獨立的結合位點，則結合常數（Kb）和結合位點數（n）可根據方程（2）求得。 （2）其中，Kb是TBHQ/TQ與蛋白相互作用的結合常數，n是每個蛋白分子的結合位點數。根據方程（2）做log（F0/F-1）對logQ的雙對數回歸曲線，相應的回歸方程和相關系數如表3所示。表3 BSA-TBHQ/BSA-TQ體系的雙對數曲線方程、相關系數、結合常數（Kb）和結合位點數（n）體系T/回歸方程RKb104/（L/mol）nBSA-TBHQ15y=1.168 0CTBHQ+4

6、.208 10.992 31.611.1725y=1.179 1CTBHQ+4.137 70.996 81.371.1837y=1.187 3CTBHQ+4.065 90.988 91.161.19BSA-TQ15y=1.071 9CTQ+3.821 80.972 50.661.0725y=1.086 1CTQ+3.710 50.996 50.511.0937y=1.107 0CTQ+3.683 10.979 90.481.11由表3可以看出，BSA-TBHQ、BSA-TQ三個體系不同溫度下log（F0-F0/F）對logQ所做雙對數回歸曲線的相關系數均大于0.98，表明方程（2）的假設是正確

7、的；在實驗溫度下n的值約為1，表明BSA與TBHQ、TQ的結合位點數均僅有1個；結合常數約為104 L/mol，說明BSA與TBHQ、TQ之間的結合較為牢固。BSA的主要結合區(qū)域位于具有相似化學性質的亞結構域IIA（Sudlows Site I）和IIIA（Sudlows Site II）的疏水腔中。因此，TBHQ和TQ最可能與區(qū)域A的疏水性空腔相結合，即212位色氨酸所在的結合位點附近。2.3.3 TBHQ、TQ與BSA的結合方式一般情況下，小分子與生物分子之間的相互作用力有疏水作用力、靜電作用力、范德華作用力和氫鍵11。為了闡明TBHQ、TQ與BSA之間的相互作用，以lnKb對1/T進行線

8、性擬合，根據熱力學方程（3）、（4）計算其相應的熱力學參數如焓變（H）、熵變（S）和自由能變（G），結果如表4所示。 （3） （4）其中，Kb表示相應溫度下的結合常數，R為氣體常數。如果溫度變化不明顯，H可視為常數。表4 不同溫度下BSA-TBHQ/BSA-TQ體系的熱力學參數T/BSA-TBHQBSA-TQG/（kJ/mol）H/（kJ/mol）S/（Jmol-1K-1）G/（kJ/mol）H/（kJ/mol）S/（Jmol-1K-1）15-23.19-11.04+42.22-20.98-10.64+35.9025-23.62-11.04+42.22-21.34-10.64+35.9037-

9、24.12-11.04+42.22-21.77-10.64+35.90由表4中H、S值可得出TBHQ、TQ與生物分子BSA之間相互作用的結合方式：（1）S0表明了疏水作用力的存在，這是因為水分子在TBHQ、TQ周圍排列有序，蛋白質獲得了一個隨機結構。（2）H0且不接近于0表明主要作用力不可能是靜電作用力。當有氫鍵結合時，H0。因此，TBHQ、TQ與BSA相互作用的主要作用力是疏水作用力與氫鍵。并且由G0可以得知此反應過程是自發(fā)進行的。2.3.4 TBHQ和TQ與BSA之間的能量轉移根據Foster偶極-偶極非輻射能量轉移理論，當能夠發(fā)射熒光的供能體與受能體之間的最大距離不超過7 nm，且供能體

10、的熒光發(fā)射光譜與受能體的紫外吸收光譜有足夠的重疊時，將會發(fā)生非輻射能量轉移現象，從而導致熒光體發(fā)生熒光猝滅3。圖5 TBHQ/TQ的紫外吸收光譜和BSA的熒光光譜疊加圖從圖5中可以看出，TBHQ和TQ的紫外吸收光譜與BSA的熒光發(fā)射光譜均有一定程度的重疊，因此，根據能量轉移理論公式（5）、（6）、（7）可求得TBHQ和TQ與BSA的結合距離r0，即能量轉移的距離。 （5） （6） （7）其中，E為能量轉移效率，R0為轉換能量效率取50%時的臨界距離，r0為能量轉移的實際距離，K2為偶極空間取向因子，通常取平均值2/3，為沒有能量轉移時供能體的熒光量子產率，通常蛋白質中取色氨酸的量子產率0.11

11、8，n為介質的折射率，通常取水和有機物折射率的平均值1.336，J為供能體的熒光發(fā)射光譜和受能體的紫外吸收光譜的重疊，F()為波長從到范圍內經過矯正的供能體的熒光強度，為波長為時受能體的吸光系數。通過對波長在300到450 nm范圍內供能體的熒光發(fā)射光譜和受能體的紫外吸收光譜的重疊部分進行積分，求得BSA-TBHQ體系中J為8.9210-16 cm3L/mol，進一步求得E為0.02 nm，R0為1.64 nm，r0為3.13 nm，這與Shahabadi等3的研究結果是一致的。同理，求得BSA-TQ體系中J為2.5310-15 cm3L/mol，進一步求得E為0.02 nm，R0為1.95

12、nm，r0為3.73 nm。顯然，BSA-TBHQ和BSA-TQ體系中供能體與受能體的結合距離r均7 nm，由此表明BSA到TBHQ和TQ均以能量轉移的方式與BSA之間發(fā)生了相互作用。2.4 構象變化2.4.1 紫外吸收光譜紫外可見吸收光譜對于檢測絡合物的形成是一種簡單而有效的方法。在本研究中，以BSA溶液為參比，通過加入不同量的TBHQ、TQ到BSA溶液中，來探索BSA的結構變化（圖6）。圖6 不同溫度下BSA與不同濃度TBHQ/TQ作用的紫外吸收光譜（以25為例）注: c(BSA)=1.2010-5 mol/L, c(TBHQ/TQ)/c(BSA)=0, 0.25, 0.50, 0.75,

13、 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00.從圖6可以看出，BSA的紫外吸收強度隨著TBHQ、TQ濃度的增加而增加，且擬合曲線的線性關系較好，這表明BSA與TBHQ、TQ之間形成了結合較好的復合物6。另外，BSA-TBHQ和BSA-TQ體系紫外吸收光譜的最大吸收峰均發(fā)生紅移，進一步說明蛋白質的構象發(fā)生了改變。2.4.2 同步熒光同步熒光光譜因具有簡化光譜、窄化譜帶和減小光譜重疊等優(yōu)點而常用來探討蛋白質構象的變化，近年來越來越廣泛地被應用在小分子和生物大分子之間相互作用的研究領域中。對于蛋白質的同步熒光，=15 nm時僅表現出酪氨酸殘基的熒光，=60 nm時僅表現出色氨酸殘基的熒

14、光，因為不同氨基酸殘基的最大發(fā)射波長與其所處環(huán)境的極性有關，所以可以根據發(fā)射波長的改變判斷蛋白質構象的變化。圖7 BSA與不同濃度TBHQ作用的同步熒光光譜注: c(BSA)=1.2010-5 mol/L, c(TBHQ)/c(BSA)=0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00.圖8 BSA與不同濃度TQ作用的同步熒光光譜注: c(BSA)=1.2010-5 mol/L, c(TQ)/c(BSA)=0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00.如圖7、8所示，隨著TBHQ和TQ的添加

15、，酪氨酸和色氨酸殘基的熒光同時被猝滅，且色氨酸殘基的熒光強度隨TBHQ和TQ添加而降低的程度明顯快于酪氨酸殘基，表明TBHQ和TQ與BSA的結合位點更接近色氨酸3。另外，TQ對色氨酸殘基的熒光猝滅比TBHQ更明顯，表明TQ更容易跟BSA結合。對于TQ，色氨酸和酪氨酸的最大發(fā)射波長均發(fā)生了微弱的藍移，表明TQ的加入使BSA中這兩種熒光發(fā)射基團附近的極性降低，疏水環(huán)境增強，說明構象發(fā)生了變化12；TBHQ在色氨酸最大波長處發(fā)生藍移，在酪氨酸最大波長處發(fā)生紅移，表明TBHQ和BSA的相互作用改變了色氨酸殘基和酪氨酸殘基附近的構象，使色氨酸殘基基團附近的極性降低、疏水環(huán)境增強，酪氨酸殘基集團附近的極性

16、增強、疏水環(huán)境減弱。3 結論采用紫外吸收光譜法和熒光光譜法研究了TBHQ和TQ與BSA的作用機制，TBHQ和TQ對BSA的熒光猝滅機制是靜態(tài)猝滅，它們分別與BSA以1: 1的結合方式形成復合物；TBHQ和TQ與BSA的相互作用力以疏水作用力和氫鍵為主；紫外吸收光譜和同步熒光光譜表明TBHQ和TQ的加入，使得BSA在微環(huán)境中的極性發(fā)生了改變，從而導致BSA構象發(fā)生了變化。參考文獻1 李軍, 畢艷蘭, 楊會芳, 等. 加熱條件下大豆油中TBHQ的揮發(fā)、轉化規(guī)律及其對大豆油品質的影響J. 食品科學, 2014, 35(14): 106-112LI JUN, BI Yan-lan, YANG Hui-

17、fang, et al. Volatilization and transformation rules of TBHQ and its effect on the quality of soybean oil under heating conditionJ. Food Science, 2014, 35(14): 106-1122 Shaikh S M T, Seetharamappa J, Ashoka S, et al. A study of the interaction between bromopyrogallol red and bovine serum albumin by

18、spectroscopic methodsJ. Dyes and Pigments, 2007, 73(2): 211-2163 Shahabadi N, Maghsudi M, Kiani Z, et al. Multispectroscopic studies on the interaction of 2-tert-butylhydroquinone (TBHQ), a food additive, with bovine serum albuminJ. Food Chemistry, 2011, 124(3): 1063-10684 Braeuning A, Vetter S, Ors

19、etti S, et al. Paradoxical cytotoxicity of tert-butylhydroquinone in vitro: What kills the untreated cells?J. Archives of Toxicology, 2012, 86: 1481-14875 楊會芳. 叔丁基對苯二酚在加熱過程中的變化及其檢測方法的研究D. 鄭州: 河南工業(yè)大學, 20116 唐世華, 黎幼群, 陳維竹. 對苯二酚和對苯醌與明膠蛋白質相互作用的紫外光譜分析J. 廣西民族大學學報: 自然科學版, 2011, 16(4): 78-817 Lakowicz J R,

20、Masters B R. Principles of fluorescence spectroscopyJ. Journal of Biomedical Optics, 2008, 13(2): 237-2658 Eftink M R, Ghiron C A. Fluorescence quenching studies with proteinsJ. Analytical Biochemistry, 1981, 114(2): 199-2279 Sukowska A, Maciek M, Rownicka J, et al. Effect of temperature on the methotrexateBSA interaction: Spectroscopic studyJ. Journal of