1、ICS65.020.30CCSB 4115內(nèi) 蒙 古 自 治 區(qū) 地 方 標 準DB15/T 27262022牛腹瀉疾病防控操作規(guī)程Operational procedures for bovine diarrhea prevention and control2022-07-29 發(fā)布2022-08-29 實施發(fā) 布DB15/T 27262022前言本文件按照GB/T 1.12020標準化工作導(dǎo)則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會（SAM/TC 19）歸口。本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、內(nèi)蒙古大學(xué)、內(nèi)蒙古自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心、

2、金宇保靈生物藥品有限公司、北京生泰爾科技股份有限公司、內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司。本文件主要起草人：徐曉靜、王建龍、謝夢圓、馬立峰、郭宇、王煒、魏小軍、趙曉軍、吳曉亮、韓四娥、王艷杰、周偉光、王秀敏。IDB15/T 27262022DB15/T 27262022Dubos 培養(yǎng)基：杜波斯液體培養(yǎng)基（Dubos medium） E.coli：大腸桿菌（Escherichia coli）HRT-18細胞：人直腸腫瘤-18細胞（Human Rectal Tumor-18 Cell） MA104 細胞：恒河猴腎細胞（Rhesus kidney cell）MDBK細胞：牛腎細胞（Madin Darb

3、y Bovine Kidney Cell）牛腹瀉疾病防控操作規(guī)程范圍本文件規(guī)定了牛腹瀉疾病的診斷和防治。本文件適用于奶牛飼養(yǎng)場（戶）、肉牛飼養(yǎng)場（戶）和動物診療機構(gòu)對牛腹瀉疾病的防控。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 4789.4 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗GB 4789.6 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗GB/T 16568 奶牛場衛(wèi)生規(guī)范GB 19489 實驗室 生物安全通

4、用要求GB/T 27637 副結(jié)核分枝桿菌實時熒光PCR檢測方法GB/T 35942 隱孢子蟲套式PCR檢測方法NY 5047 無公害食品 奶牛飼養(yǎng)獸醫(yī)防疫準則NY/T 5049 無公害食品 奶牛飼養(yǎng)管理準則3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。牛腹瀉疾病 bovine diarrhea牛腹瀉是一種以消化不良、腹瀉為主要癥狀的消化道疾病，引起牛腹瀉的病因分為傳染性和非傳染性因素兩類，傳染性因素包括病毒、細菌、寄生蟲等病原體；非傳染性因素包括營養(yǎng)、環(huán)境、管理等。4 縮略語下列縮略語適用于本文件。BVDV：牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus）BVD/MD：

5、牛病毒性腹瀉/黏膜?。˙ovine viral diarrhea-mucosal disease） BRV：牛輪狀病毒（Bovine ratovirus）BCoV：牛冠狀病毒（Bovine coronavirus）CPE：致細胞病變效應(yīng)（Cytopathic Effect）1GB/T 27401 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 動物檢疫生物安全措施樣品采集的生物安全措施符合GB 19489的規(guī)定。樣品處理的生物安全措施符合GB/T 27401的規(guī)定。病因 感染性腹瀉引起牛腹瀉疾病的主要病原有：病毒性病原包括牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛輪狀病毒（BRV） 和牛冠狀病毒（BCoV）等；細菌性病原包括致病性

6、大腸桿菌（E.coli）、沙門菌（Salmonella）、副結(jié) 核分枝桿菌（ Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ） 等； 寄生蟲性病原包括球蟲（Sphaerozoum fuscum）和隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）等。 非感染性腹瀉引起非感染性腹瀉的主要因素有飼養(yǎng)管理和環(huán)境因素，如消化不良、營養(yǎng)缺乏、中毒、應(yīng)激等。診斷臨床診斷流行病學(xué)不同年齡和品種牛均可發(fā)生，多見于幼齡牛，犢白痢多發(fā)于1月齡內(nèi)犢牛；犢牛副傷寒多發(fā)于15 月齡的犢牛；副結(jié)核性腸炎多發(fā)于成年牛；牛病毒性腹瀉病毒多發(fā)于618月齡牛，牛輪狀病毒和牛冠狀病毒

7、多發(fā)于1周齡犢牛。病牛和帶菌（毒）牛是感染性腹瀉的主要傳染源。通過消化道、呼吸道、接觸、胎盤和交配等途徑傳播。本病一年四季均可發(fā)生，尤以氣候多變、寒冷季節(jié)和環(huán)境衛(wèi)生較差時多發(fā)。臨床癥狀病毒性腹瀉牛病毒性腹瀉/黏膜病急性感染牛突然發(fā)病，體溫升至40 42 ，隨體溫升高，白細胞減少，有的可發(fā)生第二次白細胞減少。病牛精神沉郁、厭食，鼻、眼有漿液性分泌物，2 d3 d 內(nèi)可能有鼻鏡及口腔黏膜表面糜爛， 舌面上皮壞死、流涎增多、呼氣惡臭，通常在口腔損害之后發(fā)生嚴重腹瀉，病初水瀉，后帶黏液、血液， 甚至脫落的黏膜。部分病牛出現(xiàn)蹄葉炎及趾間皮膚糜爛壞死，導(dǎo)致跛行。慢性病例常出現(xiàn)鼻鏡糜爛，眼部常有漿液性分泌物

8、。門齒齒齦通常發(fā)紅，典型的臨床癥狀是由于蹄葉炎及趾間皮膚糜爛壞死而致的跛行。通常皮膚呈屑狀，在髻甲、頸部及耳后最明顯。2母牛妊期感染后流產(chǎn)，或產(chǎn)先天性缺陷犢牛，最常見的缺陷是小腦發(fā)育不全。牛輪狀病毒性腹瀉犢牛感染后12 h24 h出現(xiàn)嚴重腹瀉，發(fā)病突然，病初表現(xiàn)為精神不振、厭食和腹瀉，體溫正?；蚵愿?，排黃白色稀便，有時帶有黏液和血液。病程長者脫水明顯，嚴重者常有死亡。成年牛多呈隱性感染，并在一定時間持續(xù)向外界排毒。牛冠狀病毒性腹瀉犢牛感染后發(fā)生腹瀉，發(fā)病初期出現(xiàn)帶血的黃色黏性糞便，后期發(fā)展為水瀉，有時出現(xiàn)脫水、虛弱、體溫低，少數(shù)犢牛出現(xiàn)發(fā)熱、臥地不起等癥狀，嚴重的犢牛會出現(xiàn)昏迷甚至死亡。成年牛

9、常突然暴發(fā)， 排出深褐色帶血稀糞，伴有產(chǎn)奶下降、沉郁及厭食等癥狀。細菌性腹瀉犢白痢病牛初期體溫升高達41 42 ，有的犢牛出生后數(shù)小時開始腹瀉。初期糞便呈粥樣、白色或黃白色，后期呈水樣、灰白色，混有未消化的凝乳塊、血液及泡沫，有酸臭味。末期患病牛伴有腹痛，用蹄踢腹壁?？砂l(fā)生臍炎或關(guān)節(jié)炎，偶見肺炎。耐過病牛發(fā)育遲緩。有時可見神經(jīng)癥狀，興奮不安，有些病例可突然死亡。犢牛副傷寒主要由鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌引起。犢牛多發(fā)病突然，病初體溫升高至40 41 ，24 h后排出灰黃色稀便，混有黏液和血絲，一般于出現(xiàn)癥狀后5 d7 d內(nèi)死亡。病程長者可能會出現(xiàn)腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)腫大。成年牛感染表現(xiàn)高熱、昏迷、食欲

10、廢絕、呼吸困難，發(fā)病后12 h24 h糞便中帶有血塊，隨即腹瀉。糞便惡臭，含有纖維素絮片。病牛常死于高熱期后。病程長者可見脫水、消瘦、眼窩下陷，黏膜充血發(fā)黃。妊牛多流產(chǎn)。副結(jié)核性腸炎潛伏期較長，一般多見于25歲成年牛，發(fā)病初期為間歇性腹瀉，逐漸變?yōu)轭B固性腹瀉，腹瀉呈噴射狀水樣便，排泄物稀薄、惡臭，帶有氣泡、黏液。體溫常無變化，病程長者可見顯著消瘦，皮下水腫。寄生蟲性腹瀉球蟲病感染牛精神不振、食欲下降、腹瀉，病情加劇時體溫升至41 左右，發(fā)病后期出現(xiàn)貧血，體溫下降至35 36 ，后肢和肛門周圍被血糞污染。隱孢子蟲病發(fā)病后主要表現(xiàn)為腹瀉，食欲下降，嚴重脫水，在腹瀉期間的犢牛失去吃乳能力，飲水欲望增

11、加。病理變化病毒性腹瀉3DB15/T 27262022DB15/T 27262022牛病毒性腹瀉/黏膜病整個口腔可見糜爛灶。典型病變是食管黏膜糜爛斑呈縱行排列。胃黏膜可見出血、糜爛。小腸黏膜腫脹、出血，黏膜脫落甚至形成黏膜管套，腸內(nèi)容物含有黏液、血液和脫落黏膜，尤以空腸和回腸嚴重。腸系膜淋巴結(jié)腫脹、充血、出血和水腫。牛輪狀病毒性腹瀉牛輪狀病毒感染病理變化主要表現(xiàn)在消化腸道，腸腔內(nèi)充滿凝乳塊和乳汁，小腸腸壁變薄、半透明， 腸內(nèi)容物呈液狀、灰黃或灰黑色。牛冠狀病毒性腹瀉小腸腸壁變薄、透明，腸腔液體增多，嚴重者引起腹腔積水，胃內(nèi)有未消化的凝乳塊。感染的?？赡馨殡S呼吸道癥狀，表現(xiàn)為氣管黏膜充血、局限性

12、肺炎等。細菌性腹瀉犢白痢剖檢可見皺胃和小腸黏膜充血、水腫和出血，皺胃內(nèi)有大量凝乳塊，黏膜表面覆蓋膠狀黏液。腸內(nèi)容物?；煊醒汉蜌馀?，惡臭。腸系膜淋巴結(jié)腫大。經(jīng)臍帶感染的病例可見出血性臍炎和出血性臍動脈炎。病程長者伴有漿液纖維素性關(guān)節(jié)炎和出血性或漿液出血性肺炎。突然死亡的病例常無明顯病理變化。犢牛副傷寒剖檢可見腸內(nèi)容物稀薄，混有黏液和血液，呈咖啡色。病程較長時，小腸可見浮膜性與固膜性腸炎， 腸系膜淋巴結(jié)呈不同程度的水腫、出血。皺胃黏膜充血、水腫，表面被覆大量黏液，有時可見出血點。脾臟明顯腫大而柔軟，呈灰紅或暗紅色，邊緣鈍圓，被膜緊張，可見出血斑點和粟粒大的壞死灶。肝臟腫大，質(zhì)地柔軟，被膜下散在針

13、尖大的灰黃或灰白色病灶。副結(jié)核性腸炎剖檢可見尸體極度消瘦，可視黏膜因貧血呈蒼白色，被毛粗亂無光。特征性病變?yōu)槁栽錾阅c炎及相應(yīng)的淋巴結(jié)炎。病變多集中于空腸、回腸和結(jié)腸前段。病變腸管變粗，腸腔狹窄，黏膜覆蓋一層灰白色黏稠的糊狀物。腸黏膜增厚230倍，折疊形成腦回樣皺襞。病變部腸管的漿膜淋巴管和相應(yīng)的腸系膜淋巴管擴張、增粗，呈彎曲的細繩索狀，腸系膜淋巴結(jié)腫脹。寄生蟲性腹瀉球蟲病以出血性腸炎為特征，消瘦，可視黏膜蒼白，小腸后段、盲腸和結(jié)腸內(nèi)充滿半凝固的血樣內(nèi)容物， 腸黏膜腫脹、增厚或糜爛性壞死，淋巴濾泡腫大，有白色或灰色小病灶和潰瘍，表面有凝乳狀薄膜覆蓋。直腸內(nèi)容物呈褐色、惡臭，有纖維素性薄膜和黏

14、膜碎片。腸系膜淋巴結(jié)腫大。隱孢子蟲病剖檢可見腹腔內(nèi)蓄積大量液體，呈淡黃或微黃色，皺胃黏膜表面存在出血點和出血斑，回腸黏膜存在大面積的出血斑。結(jié)果判定4出現(xiàn)7.1.1、7.1.2、7.1.3，可判定為牛腹瀉疾病疑似病例。實驗室診斷主要儀器設(shè)備電鏡、低溫高速離心機、倒置顯微鏡、CO2細胞培養(yǎng)箱、恒溫細菌培養(yǎng)箱、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀。主要試劑PBS、2%磷鎢酸、胰酶、MA104細胞、MDBK細胞、HRT-18細胞、細菌微量生化反應(yīng)管及指示劑、PCR Taq酶。樣品采集糞便樣品將棉拭子伸入肛門內(nèi)刮取新鮮糞便，放入裝有3 mL PBS采樣管中；也可無菌采集地上剛排出新鮮糞便。編號并記錄相關(guān)信息。

15、組織樣品取病死牛腸道及內(nèi)容物、肝、脾、淋巴結(jié)等，置于無菌密封袋或采樣杯內(nèi)。樣品處理用于病毒檢測：對于糞便樣品，放入盛有 3 mL PBS 管中，充分振蕩， 12000 r/min 4 離心 5 min8 min，取上清備用；對于組織樣品，稱取 1 g 置于研缽，充分研磨后加 5 mL PBS，混勻， 8000 r/min 4 離心 5 min，取上清備用。將上清于 0.22 m 濾器過濾，-80 冰箱保存或直接接種細胞。用于細菌檢測：將糞便樣品漩渦震蕩，用無菌接種環(huán)接種于增菌培養(yǎng)基；組織樣品直接取少許加入增菌培養(yǎng)基，于細菌培養(yǎng)箱中 37 培養(yǎng) 18 h24 h。用于寄生蟲檢測：稱取 1 g 糞

16、便于燒杯中，用于形態(tài)學(xué)檢測。病原檢測病毒檢測電鏡檢查將采集的糞便或腸內(nèi)容物用 PBS 制成1:4懸液，于盛有玻璃珠的管內(nèi)充分震蕩30 min，取懸液3000 r/min離心30 min，取上清，15000 r/min離心30 min，取上清，以40000 r/min50000 r/min離心3 h 5 h，棄上清，加12滴蒸餾水懸浮管內(nèi)沉淀，滴加銅網(wǎng)，2%磷鎢酸染色，電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。病毒分離鑒定將處理的樣品接種適宜細胞（MA104 細胞、MDBK 細胞、HRT-18 細胞）進行病毒分離培養(yǎng)，根據(jù)中和試驗（固定血清-稀釋病毒法）進行病毒鑒定。PCR 檢測5應(yīng)用普通或熒光定量PCR/RT-

17、PCR方法進行病原核酸檢測。采用常繼濤文章“牛輪狀病毒病原流行病學(xué)調(diào)查、基因重配毒株的構(gòu)建及二價減毒株的免疫原性評價”中BRV 引物序列： BRV-VP6-F ： GACGGAGCGACTACATGGT； BRV-VP6-R：GTCCAATTCATACCTGGTGG；采用常繼濤等人文章“載牛冠狀病毒 N蛋白殼聚糖微球的免疫效果評價”中BcoV引物序列：BCoV-N-F：GCAATCCAGTAGTAGAGCGT； BCoV-N-R： CTTAGTGGCATCCTTGCCAA ； 采用彭雪松論文 “ BVDV 基因分型檢測方法的建立及應(yīng)用” BVDV-F ： TAGCCATGCCCTTAGTAGG

18、AC；BVDV-R：CTCCATGTGCCATGTACAGCA。細菌檢測細菌分離將采集的糞便或組織樣品，用相應(yīng)細菌培養(yǎng)基培養(yǎng)。大腸桿菌用伊紅美藍瓊脂或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)；沙門菌用SS培養(yǎng)基、HE 瓊脂培養(yǎng)基或去氧膽鹽鈉-枸櫞酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)；副結(jié)核分枝桿菌初代分離困難，在病變腸段及腸淋巴結(jié)分離率較高，可先用4% H2SO4 或 2% NaOH處理，再用Dubods培養(yǎng)基上或HEYM培養(yǎng)基培養(yǎng)。染色鏡檢將分離純化的大腸桿菌和沙門菌進行革蘭染色，副結(jié)核分枝桿菌可用抗酸染色法，顯微鏡下觀察細菌形態(tài)。大腸桿菌和沙門菌鏡下為粉紅色桿菌，副結(jié)核分支桿菌鏡下可觀察到呈單個或分支狀排列的紅色細長桿菌。將分離純

19、化的菌用相應(yīng)的生化鑒定管進行生化特性鑒定，根據(jù)伯杰細菌手冊統(tǒng)計結(jié)果。也可用全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進行鑒定。血清學(xué)鑒定致病性大腸桿菌血清學(xué)鑒定按照GB 4789.6對致病性大腸桿菌進行血清學(xué)鑒定及結(jié)果判定。沙門菌血清學(xué)鑒定按照GB 4789.4對沙門菌進行血清學(xué)鑒定及結(jié)果判定。分子檢測致病性大腸桿菌 PCR 檢測按照GB 4789.6對致病性大腸桿菌進行PCR檢測及結(jié)果判定。沙門菌 PCR 檢測根據(jù)沙門菌毒力基因inv A設(shè)計引物。參考李文豪論文“呼和浩特牛腹瀉部分細菌性病原檢測及三重PCR檢測方法的建立”中的引物序列：F：CACGCTCTTTCGTCTGGCATTA；R：TAGACAGGGC

20、GGAGGACAAATC。副結(jié)核分枝桿菌 PCR 檢測按照GB/T 27637對副結(jié)核分枝桿菌進行PCR檢測及結(jié)果判定。7.2.5.3 寄生蟲檢測6生化鑒定飽和鹽水漂浮法配制飽和鹽水，稱取1 g糞便于燒杯中，加入12 mL29 mL的飽和鹽水，飽和鹽水于管口形成凸液面，載玻片蓋在管口30 min，顯微鏡下觀察球蟲卵囊形態(tài)并計數(shù)。直接涂片染色將糞便涂片，室溫滴加10% NaOH 1 min后水洗，采用金胺-酚改良抗酸復(fù)染法進行染色鏡檢。顯微鏡下觀察隱孢子蟲卵囊形態(tài)。分子檢測用特異性引物進行病原的普通或熒光定量 PCR 檢測。采用王曉丹論文“牛腹瀉部分寄生蟲性病原檢測方法的建立及應(yīng)用” 中球蟲引物序列： ITS-2-F ： TGAAGAGCTGTGATGGCGTT ， ITS-2-R ： TTCTCTTTTGATTGCGTTGCT； 隱孢子蟲參照GB/T 35942進行PCR