1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)In situ hybridization final edition第一部分：1 固定（第一天，下午）用DEPC水配制8%多聚甲醛（粉末）（作為儲備液，4C可保存1月）：多聚甲醛（粉末）8g，溶解于100ml DEPC水中，60C孵育30min（此時多聚甲醛不溶）；加入10N NaOH 15ul，調(diào)節(jié)pH值于7.4左右，用手振蕩，多聚甲醛將快速溶解；用8%多聚甲醛儲備液和PBS緩沖液配制4%多聚甲醛：8%多聚甲醛儲備液50ml、10PBS（DEPC配制）10ml、DE

2、PC水40ml（4%的多聚甲醛作為工作液在1周內(nèi)使用）；將組織塊放置于10體積的4%多聚甲醛溶液中固定1-2h（室溫），其間緩慢搖動，4C放置過夜（16h，其間緩慢搖動）。注意：固定時，一定要保證多聚甲醛和材料中水分的充分交換，否則會造成材料不能很好固定！2 脫水（第二天，早晨）：按下列順序?qū)Σ牧线M(jìn)行脫水：1 PBS (DEPC) 5min 2次70%乙醇(DEPC) 5min 80%乙醇(DEPC) 5min90%乙醇(DEPC) 5min100%乙醇 5min (脫水時間應(yīng)隨組織的體積大小適當(dāng)變化)100% 乙醇 -30C過夜！注意：脫水時間的長度長一點(diǎn)不會對材料造成太大影響，但若脫水時間

3、不夠，用二甲苯透明的時候會讓二甲苯渾濁，不能進(jìn)行很好的置換，直接影響包埋效果！3包埋（包埋的時間依據(jù)材料的大小而定）：將材料轉(zhuǎn)移到100%乙醇中，室溫放置 15min；再次在100%乙醇中放置 10-15min；100%乙醇/二甲苯 30min二甲苯浸泡 30min2次；注意：二甲苯浸泡時間不確定，依據(jù)為材料透明即可。如若透明時間過長，會使材料過脆，包埋好的材料在切片時會破碎！二甲苯/石蠟 30min石蠟 30min 石蠟 40min根據(jù)常規(guī)包埋方法進(jìn)行包埋。注意：包埋過程中，二甲苯一定要脫干凈，否則也會使材料變脆！因此在III蠟中放置的時間可以酌情延長，依據(jù)材料的體積而定。Note：組織過大

4、，二甲苯未能使材料內(nèi)的部分透明，切片時，此處材料會脫落，造成空洞?？煞窨紤]100%乙醇/二甲苯浸泡時間稍微延長！？4 組織切片：注意：切片材料為全魚或者去除內(nèi)臟的幼魚片段時，骨骼（尤其是脊柱）會損傷切片刀片，造成切片脆裂或者切痕，在展片時，材料會破裂。因此，在切片時，一旦發(fā)現(xiàn)材料破碎或者出現(xiàn)刀痕，必須將切片刀片橫移，避開刀片缺口！切片厚度應(yīng)為5-8um；應(yīng)同時準(zhǔn)備一些該材料的組織切片用于HE染色；組織切片時為避免RNase污染，應(yīng)保持使用無粉手套和DEPC水，切片完全干燥后應(yīng)保存于4C。貼片，展片：所用已經(jīng)coating的玻片一般只使用遠(yuǎn)離書寫端1/3處。一來可以節(jié)約隨后步驟中使用試劑的量；二

5、來節(jié)約切片材料；三便于封片。展片時，先用滴管將DEPC水在靠近1/3處涂抹很薄一層液體，將彎鉤解剖針挑取單張材料切片（盡可能切割整齊）放于液面（此時，材料將浮于液面，注意不要將切面朝上?。脼V紙將遠(yuǎn)端多余水分吸去一部分（以免過度展片），放置3-5行（視材料寬度而定），于39-42C的展片機(jī)上展片。Slide cleaning：5% Decon 90清洗1h，自來水沖洗2h，蒸餾水沖洗數(shù)次并在200C干燥8h，并用手套將玻片放置于玻片盒中，保存于4C。Poly-L-Lysine coating:用10mM Tris-HCl 緩沖液（pH8.0）配制50ug/ml 多聚賴氨酸溶液，并向無RNas

6、e的玻片上滴加多聚賴氨酸溶液，37 干燥24 h。第二部分 探針制備:將目的基因的cDNA或ORF插入到pGEM-T Easy載體（Promega，或者其他帶有T7和SP6 RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的載體），提取質(zhì)粒DNA，并測序驗(yàn)證；測序驗(yàn)證后，挑選含所需插入方向的質(zhì)粒，用T7和SP6結(jié)合位點(diǎn)外圍的前后引物擴(kuò)增包含T7和SP6結(jié)合位點(diǎn)和目的片段的線性DNA；PCR產(chǎn)物的純化和定量；0.5-1ug PCR產(chǎn)物用于T7和SP6的體外轉(zhuǎn)錄（制備探針）：T7的轉(zhuǎn)錄效率比SP6高，一般用T7合成反義鏈，而SP6合成正義鏈探針；如果可能，直接將欲作為合成探針的模板克隆入pGEM-T載體中，然后通過PCR合成

7、轉(zhuǎn)錄模板?？寺∪肫胀▉喛寺≥d體（如：pMD-19T）中，然后 用T7-M13和SP6-M13-引物成模板后，轉(zhuǎn)錄的效果不是太好！0.5-1ug PCR product? l10X DIG RNA labeling mix2 l10X Transcription buffer2 lT7 or SP6 polymerase (20U/l)2 l（共40U）RNase inhibitor (40U/l)1l（共40U）DEPC DW? l總體積20 l混合并離心;37C溫育2-3h；加入DNase I (RNase free) (10U/ul) 2ul，混合并離心；37C溫育15min；加入50ul

8、 100% 乙醇 (2.5體積), 2ul (1/10體積) NaAC；渦旋混勻，在-20C 放置2-6h或者過夜；4C，14000rpm離心30min；用70% DEPC乙醇洗一次；4C，14000rpm離心15min；移去乙醇并室溫放置5min使乙醇揮發(fā)；加入50 ul DEPC水和1ul RNase 抑制劑； 使用前測量 RNA 探針濃度（Sp6, 100ng/ul; T7, 400ng/ul）探針可在-80C 保存 1月化將目的片段/ORF插入到pMD-19T載體中，挑選一定插入方向的克隆，用T7-M13和SP6-M13-引物擴(kuò)增目的片段，使其帶上T7和SP6的啟動子序列。電泳純后，作

9、為RNA探針合成的模板！一張用于原位雜交的切片一般需要加入200ul左右的探針！注意：這種方法合成出的模板，是否能很好合成RNA探針，還需要深入的證明！第三部分：in situ hybridization第一天：雜交同時準(zhǔn)備正義探針（T7）和反義探針（SP6）。復(fù)水二甲苯 5min3次（如近期再次實(shí)驗(yàn)，試劑可反復(fù)利用）100% 乙醇 1-5min2次90% 乙醇 1min80% 乙醇 1min70% 乙醇 1min 0.85 X PBS-1 5min0.85 X PBS-2 5min 0.85 X PBS-3 5min37C蛋白酶K 4-10ug/ml (從20mg/ml儲備液稀釋)處理5-1

10、5min (成魚卵巢，15min; 幼魚卵巢，10min；胚胎，稚魚，精巢5min) (Tilapia幼魚和成魚 用蛋白酶K（10ug/ml）處理5min即可Kobayashi!)；0.85X PBS洗5min；4%多聚甲醛在室溫中再次固定15min；2mg/ml 甘氨酸(蛋白酶K的抑制劑？從甘氨酸儲備液20mg/ml稀釋)室溫處理15min；0.1M TEA (三乙醇胺) (50% TEA 2.65ml+ 2N HCL 1.05 ml +DEPC 100ml)處理5min (dilute from stock before using)室溫；0.25% 乙酸苷/ 0.1M三乙醇胺（用前向0.

11、1M TEA中加入乙酸苷) 10min，(100ml 0.1M TEA+ 250ul acetic anhydride)室溫；2 X SSC 5min RT預(yù)雜交：66%去離子甲酰胺/2 X SSC，60C孵育1h（在染缸中進(jìn)行）；本實(shí)驗(yàn)時原位雜交一般使用液體體積為70-80ml，高度以剛好淹沒材料為準(zhǔn)。50 ml 預(yù)雜交液:去離子甲酰胺: 33ml20XSSC (DEPC) 5mlDEPC水 12ml60C-65C于雜交緩沖液中雜交14-16hr (濕盒中進(jìn)行，可在其中加入預(yù)雜交液，以保證雜交過程中雜交體系不會干)。然后將濕盒封閉，避免在高溫下，盒內(nèi)濕度下降。一張用于原位雜交的切片一般需要加

12、入200ul左右的探針！(Save probe for re-use if the probe is OK!)Note：所有在高于室溫下進(jìn)行的濕盒中反應(yīng)，均需將濕盒封閉！Hybridization buffer: Final concentrationto prepare 10mlFormamide60%6ml1.0M Tris-HCL (pH: 8.0)0.02M200ul0.5M EDTA (pH: 8.0)0.0025M50ul100Xdenhardts solution1X100ulNaCl（2.5M）0.3M1.2ml50% dextran sulfate7.5%1.5mlDEPC

13、treated DWX950ulKeep the hybridization buffer at -20CPrepare the hybridization solution: Probe with final concentration 200-500ng/mltRNA (20mg/ml) 1ul/mlHybridization buffer According to the number of your slides Water bath at 80C for 10min to denature RNA probe Load the hybridization solution with

14、probe to slides.第二天：Wash and staining (從這一步開始，溶液可以用蒸餾水進(jìn)行配制，無需DEPC)Washing（rinse）：1)50% formamide/2XSSC 55C60C 20min 2)50% formamide/2XSSC 55C60C 20min （用20XSSC配置，切勿用2XSSC直接配置！）3)2XSSC 37C 10min 4)RNase treatment RNase/2XSSC 100g/ml (RNase A的濃度應(yīng)為 10-100ug/ml) (RNase專用濕盒)5)2XSSC 60C 20min 6)0.2XSSC 60

15、C 20min Note: Please increase the time and times of washing if the background is very high.染色:1）DIG1 洗滌 室溫 5min DIG1 bufferFinal concentration for 300mlMaleic acid 0.1M 3.48g NaCL 0.15M 2.63gpH to 7.5Add D.W. to 300 mlAutoclave注意：根據(jù)羅氏說明書，未稀釋抗體保存于4C，可放置至產(chǎn)品失效日期；稀釋后的抗體，在4C僅能保存12h。切忌凍存！2）DIG2 封阻(DIG1中加入

16、1% 封阻劑（BSA）) 30min 室溫 (Chamber3)3）Anti-DIG-AP is diluted by 50010000 times in DIG2 （最好依據(jù)產(chǎn)品說明書稀釋2000-5000倍，即使抗體的量較少，也可通過延長顯色時間進(jìn)行調(diào)整） 30min 室溫 (Chamber3) (稀釋后的抗體可重復(fù)使用!) 4）DIG1洗滌 15min35）DIG3檢測 15min DIG3 (緩沖液+底物)：Total 30ml1M Tris-Hcl pH 9.5 3ml5M NacL 0.6ml1M MgCL2 1.5mlDEPC 24.9ml（呈色緩衝液（staining buff

17、er）100mM Tris, pH=9.550mM MgCl2100mM NaCl0.05% Tween20其餘補(bǔ)3次過水(3d H2O)。）To avoid the diffusion of NBT and BCIP, add 5-8% (w/v) vinyl alcohol to DIG3 and heat to 80-90 degree in water bath to completely dissolve it. Cool down and add NBT and BCIP (Always keep DIG3 with vinyl alcohol in room temperature.) NBT 150lBCIP 112.6l觀察：DIG3染色30min后，鏡檢！如果信號足夠強(qiáng)，用Tris-HCL-EDTA (pH 8.0)終止染色；50% 乙醇室溫洗滌5min100% 乙