1、關(guān)于熒光定量原理與應(yīng)用第二版第一張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月提綱 PCR簡(jiǎn)介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介定量方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介：第二張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR概念什么是PCR？Polymerase Chain Reaction (PCR)聚合酶鏈反應(yīng)是在體外選擇性的擴(kuò)增特定DNA片段的方法。第三張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Classic PCR第四張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Classic PCR第五張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR 循環(huán)第一步 加熱變性、雙鏈打開(kāi)第二步退火、引物與單鏈結(jié)合第三步 -

2、 引物延伸變?yōu)閮蓚€(gè)雙鏈DNA第六張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第七張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常規(guī)PCR常規(guī)PCR技術(shù)：PCR后借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析S1 S2 MDNA Engine第八張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月提綱 PCR簡(jiǎn)介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介 定量方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介：第九張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月定量PCR定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析IQ5 Real-time PCR儀第十張，PP

3、T共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR反應(yīng)混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA多聚酶引物模板DNA或緩沖液熒光物質(zhì)第十一張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月提綱 PCR簡(jiǎn)介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介定量方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介：第十二張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 SYBR Green 1 TaqMan熒光化學(xué)第十三張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green ISYBR Green 1第十四張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green I 工作原理 SYBR Green 1 結(jié)合到雙鏈DNA的

4、小溝部位 SYBR Green 1染料結(jié)合狀態(tài)時(shí)熒光強(qiáng)度是非結(jié)合狀態(tài)的800-1000倍GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第十五張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green I第十六張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green I第十七張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green I第十八張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月與傳統(tǒng)PCR的比較實(shí)現(xiàn)了初始模板的絕對(duì)定量檢測(cè)靈敏度高可以檢測(cè)到低拷貝的目的基因可以區(qū)分微小的拷貝數(shù)差異可以對(duì)初始模板含量差異較大的樣品同時(shí)定量省時(shí)省力檢測(cè)設(shè)計(jì)靈活第十九張，PPT共五

5、十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Melt Curve Analysis第二十張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Melt Curve Analysis第二十一張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green I 優(yōu)點(diǎn) 使用方便 - 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的熒光探針 沒(méi)有序列特異性 - 可以用于不同的模板 便宜 靈敏第二十二張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green I 缺點(diǎn) 與非特異性產(chǎn)物結(jié)合第二十三張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月TaqMan探針熒光素淬滅劑TaqMan水解型雜交探針第二十四張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月TaqMan 目標(biāo)特異性探針 5為熒

6、光素， 3為淬滅劑5 熒光素3淬滅劑與目標(biāo)序列互補(bǔ)第二十五張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月TAQMAN Probes第二十六張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月TAQMAN Probes第二十七張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月TAQMAN Probes第二十八張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月TAQMAN Probes第二十九張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月TaqMan優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性 -特別適合于SNP檢測(cè)第三十張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月TaqMan缺點(diǎn) 價(jià)格較高 只適合于一個(gè)特定的目標(biāo) 不能進(jìn)行融解曲線分析 背景高第三十一張，PP

7、T共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月兼容化學(xué)試劑總結(jié)結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中發(fā)夾型雜交探針?biāo)庑碗s交探針（5-3外切）延伸復(fù)性任何步驟定量和檢測(cè)目標(biāo)基因融解曲線分析SNP分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因SNP分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因信號(hào)檢測(cè)工作原理有否淬滅劑化學(xué)試劑否有有主要應(yīng)用范圍第三十二張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月熒光曲線 隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖第三十三張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月定量原理 如何對(duì)起始模板定量？ 通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析 引入兩個(gè)概念： 熒光閾值、

8、Ct值第三十四張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月定量原理熒光閾值在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))閾值線第三十五張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Ct值的概念定量原理Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物(熒光信號(hào)）到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t) 值C(t) 值18.12 +/0.04-閾值線第三十六張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月提綱 PCR簡(jiǎn)介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介定量方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介：第三十七張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 絕對(duì)定量 確定初始模板的準(zhǔn)確含量 需要標(biāo)準(zhǔn)曲線 相對(duì)定

9、量 確定樣品間初始模板的含量倍數(shù)差異 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 不使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Ct值計(jì)算 Ct方法 Ct方法（看家基因） Pfaffl方法（考慮擴(kuò)增效率） Vandesompele方法（多看家基因）14500 copies定量方法 第三十八張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月借助標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值反推出其初始量得到未知樣品初始量絕對(duì)值unknown104103Unknown contains 3108 copies絕對(duì)定量第三十九張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 CT 法相對(duì)定量 無(wú)均一化處理 均一化依賴于加樣的一致性相對(duì)定量CT Sample1 Ct1 (25) Sampl

10、e2 Ct2 (22)CT=Ct1-Ct2 =25-22=3基因表達(dá)量Sample1/Sample2=2 CT= 2-3=1/8第四十張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月相對(duì)定量CTCT法相對(duì)定量 考慮到了加樣誤差 通常使用看家基因來(lái)完成均一化處理Sample1 Ct1(25) Sample2 Ct2(22)內(nèi)參基因 actin Ct 01 20 Ct02 21CT1= Ct1-Ct01=25-20=5 CT2=Ct2-Ct02=22-21=1CT= CT1- CT2=5-1=4基因表達(dá)量Sample1/sample2=2- CT=2-4=1/16第四十一張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022

11、年6月SimpleComplex 2CT 假定目的基因與看家基因的 擴(kuò)增效率都是100% 只有一個(gè)看家基因 Pfaffl Modification 考慮到擴(kuò)增效率的影響 只有一個(gè)看家基因 Vandesompele Method 考慮到擴(kuò)增效率的影響 有多個(gè)看家基因相對(duì)定量第四十二張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 利用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，定量結(jié)果相除得到倍數(shù)差別 同時(shí)建立兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線 一條目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線 至少再做一條看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線 借助標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)擴(kuò)增效率的影響 使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)定量分析相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線法 第四十三張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 進(jìn)行可靠的定量實(shí)驗(yàn)需

12、要對(duì)引物對(duì)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì) 用于優(yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量和特異性的參數(shù) 引物設(shè)計(jì) 擴(kuò)增片段選擇 試劑的濃度 循環(huán)條件 變性溫度和退火溫度PCR體系優(yōu)化第四十四張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月利用動(dòng)態(tài)溫度梯度功能一次實(shí)現(xiàn)退火溫度的優(yōu)化退火溫度的優(yōu)化第四十五張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月45oC55oC65oC溶解曲線擴(kuò)增曲線1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. 83oC for 1 sec6. Plate Read7. Go to li

13、ne 2 39 more times8. Melting curve from 65oC to 95oC, readevery 0.2oC, hold 1 sec.退火溫度的優(yōu)化第四十六張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用定量： DNA定量 RNA定量定性： SNP分析 基因型分析 RNA變異分析 融解曲線分析 第四十七張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月定量PCR應(yīng)用I-實(shí)時(shí)定量 病原體定量檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)DNA定量拷貝數(shù)研究（替代Southern Blot）RNA定量基因表達(dá)差異（替代Northern Blot) 單個(gè)或多個(gè)基因地表達(dá)譜分析 不同組織、器官 不同時(shí)期 不同處理第四十八張，PPT共五十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月定