1、1* 有限公司驗證文件純化水微生物限度檢查法驗證方案題目：純化水微生物限度檢查法驗證方案編號： VDP-JY-010-01-1共頁第頁起草： 日期：審核： 日期：批準： 日期：頒發(fā)部門：質(zhì)量部生效日期：分發(fā)部門：工程設(shè)備部、質(zhì)量部純化水微生物限度檢查法驗證方案起草、審核、批準：起草人： 起草日期：審核人： 審核日期：批準人： 批準日期：頒發(fā)部門：質(zhì)量部分發(fā)部門：質(zhì)量部驗證組織：驗證小組名稱：純化水微生物限度檢查法驗證方案驗證小組組長質(zhì)量部經(jīng)理負責組織、實施組員1QC主管負責驗證方案的起草 負責檢測數(shù)據(jù)的復核 負責出具檢驗報告2QA主管負責驗證方案的確認 負責方法評價3微生物限度檢驗員負責測試操

2、作和操作原始記錄1. 驗證目的驗證人員職責參照標準驗證項目內(nèi)容評價合格標準驗證試驗材料驗證實施計劃菌液制備供試液制備計數(shù)方法驗證控制菌檢查方法驗證驗證結(jié)論和評價 純化水微生物限度檢查法驗證方案1. 驗證目的：純化水微生物限度試驗采用薄膜過濾法檢查。確認該方法適合于純化水細菌、霉菌及酵母菌數(shù)測定，控制菌的測定。2驗證人員職責驗證領(lǐng)導小組：1、 1 負責驗證方案及報告的批準1、 2 組織協(xié)調(diào)驗證工作1、 3 簽發(fā)驗證證書。. 項目驗證小組長負責驗證方案的起草負責驗證的協(xié)調(diào)工作，以保證本驗證方案的順利實施。負責驗證報告的起草。負責再驗證周期的確認。3. 質(zhì)量部3.1. 負責驗證方案審核3.2. 負責

3、取樣及對樣品的檢驗3.3. 負責收集驗證記錄，并加以分析后，協(xié)助項目驗證小組長起草驗證報告。3.4. 負責驗證數(shù)據(jù)及結(jié)果的審核參照標準：2010版中國藥典一部附錄XIII 微生物限度檢查法。驗證項目內(nèi)容：細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，控制菌檢查方法驗證。評價合格標準：試驗組的菌回收率和稀釋劑對照組的菌回收率均不得低于70%。驗證試驗材料：被驗證產(chǎn)品：品名 純化水 取樣點： ( 1) 4T/h 純水系統(tǒng)二級反滲透裝置進純水箱口;(2) 4T/h 純水系統(tǒng)液體制劑二樓潔具間用水點；4T/h 純水系統(tǒng)三樓固體制劑純水箱總回水口。檢驗量5ml /次儀器設(shè)備：YX.400A 電熱蒸汽壓力消毒器YS

4、840凈化工作臺101型電熱干燥箱SPX-250B型生化培養(yǎng)箱YX-DUS-X 型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱303A-4型電熱培養(yǎng)箱天平稀釋劑：PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液；0.9%的無菌氯化鈉溶液驗證用培養(yǎng)基名稱批號生產(chǎn)廠家營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基驗證用菌株：驗證菌株代號（代數(shù)）來源培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間 （小時）大腸埃希菌營養(yǎng)肉湯30 35金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯30 35枯草芽孢桿菌營養(yǎng)肉湯30 35白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基23 28黑曲霉菌改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基23 287、驗證設(shè)施計劃序號項目確認名稱實施負責人起始和完成日期1細菌、霉菌及酵

5、母菌計數(shù)方法驗證2驗證結(jié)果評定、驗證周期確認、驗 證報告和發(fā)放驗證證書菌液制備.大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌懸液的制備取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮斜面培養(yǎng)物1 白金耳接種至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35培養(yǎng)1824小時。取經(jīng)35 36培養(yǎng)1824小時的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、與枯草芽孢桿菌營養(yǎng)肉湯新鮮培養(yǎng)物1ml 加入到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-610-7約為50100cfu ml 的菌懸液備用。白色念珠菌、黑曲霉菌懸液的制備取白色念珠菌的新鮮斜面培養(yǎng)物1 白金耳接種至10ml 改良馬丁培養(yǎng)基中，25培養(yǎng)2448小時。取培養(yǎng)物1ml

6、，加入9%滅菌生理鹽水9ml，混勻，10倍稀釋至10-510-6細菌數(shù)約50100cfu ml 的菌懸液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25培養(yǎng)57 天至大量孢子產(chǎn)生。加0.9%無菌氯化鈉溶液10ml 將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液，加入蒙有滅菌紗布的無菌試管中。取此孢子懸液1ml 加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，逐管10倍稀釋至10-5 約為50100cfu ml 的菌懸液備用。.供試品制備供試品名稱及取樣點：純化水 取樣點( 1) 4T/h 純水系統(tǒng)二級反滲透裝置進純水箱口;(2) 4T/h 純水系統(tǒng)液體制劑二樓潔具間用水點；(3) 4T/h 純水系統(tǒng)三樓固體制劑

7、純水箱總回水口。方法建立：2010版中國藥典規(guī)定純化水微生物限度試驗采用薄膜過濾法檢查。但沒規(guī)定取樣量,由于所使用的濾膜孔徑不大于0.45um ， 直徑為 50mm, 規(guī)定每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100 個。如果取樣量過大,樣品含菌量較多,就會造成細菌不宜分散, 點計困難 ; 如果取樣量過少,不能有效反映樣品染菌量。為此采用每張濾膜取樣品5ml。.計數(shù)方法驗證試驗組 取純化水5ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，用PH7.0氯化鈉 -蛋白胨緩沖液沖洗濾膜3 次，每次100ml，在最后一次的沖洗液中分別加入上述的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液(50 100cfu/

8、ml)各1ml，平行兩張濾膜，過濾后，取濾膜，將其菌面朝上貼于相應(yīng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。菌液組大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌分別取1ml 面液分別注入平皿中，并立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每個面液分別制備二個平皿，置35 36培養(yǎng)24小時；白色念珠菌、黑曲霉分別取1ml 面液分別注入平皿中，并立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每個面液分別制備二個平皿，置24 25培養(yǎng)48 小時。菌落計數(shù)結(jié)果(2 個平皿計數(shù)取平均值)見下表cfu ml)試驗次數(shù)10-5稀釋10-6稀釋10-7稀釋12122大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉供試品對照組取純化水5ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，用0.9%

9、無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3 次，每次100ml，平行兩張濾膜，過濾后，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。細菌、霉菌及酵母菌各制備2 個平皿，測定供試品本底菌數(shù)。. 稀釋劑試驗組取 0.9%無菌氯化鈉溶液300ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，每次100ml，在最后一次的沖洗液中分別加入上述的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液(50 100cfu/ml)各1ml，平行兩張濾膜，過濾后，取濾膜，將其菌面朝上貼于相應(yīng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。.稀釋劑對照組取 0.9%無菌氯化鈉溶液300ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，平行兩張濾膜，減壓抽干后,取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng)基平

10、板上培養(yǎng)，平行制備2 個平皿，置適宜溫度培養(yǎng)48 72h，觀察結(jié)果，測定菌數(shù)。. 結(jié)果見附表11、控制菌檢查方法驗證(常規(guī)法)11.1 試驗組 取純化水5ml， 以無菌操作加入過濾器內(nèi)，用 PH7.0氯化鈉 -蛋白胨緩沖液， 沖洗濾膜3 次， 每次100ml， 在最后一次的沖洗液中分別加入上述的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液(50 100cfu/ml )各1ml，平行兩張濾膜，過濾后，取濾膜，接入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml 中，按相應(yīng)控制菌檢查法進行檢查。試驗結(jié)果：上述試驗組檢出試驗菌，按此控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查。故可按常規(guī)法進行控制菌檢查。12

11、 驗證結(jié)論和評價根據(jù)驗證試驗結(jié)果，純化水微生物限度檢查按照2010 版中國藥典二部附錄XIII 微生物限度檢查法檢驗，細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)可采用薄膜過濾法檢查。附表1：獨立試驗一：各試驗組菌落計數(shù)（回收率%）取樣點 ：試驗時間年 月 日完成時間年 月 日驗證菌株平皿號菌液組菌落數(shù)（cfu）供試品對照組菌落數(shù) （cfu）試驗組菌落數(shù)（cfu）稀釋劑對照組菌落數(shù) （cfu）試驗組菌回收率 （%）稀釋劑對照組菌回收率 （%）大腸埃希菌 （培養(yǎng)48小時計數(shù)）12平均值金黃色葡 萄球菌（ 培養(yǎng) 48 小時計數(shù) ）12平均值枯草芽孢桿菌（培養(yǎng)48 小時計數(shù)）12平均值白色念珠菌 （培養(yǎng)72小時計數(shù)）12

12、平均值黑曲霉（ 培養(yǎng) 72 小時計數(shù) ）12平均值結(jié)論：本次試驗各試驗組的菌回收率和各稀釋劑對照組的菌回收率均不低于70%,按標準規(guī)定 , 本次試驗結(jié)果符合規(guī)定。復核人 （簽名）：試驗人（簽名）：附表2： 獨立試驗二：各試驗組菌落計數(shù)（回收率%）取樣點 ：試驗時間年 月 日完成時間年 月 日驗證菌株平皿號菌液組菌落數(shù)（cfu）供試品對照組菌落數(shù) （cfu）試驗組菌落數(shù)（cfu）稀釋劑對照組菌落數(shù) （cfu）試驗組菌回收率 （%）稀釋劑對照組菌回收率 （%）大腸埃希菌 （培養(yǎng)48小時計數(shù)）12平均值金黃色葡 萄球菌（ 培養(yǎng) 48 小時計數(shù) ）12平均值枯草芽孢桿菌（培養(yǎng)48 小時計數(shù)）12平均值

13、白色念珠菌 （培養(yǎng)72小時計數(shù)）12平均值黑曲霉（ 培養(yǎng) 72 小時計數(shù) ）12平均值結(jié)論：本次試驗各試驗組的菌回收率和各稀釋劑對照組的菌回收率均不低于70%,按標準規(guī)定 , 本次試驗結(jié)果符合規(guī)定。復核人 （簽名）：試驗人（簽名）：附表3： 獨立試驗三： 各試驗組菌落計數(shù)（回收率%）取樣點 ：試驗時間年 月 日完成時間年 月 日驗證菌株平皿號菌液組菌落數(shù)（cfu）供試品對照組菌落數(shù) （cfu）試驗組菌落數(shù)（cfu）稀釋劑對照組菌落數(shù) （cfu）試驗組菌回收率 （%）稀釋劑對照組菌回收率 （%）大腸埃希菌 （培養(yǎng)48小時計數(shù)）12平均值金黃色葡 萄球菌（ 培養(yǎng) 48 小時計數(shù) ）12平均值枯草芽

14、孢桿菌（培養(yǎng)48 小時計數(shù)）12平均值白色念珠菌 （培養(yǎng)72小時計數(shù)）12平均值黑曲霉（ 培養(yǎng) 72 小時計數(shù) ）12平均值結(jié)論：通過三次獨立試驗,證明所采用的供試液制備方法及薄膜過濾法適合于純化水細菌、霉菌及酵母菌數(shù)測定。復核人 （簽名）：試驗人（簽名）：有限公司驗證文件純化水微生物限度檢查法驗證報告題目：純化水微生物限度檢查法驗證報告編號： VDP-JY-010-01-2共頁第頁起草： 日期：審核： 日期：批準： 日期：頒發(fā)部門：質(zhì)量部生效日期：分發(fā)部門：1、驗證目的2、參照標準3、驗證項目內(nèi)容4、評價標準5、 驗證實施時間6、驗證方法7、驗證結(jié)論和評價一、驗證目的根據(jù)中國藥典2010 年

15、版的要求，純化水微生物限度試驗采用薄膜過濾法檢查。為了確認該方法適合于本公司純化水細菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)測定，控制菌的測定。特對此檢測方法進行驗證。二、參照標準中國藥典2010 版二部附錄微生物限度檢查法。三、驗證項目內(nèi)容細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證，控制菌的驗證。四、評價標準試驗組的菌回收率和稀釋劑對照組的菌回收率均不得低于70%。五、驗證實施我們項目驗證小組從（ 微生物限度檢驗室完成驗證時間開始） 開始，進行各種菌液、供試液的制備，開始驗證工作。1、菌液制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌懸液的制備取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮斜面培養(yǎng)物1 白金耳接種至10

16、ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35培養(yǎng)1824小時。取經(jīng)35 36培養(yǎng)1824小時的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、與枯草芽孢桿菌營養(yǎng)肉湯新鮮培養(yǎng)物1ml 加入到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-610-7約為50100cfu ml 的菌懸液備用。白色念珠菌、黑曲霉菌懸液的制備取白色念珠菌的新鮮斜面培養(yǎng)物1 白金耳接種至10ml 改良馬丁培養(yǎng)基中，25培養(yǎng)2448小時。取培養(yǎng)物1ml，加入9%滅菌生理鹽水9ml，混勻，10倍稀釋至10-510-6細菌數(shù)約50100cfu ml 的菌懸液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25培養(yǎng)57 天至大量孢子產(chǎn)生。加0.9%無菌氯化

17、鈉溶液10ml 將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液，加入蒙有滅菌紗布的無菌試管中。取此孢子懸液1ml 加到 9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，逐管10倍稀釋至10-5 約為50100cfu ml 的菌懸液備用。2.供試品制備供試品名稱及取樣點：純化水 。取樣點(1) 4T/h 純水系統(tǒng)二級反滲透裝置進純水箱口 ;(2) 4T/h 純水系統(tǒng)液體制劑二樓潔具間用水點；(3) 4T/h 純水系統(tǒng)三樓固體制劑純水箱總回水口。按照驗證方案，采用每張濾膜取純化水5ml。六、驗證方法(一) 、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法1 、試驗組取純化水5ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜 3 次，每次

18、100ml，在最后一次的沖洗液中分別加入上述的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液(50 100cfu/ml)各1ml，平行兩張濾膜，過濾后，取濾膜，將其菌面朝上貼于相應(yīng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。計數(shù)。2、菌液組大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌分別取1ml 面液分別注入平皿中，并立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每個面液分別制備二個平皿，置35 36培養(yǎng)24小時；白色念珠菌、黑曲霉分別取1ml 面液分別注入平皿中，并立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每個面液分別制備二個平皿，置24 25培養(yǎng)48 小時。菌落計數(shù)結(jié)果(2 個平皿計數(shù)取平均值)見下表cfu ml)試驗次數(shù)10-5 稀釋1

19、0-6 稀釋10-7 稀釋121212大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉供試品對照組取純化水5ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜 3 次，每次100ml，平行兩張濾膜，過濾后，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。細菌、霉菌及酵母菌各制備2 個平皿，測定供試品本底菌數(shù)。. 稀釋劑試驗組取 0.9%無菌氯化鈉溶液300ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，每次100ml，在最后一次的沖洗液中分別加入上述的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液(50 100cfu/ml)各1ml，平行兩張濾膜，過濾后，取濾膜，將其菌面朝上貼于

20、相應(yīng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。.稀釋劑對照組取 0.9%無菌氯化鈉溶液300ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，平行兩張濾膜， 減壓抽干后,取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，平行制備2 個平皿，置適宜溫度培養(yǎng)48 72h，觀察結(jié)果，測定菌數(shù)。.附表(二)控制菌檢查方法驗證(常規(guī)法)試驗組 取 5ml 的純化水，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，用 PH7.0氯化鈉 -蛋白胨緩沖液， 沖洗濾膜3 次， 每次100ml， 在最后一次的沖洗液中分別加入上述的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液(50 100cfu/ml )各1ml，平行兩張濾膜，過濾后，取濾膜，接入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100m

21、l 中，按相應(yīng)控制菌檢查法進行檢查。試驗結(jié)果：上述試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查。故可按常規(guī)法進行控制菌檢查。七、驗證結(jié)論和評價通過三次獨立試驗, 證明所采用的供試液制備方法及薄膜過濾法適合于純化水細菌、霉菌及酵母菌數(shù)測定?？刂凭砂闯Ｒ?guī)法進行檢查。本次驗證各試驗組的菌回收率和各稀釋劑對照組的菌回收率均不低于70%,按標準規(guī)定 , 本次試驗結(jié)果符合規(guī)定。根據(jù)驗證試驗結(jié)果，純化水微生物限度檢查按照2010 版中國藥典二部附錄XIII 微生物限度檢查法檢驗，細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)采用平皿法檢查，符合規(guī)定。附表1：獨立試驗一：各試驗組菌落計數(shù)（回收率%）取樣點 ：試驗時間年 月 日完成時間年 月 日驗證菌株平皿號菌液組菌落數(shù)（cfu）供試品對照組菌落數(shù) （cfu）試驗組菌落數(shù)（cfu）稀釋劑對照組菌落數(shù) （cfu）試驗組菌回收率 （%）稀釋劑對照組菌回收率 （%）大腸埃希菌 （培養(yǎng)48小時計數(shù)）12平均值金黃色葡 萄球菌（ 培養(yǎng) 48 小時計數(shù) ）12平均值枯草芽孢桿菌（培養(yǎng)48 小時計數(shù)）12平均值白色念珠菌 （培養(yǎng)72小時計數(shù)）12平均值黑曲霉（ 培養(yǎng) 72 小時計數(shù) ）12平均值結(jié)論：本次試驗各試驗組的菌回收率和各稀釋劑對照組的菌回收率均不低于70%,按標準規(guī)定 , 本次試驗結(jié)果符合規(guī)定。復核