1、關(guān)于分子生物學(xué)基因治療第一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、基因治療的概念1990人類第一例基因治療獲得成功1966年， Lederberg提出基因治療概念基因治療(gene therapy)：將正常基因植入靶細(xì)胞代替遺傳缺陷的基因,或關(guān)閉、抑制異常表達(dá)的基因，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的一種臨床治療技術(shù)。人類疾病治療的重大突破!與傳統(tǒng)的方法相比較，從根本上消除遺傳病因。第二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、基因治療類型和途徑生殖細(xì)胞基因治療(germinal gene thrapy)體外（ex vivo） 間接基因治療 體細(xì)胞基因治療 ( somatic gene thra

2、py)1、類型2、途徑 體內(nèi)（in vivo） 直接基因治療第三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1、基因矯正：原位修復(fù)缺陷基因原位替換（同源重組）2、基因添加：正?；蚍翘禺惒迦牖蚪M以補償 異常基因的功能缺陷3、基因失活：抑制、關(guān)閉異常表達(dá)的基 因矯正突變?nèi)?、基因治療的策?、重新開放已關(guān)閉的基因第四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、基因治療的方法（一）體細(xì)胞的基因治療方法 2、受體細(xì)胞的選擇 3 、將治療轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi) 4、將帶有目的基因的細(xì)胞重新輸回體內(nèi)體外基因治療時（二）反義技術(shù)（antisense technology)（三）RNA干擾（short inter

3、ference RNA)1、治療基因的制備第五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月五、基因治療的現(xiàn)狀1、一些單基因病的治療 嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷癥（ADA綜合癥）、血友病B、囊性纖維化（CF），苯丙酮尿癥等2、 Bata-地中海貧血病 別醇嘌呤重新開放r基因3、多基因病心血管疾病，糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等4、腫瘤5、其它疾?。篐IV第六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月六、基因治療的問題、前景問題： 1、 穩(wěn)定性 2、安全性 3、導(dǎo)入基因的高效表達(dá) 4、免疫性 5、倫理問題 前景：十分有潛力的技術(shù)，有深遠(yuǎn)的意義 “基因治療作為一項新的治療技術(shù)，將不只限于遺傳病和腫瘤的治療，在可見的將來

4、，它將是臨床上多種疾病可選擇的治療方法。” 第七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用腺苷脫 氨酶基因ADA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷癥（SCID）第八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳病的常規(guī)治療（一）外科治療 矯正畸形、組織和器官移植 （二）內(nèi)科治療 用藥物及飲食治療 1、禁其所忌 酶缺乏不能對底物進行正常代謝 的遺傳病。 2、去其所余 酶缺乏使體內(nèi)貯存過多的“毒物” 所致的遺傳病 促排泄劑或螯合劑 、換血或血漿過濾等 3、補其不足 由于基因缺陷使體內(nèi)缺乏某種酶和蛋白質(zhì)而導(dǎo)致功能喪失的遺傳病。第九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共四十

5、五頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月ACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAAACGTCGGTGCGTCGCTTTGCAGCCACGCAGCGAACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAA突變基因原位修復(fù)突變修復(fù)第十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月帶異?；虻娜旧wDNA分子帶正常基因的外源同源片段同源重組過程第十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月添加正?；虻谑膹?，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月使重新表達(dá)，形成HbF,HbF代償HbA的功能。第十五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作

6、于2022年6月目的基因的制備方法1、從基因組中分離2、化學(xué)合成3、用mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA4、從基因文庫中篩選5、PCR合成第十六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月受體細(xì)胞的選擇 選擇受體細(xì)胞的原則： 1、易于從人體分離又便于輸回體內(nèi) 2、易于接受外源的遺傳物質(zhì) 3、能夠分裂，生命周期長 4、患病的器官或部位。 常用的受體細(xì)胞：骨髓干細(xì)胞 皮膚纖緯細(xì)胞 血管內(nèi)皮細(xì)胞 肝細(xì)胞 淋巴細(xì)胞第十七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月治療基因的轉(zhuǎn)移方法3、腺相關(guān)病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)4、單皰疹病毒(Herpes simplex viruses ,

7、HSV)化學(xué)法 磷酸鈣共沉淀物理法 微粒轟擊、電穿孔法 、顯微注射 脂質(zhì)體法生物法 將病毒（virus)改造成缺陷病毒載體1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（ Retroviruses)2、腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移（ Adenoviruses ）第十八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月脂質(zhì)體法優(yōu)點：易大量制備無致病性細(xì)胞類型多治療過程可控缺點：轉(zhuǎn)化效率不高血循中快速清除(肝巨噬細(xì)胞)第十九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月逆轉(zhuǎn)錄病毒的改造第二十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞過程第二十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于202

8、2年6月逆轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)缺點優(yōu)點：1、能高效率的感染宿主細(xì)胞（100%）2、其宿主范圍廣泛，包括來自不同種的生物和細(xì)胞類型3、被整合的基因在宿主基因組中穩(wěn)定表達(dá)4、用復(fù)制缺陷的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，毒性小缺點：1、只能感染分裂細(xì)胞2、其外源DNA的容量太小3、安全性問題（激活癌基因的潛在性）第二十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月腺病毒感染細(xì)胞的過程第二十四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)缺點優(yōu)點：1、具有較廣的宿主范圍，能感染除造血細(xì)胞以外的幾乎所有細(xì)胞2、可以感染分裂及非分裂細(xì)胞3、能高效地感染宿主細(xì)胞4、外源基因容量大5、安全性較高（不引起癌

9、基因激活）缺點：1、技術(shù)上需進一步改進 2、不整合到人類基因組 腺病毒是基因治療載體的發(fā)展方向。第二十五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1、野生型的AAV為非病原性，其安全性高2、AAV病毒顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定3、應(yīng)用宿主范圍較廣，使用于分裂及非分裂細(xì)胞4、可整合入宿主染色體上，可長期表達(dá)目的蛋白腺相關(guān)病毒載體優(yōu)點：缺點：重組AAV的制作較為繁雜、效率低，滴度 低第二十六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月單皰疹病毒載體優(yōu)點 具有對神經(jīng)元的特異的親和力 可插入的基因片段容量很大，可達(dá)40-50kb缺點 對細(xì)胞有較大的毒性第二十七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月反

10、義技術(shù) 反義技術(shù)（antisense technology)也稱反義寡核苷酸,是指利用人工合成的反義RNA或反義DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，控制細(xì)胞生長的中間階段，使基因不能轉(zhuǎn)錄或翻譯，因而不能合成蛋白質(zhì)，以達(dá)到治療某中疾病的目的。(1)將cDNA導(dǎo)入基因組中，轉(zhuǎn)錄得反義RNA(2)直接輸入反義寡核苷酸二、反義基因技術(shù)（阻斷轉(zhuǎn)錄）類型：1、反義RNA技術(shù)（阻斷翻譯）第二十八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 第二十九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 第三十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)錄阻斷反基因技術(shù)示意圖第三十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第三

11、十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月正常細(xì)胞(無細(xì)胞毒性)胞嘧啶脫氨酶基因erbB-2啟動子5-FC5-FC5-FU(細(xì)胞毒性)腫瘤細(xì)胞腫瘤特異性高表達(dá)因子藥物靶向治療腫瘤細(xì)胞死亡第三十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA干擾（ RNA interference RNAi ) 2003年10大科學(xué)進展-第四 (Science)正常生物體內(nèi)一些小的雙鏈RNA可以抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的小雙鏈RNA (double stranded RNA，dsRNA)時，可以通過促使該mRNA降解來高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致基

12、因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。這些小的雙鏈RNA稱為siRNA (Small/short interfering RNA，siRNA)。第三十四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月RISC: RNA-induced silencing complex RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物第三十五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月RNAi in gene therapy第三十六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療的現(xiàn)狀-1第三十七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022

13、年6月基因治療的現(xiàn)狀-2第三十八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療的現(xiàn)狀-3第三十九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療的現(xiàn)狀-4第四十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療的現(xiàn)狀-5第四十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基因治療的現(xiàn)狀-6第四十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Hemophilia B,FIX function reduced, X-linkedMales to bleed after circumcision第一例臨床實驗中國上海1995-1996年載體AAV自體皮膚成纖維細(xì)胞兩名血友病B患者(兄弟), 先后治療了四名患者FIX水平升高2倍并持續(xù)了1年以上 2003年獲得國家批準(zhǔn)進行中國首次AAV基因治療血友病B臨床試驗中國的基因治療第四十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月AAV based gene therapy for hemophilia B1. Viral genes are removed from AAV 2. A gene for blood clotting protein Factor IX is placed inside the empty AAV 3. The Factor IX-bearing viruses are injected int