1、利用實時定量和一法分析基因相對表達量,-()-.*.十* , California 94404;十 ，Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534摘要：現(xiàn)在最常用的兩種分析實時定量實驗數(shù)據(jù)的方法是絕對定量和相對定量。絕對 定量通過標準曲線計算起始模板的拷貝數(shù)；相對定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣 品和未經(jīng)處理的樣品目標轉(zhuǎn)錄本之間的表達差異。-方法是實時定量 實驗中分 析基因表達相對變化的一種簡便方法，即相對定量的一種簡便方法。本文介紹了 該方法的推導，假設及其應用。另外，在本文中我們還介紹了兩種-衍生方法 的推導和應用，它們

2、在實時定量數(shù)據(jù)分析中可能會被用到。關鍵詞：反轉(zhuǎn)錄定量相對定量實時反轉(zhuǎn)錄（）是基因表達定量非常有用的一種方法（）。實時技術和的結(jié) 合產(chǎn)生了反轉(zhuǎn)錄定量 技術（）。實時定量 的數(shù)據(jù)分析方法有兩種：絕對 定量和相對定量。絕對定量一般通過定量標準曲線來確定我們所感興趣的轉(zhuǎn)錄本 的拷貝數(shù)；相對定量方法則是用來確定經(jīng)過不同處理的樣品目標轉(zhuǎn)錄本之間的表 達差異或是目標轉(zhuǎn)錄本在不同時相的表達差異。絕對定量通常在需要確定轉(zhuǎn)錄本絕對拷貝數(shù)的條件下使用。通過實時 進行絕對 定量已有多篇報道（），包括已發(fā)表的兩篇研究論文（）。在有些情況下， 并不需要對轉(zhuǎn)錄本進行絕對定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我 們說基

3、因在經(jīng)過某種處理彳發(fā)表達量增加倍比說該基因的表達從拷貝細胞 增加到拷貝細胞更加直觀。用實時對基因表達進行相對定量分析需要特殊的公式、假設以及對這些假設的 驗證。方法可用于定量 實驗來計算基因表達的相對變化：公式的推導， 以及實驗設計，有效性評估在（）中有介紹。用- 方法分析基因表達數(shù)據(jù)在文獻中也有報道（）。本文介紹了該方法的推導、假設以及應用。另外，本文 還介紹了- 兩種衍生方法的推導和應用，它們在實時定量數(shù)據(jù)分析中都可能被 用到。-方法.-方法的推導指數(shù)擴增的公式是： TOC o 1-5 h z K = (1 +丘此HI這里，是第 個循環(huán)彳發(fā)目標分子數(shù)，是初始目標分子數(shù)，是目標分子擴增效率，

4、 是循環(huán)數(shù)，代表目標擴增產(chǎn)物達到設定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。因此：W =隊叫是目標分子達到設定的閾值時的分子數(shù)。 是目標分子擴增達到閾值時的循環(huán) 數(shù)。是一個常數(shù)。對于內(nèi)參反應而言，也有同樣的公式：殆=& X (1 + 巨滬玖=Kr,131 = x*+B=/ = k. 14!用除以得到：疼國X 11 + R|I TI-M對于使用探針的實時擴增而言，和的值由一系列因素決定：包括探針所帶 的熒光報導基團、探針序列對探針熒光特性的影響、探針的水解效率和純度以及 熒光閾值的設定。因此常數(shù)并不一定等于。假設目標序列與內(nèi)參序列擴增效率相同：-=鼻=* X (1 += K5或：時代表經(jīng)過均一化處理過的初始目標分子

5、量；表示目標基因和內(nèi)標基因值的差 異(一)整理上式得：林=KX (1 + )一6.7最后用任一樣本 的除以參照因子（，）的得到： 敬=3片駕圓 在這里3- 丁 = m，i - x一-,1對于一個少于的擴增片斷而言，如果 濃度、引物都進行了適當?shù)膬?yōu)化，擴增 效率接近于。因此目標序列的量通過內(nèi)均一化處理之后相對于參照因子而言就是.- 方法的假設和應用要使計算方法有效，目標序列和內(nèi)參序列的擴增效率必須相等?？磧蓚€反應 是否具有相同的擴增效率的方法是看他們模板濃度梯度稀釋彳度擴增產(chǎn)物如何 變化。Y 0 L： !；： x i * 2 ItS；C：刑戶 JH.JlonFIG, 1, ViiltditlEo

6、ti of iht 2-A4CT hr id Ai npl i fir t h h i d 1 F?NA svnihesizcd from different amounts of RNA. Tht efficiency of amplify cation of the tcirpl Rene 匚-地1 偵 and irtterrml runtro! (GAPDH was l-1 x/leiilned lls3f? j r ijn( PCR ,i：jd rMan rieEecfii.inj p ersr1tjjiiTiplase. cDNA wasfrom 1 /jg ml瀏 RMA isol

7、atedfman human Raji rt-lls Serial dilutions of cDNA weir mnpli打ed by real-timp PCR using gpnespecific primers- The most roncentroted shriwMcINAdPrkprl Mhh I 旭 M hii RNA The Af y i| | rll rlkl I A = .1圖顯示的是 樣品在 倍稀釋范圍內(nèi)的實驗結(jié)果。對于每一個稀釋樣本，都用 和特異的熒光探針及引物進行擴增。計算出和 的平均值以及值，通過濃 度梯度的值對值作圖，如果所得直線斜率絕對值接近于，說明目標基因和

8、內(nèi)標 基因的擴增效率相同，就可以通過方法進行相對定量。在圖中，直線斜率是， 因而假設成立，方法可以用來分析數(shù)據(jù)。如果兩個擴增反應效率不同，則需要通過定量標準曲線和絕對定量的方法來進行相對定量；或者也可以重新設計引 物，優(yōu)化反應條件使得目標序列和內(nèi)參序列具有相同的擴增效率。.-內(nèi)標和參照因子的選擇使用內(nèi)標基因的目的是為了對加入到反轉(zhuǎn)錄反應中的進行均一化處理。標準的 看家基因一般都可被用作內(nèi)標基因。適合于實時 反應內(nèi)標基因包括邙 邙 以 及。當然，其它的看家基因也同樣能被用作內(nèi)標。我們推薦在應用某一基因作 為內(nèi)標之前首先確證該基因的表達不會受實驗處理的影響。驗證實驗處理是否對 內(nèi)標基因表達產(chǎn)生影響

9、的方法在部分有描述。-方法中參照因子的選擇決定于基因表達定量實驗的類型。最簡單的設計就是 把未經(jīng)處理的樣品作為參照因子（）。經(jīng)內(nèi)標基因均一化處理彳菱，通過方法計 算，目標基因表達差異通過經(jīng)過處理的樣本相對于未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)來表 示。對于未經(jīng)處理的參照樣，而。所以根據(jù)定義，未處理樣本的倍數(shù)變化 為。而對于那些經(jīng)過處理的樣本，相對于參考因子基因表達的倍數(shù)為-同樣 的分析也可用于不同時相的基因表達差異，在這種情況下，一般選 時刻的樣本 作為參照因子。有些情況下，并不是比較不同處理樣本基因表達差異。例如，有的是想看某一器 官中特定 的表達。在這種情況下，參照因子可能是另一器官中該 的表達。表 顯示

10、了大腦和腎臟總中和 轉(zhuǎn)錄本的值。在這一個例子中，大腦被人為的選擇 為參照因子，通過計算得到腎臟 表達量經(jīng) 校正彳度相對于大腦的表達量的結(jié)果。 盡管相對定量方法可用于這種組織之間的比較，但結(jié)果的生物學解釋是相當復雜 的。不同種類細胞中目標和參照轉(zhuǎn)錄本單一的相對量變化可能在任何特定的組織 中都存在。TABLE 1Tieiimn 叫 R叩 1 心itt, 口占忸 將1溥口 Tjujrei: and RrfeieiKe Aw Amplified iih 8沖割胰? Welfc-ACk 曲啊 t-mc Q -Av#海風|衲麗町U命皿GtCAPEH1 CtA昭 CAPDH Ct- g可鼠眥 btf割ft

11、bHrahl30 H30 341 30 5S 30 34 30.50 SA3 出w 畔KJdiK-v27.D6arcs 3 Z7.I0 季i電： 事果 伊27 03 = 0.06T!-b76s4 L 工-4.|_|h& K- 7. alJTnrnl kRA Inm humrm bnin juid w-rsIrani L knerh. UsJnp nn叩nutdJNA wua wyniiuLspd Imm I尸薄 rnrn RNA. AIIfMi3Ke4 r|5NA wit彳qJhnplJiki Iw nul-Hnw J*號Inn%ccnllnlng.-PMhi?!r prlrrvn and p

12、rabrfcirc-f?i5rnr pr |mpr宙南 proM1 fw GAPDH hwli斗wkmcDNA diTKsl Inni IQ 帽 W RNA Shf.衛(wèi)明.缶凸陟AH.E率1 .皿.外jN羽aa&lhmn%Cl*1OtIJB4KHRElLMfflqFlUWTGfiLKN日HBLKKHHMUNklM14 k Sani|ilE-十prnii蟲hnyt at dntd ruiL3i uU叫Kip W rwrlud. sJlir Ealrl chanpn tn =pm5-lan arf the I argi?pl pm( I JiM-riiid Hr Lncrnal. rantrud

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14、TTk1 nsr-in i r ni I Leim tmi orn sl-mih icdlardd baxil ns 15 d fiifilgwJruJkiLfcan lor the kiLd chanii !iL5lii|? 1 Itflack. 方法的數(shù)據(jù)分析 實時定量所得到值可以很容易的輸出到表格程序如中去。為了顯示數(shù)據(jù)分析過 程，我們在這里給出了一個基因表達定量的實驗數(shù)據(jù)和樣本列表。通過P均一 化處理，我們對目標基因的表達變化進行了監(jiān)測。在 的時間范圍內(nèi)，在每一時 間點都取個重復樣本，每一樣本在 合成之彳度都做定量，數(shù)據(jù)分析用到了公式， 即：amount of target = 2-A

15、ACt表示任意時間點，表示經(jīng)P 校正后 倍量的目標基因表達。時刻目標基因和內(nèi)標基因的平均（見圖第 欄）被用于公式中。通過公式 計 算出每一個樣本目標基因表達通過P 均一化處理彳度相對于時刻的倍數(shù)（見圖 第欄）。平均，由每一個時間點所取的三個重復樣求得。用這種分析方法，在 時刻的平均倍數(shù)變化接近于。我們發(fā)現(xiàn)通過檢測在時刻平均倍數(shù)變化是否為 可以很方便的驗證三個重復樣品之間是否有錯誤或者誤差。如果得到的結(jié)果與偏 差很大，則表明存在計算錯誤或者是很高的實驗誤差。在前面的例子中，在每一時間點上分別取了三個獨立的 樣本進行了分析。因此 對每一個樣本分別處理，通過計算彳菱取結(jié)果的平均值就非常重要。如果是同

16、一樣 本進行 擴增的重復，這就需要首先求出平均，然彳度再進行 計算。怎么樣計算 平均值就要看目標基因和內(nèi)參基因是在同一個管子中擴增還是在不同的管子中 擴增。表 給出了目標基因（）和內(nèi)參基因（）在不同管中擴增的實驗數(shù)據(jù)。 在這里不應該把任一單個的管子和管子作比較，而應該分別計算出和的 平均來計算。重復實驗中值的估計偏差通過標準的指數(shù)計算轉(zhuǎn)化成最彳度結(jié)果 中相對量的變化。但其中的一個難點是值與相應的拷貝數(shù)成指數(shù)關系（見第部 分），因此，在最彳的計算中，的誤差通過加上標準偏差和減去標準 偏差來評估，這就使得求得的數(shù)值相對于平均值呈不對稱分布。不對稱分布是因 為結(jié)果經(jīng)指數(shù)處理彳度轉(zhuǎn)化成量的線性比較造成

17、的。通過不同熒光染料標記的探針，我們可以在同一管中同時擴增目標序列和內(nèi)標序 列。表給出了目標基因（）和內(nèi)標基因（）在同一管中擴增的實驗數(shù)據(jù)。對于 任意一個管子，目標基因（）和內(nèi)參基因（）擴增時加入的量都是一樣多的， 所以可以分別對每個管子計算值，這些值取平均后再進行計算。在這里估計 誤差值也是一個不對稱的范圍，反映了誤差經(jīng)指數(shù)處理轉(zhuǎn)化為線性差異。在表和表中，估計誤差在從到的計算中未見有增加，這是因為我們把 參照基因和檢測基因的誤差都顯示出來了。我們把，當作一個人為設定的常 數(shù)來減去，得到。這樣得到的結(jié)果就與圖 所顯示的在求平均之前對不同 重復樣本分別通過各自的值求實 所得結(jié)果相當。另一種方法是

18、將參照基因 當作沒有任何誤差的倍的量，在這種情況下，平均的誤差值被引入到每一樣 本的中。在表中，腎臟中八 變成土而經(jīng)過校正的量是 倍，范圍從 到。而在大腦中的結(jié)果是沒有誤差的倍。IAULElZTrenrrnem M itapSImt Das Wher Target rmd Refritnce eiwi Amplified in the Sim- WHFr-/?jpFCtGAFDHCtdUl iftvp- r-jTJwr 令 N GATDH i)M Ct I 哄 Wt3 e|ruiNnrrnC|l c-piir zmiumiE 網(wǎng)Ml輯 to DrlnIdmLn55.tl7sub亍的器乎E IM

19、25 177 17WS 29e.n isan 01Kgy2U.7324 3024技1 5226.5J24.31.4 2N “5Ml.24 U2K.702d.ib，玷4.47 =-MT i .14“他d】ilikjt LkiIei Tobfe I 岫s (KnmriiM 誠i/pt iik! r始nhh姑 cutiLwid pt Ijih，粉諾 probc fw MiIim地n andGAPDH The puW fin f wut JuBuJliJ WIHi U* 川pcclE dw F.M jjkJ IM 引心，扣i GjFD(H 加ii Liabdd Sih Hiu EpoPta JOE.

20、BHfeg of Uw dUTwivl MpM恤r做k itifi reaJ-dfi瞄 IVR 曲必ajiTor r叫血 GAiPEH ran be dkMlnguitliBd trab UiouJi IxmIi onipuncM.lo 機於iri U痢Wil.一方法.-方法的推導通過內(nèi)標可以對加入的量的差異進行校正。-方法的數(shù)據(jù)分析的一個特點就 是能夠利用實時實驗的一部分數(shù)據(jù)來完成這種校正。在其它的方法不能定量初 始 量的時候：例如，在能得到的 量非常有限的時候或者需要處理高通量的樣 品的時候，這一方法的優(yōu)勢就格外明顯。當然我們也可以利用實驗以外的方法 來完成這種校正。最常用的一種方法就是用

21、紫外吸收來確定用于合成的量，然 彳度將相同的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的用于定量反應。這種外標法校正的一個應用例子就 是研究某種實驗處理是否影響內(nèi)標基因的表達。在這里，目標基因和內(nèi)標合二為 一。在這個例子中，公式口不被公式口除，公式變成：AX (1 +Eg =盡110整理得：I - - : ! -1 1任一樣品除以參照品得：112在這里。與前面計算中用的（用目標基因值減去參照基因值）相互 區(qū)別。就象在部分所描述的，如果條件優(yōu)化較好，效率接近于，內(nèi)標相對于參照因子為:2.|13.-方法的應用-方法的一個應用就是確定實驗處理對某一候選內(nèi)標基因的影響。為了顯示這 一過程，我們做了血清饑餓誘導實驗（）。血清饑餓誘導是

22、研究某些 降解 的常用方法（）。然而，血清可能影響一些基因的表達包括標準的看家基因的表 達。在血清饑餓培養(yǎng)之彳發(fā)，在 細胞中加入 血清誘導基因表達。從細胞中提取（）， 并將之反轉(zhuǎn)錄成。利用 通過實時定量檢測，p 的量。和6 各自的 相對量通過-，公式求得。細胞處理對于 的基因表達有明顯影響，但對p 沒有 什么影響。因此p 很適合做血清刺激定量實驗的內(nèi)標，而并不適合。這一例 子向大家展示了在只研究一個基因的時候怎么用-，的方法分析基因相對表達數(shù) 據(jù)。.實時數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析實時最終分析的是閾值循環(huán)或。值通過 信號的對數(shù)值和循環(huán)數(shù)來確定。因此值是一個指數(shù)而非線性概念。因此， 在任何統(tǒng)計分析中都不要用原始的值來表示結(jié)果。正如我們在前文中所描述的一 樣，相對量通常和內(nèi)標和參照樣本一起計算而很少直接用值來表示，除非我們 想檢驗重復樣本之間的差別。為了向大家顯示這一點，我們用 通過 來檢測相 同的個重復反應。所有反應組分在同一管中混好彳發(fā)分裝到 個管中，做實時 分析