1、免疫熒光技術(shù)（檢測抗核抗體（ANA）的實驗方案）熒光免疫技術(shù)是以熒光物質(zhì)標記的特異性抗體或抗原作為標準試劑，用于相應抗原或抗體的分析鑒定和定量測定。熒光免疫技術(shù)包括熒光抗體染色技術(shù)和熒光免疫測定兩大類。熒光抗體染色技術(shù)是用熒光抗體對細胞、組織切片或其他標本中的抗原或抗體進行鑒定和定位檢測，可在熒光顯微鏡下直接觀察結(jié)果，稱為熒光免疫顯微技術(shù)，或是應用流式細胞儀進行自動分析檢測，稱為流式熒光免疫技術(shù)。熒光免疫測定主要有時間分辨熒光免疫測定和熒光偏振免疫測定等。本次實驗以熒光免疫顯微技術(shù)檢測抗核抗體（ANA）為例進行實習?？购丝贵w（antinuclearantibody,ANA）又稱抗核酸抗原抗體，

2、是一組將自身真核細胞的各種成分脫氧核糖核蛋白（DNP）、DNA、可提取的核抗原（ENA）和RNA等作為靶抗原的自身抗體的總稱，能與所有動物的細胞核發(fā)生反應，主要存在于血清中，也可存在于胸水、關(guān)節(jié)滑膜液和尿液中?？购丝贵w實驗原理以小鼠肝細胞或某些培養(yǎng)細胞（如Hep-2）作抗原片，將病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就會與細胞核成分特異性結(jié)合。加入熒光素標記的抗人IgG抗體又可與ANA結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見細胞核部位呈現(xiàn)熒光。試劑與器材1抗原片現(xiàn)多用商品試劑。如需自行制備，方法如下：肝印片制備：取4-8周齡小鼠，斷頸殺死后，剖腹取肝。將肝臟剪成平面塊，用生理鹽水洗去血細胞，用濾紙吸干滲

3、出的漿液。將切面輕壓于載玻片上，使其在載玻片上留下薄層肝細胞。冷風吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。Hep-2細胞抗原片制備：Hep-2細胞是建株的人喉癌上皮細胞。經(jīng)適宜培養(yǎng)在載玻片上形成單層細胞抗原片，用洗滌洗去培養(yǎng)基。干燥后，用無水乙醇固定。肝切片制備：取小鼠肝組織作冰凍切片，厚4l。-30C保存?zhèn)溆谩?異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗人IgG抗體(FITC-抗人IgG抗體)有商品供應，臨用時按效價稀釋。3.LPBS4緩沖甘油取甘油9份加PBS1份。待測血清、陽性和陰性對照血清臨床標本篩選獲得。6器材熒光顯微鏡、孵箱、有蓋濕盒、染色缸、吸管、試管等操作方法1準備：檢查加樣板，生物載片恢復室

4、溫，標記。2稀釋：PBS-Tween緩沖液稀釋血清，設陰陽性對照。3.加樣：加樣板放于泡沫塑料板上，加25ul稀釋后血清，至加樣板的每一反應區(qū)，避免氣泡。加完所有標本后開始溫育。4溫育：將生物薄片蓋于加樣板的凹槽里，反應開始，室溫溫育30分鐘。5沖洗：用燒杯盛PBS-Tween緩沖液流水沖洗生物薄片，然后立即將其浸入盛有PBS-Tween緩沖液的小杯中至少1分鐘。不必混搖。6加樣：滴加20ul熒光素標記的抗人球蛋白(結(jié)合物)至一潔凈加樣板的反應區(qū)，完全加完方可繼續(xù)溫育。熒光素標記的抗人球蛋白用前需混勻并以PBS-Tween緩沖液稀釋。7沖洗：用燒杯盛PBS-Tween緩沖液流水沖洗生物薄片，然

5、后立即將其浸入盛有PBS-Tween緩沖液的小杯中至少1分鐘。不必混搖。8.封片：將蓋片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至蓋片：每反應區(qū)約10ulo從PBS-Tween緩沖液中取出1張生物薄片，用紙擦干背面和四邊。還要擦拭反應區(qū)間隙。將生物薄片面朝下放在已準備好的蓋玻片上，立即查看并調(diào)整使蓋片嵌入載片的凹槽中。然后繼續(xù)下1張。結(jié)果判定熒光顯微鏡下觀察1細胞核發(fā)黃綠色熒光為陽性染色細胞，不發(fā)熒光為陰性?？乖谐霈F(xiàn)陽性染色細胞為ANA陽性，否則為陰性。陽性待檢血清可作進一步稀釋后測定效價。2根據(jù)細胞核著染色熒光的圖像，可區(qū)分為：均質(zhì)型：細胞核呈均勻一致的熒光；周邊型（核膜型）：細胞核周

6、圍呈現(xiàn)熒光；斑點型（顆粒型）：細胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點狀熒光；核仁型：核仁部分呈現(xiàn)熒光?；旌闲停簝煞N以上核染色；應用細胞片做抗原片可檢出著點型（ACA）注意事項1.PBS-Tween緩沖液在4C下可存放兩周。2根據(jù)每次實驗的標本量決定需要稀釋的FITC標記的抗人球蛋白的量，稀釋后可在4C下可存放1周。3血清或FITC標記的抗人Ig應滴加至加樣板上，不能直接滴到載片上。4載片蓋到加樣板上后，確保反應區(qū)與液滴完全接觸后，才開始記時溫育。5沖洗載片時水流要緩慢，以免沖洗掉基質(zhì)。載片上的反應區(qū)應保持濕潤，不要將載片風干。封片進不可用力擠壓蓋玻片，以免損壞基質(zhì)?？勺笥遗矂由w玻片以使其正確嵌入載片凹槽里。封片介質(zhì)

7、含有熒光穩(wěn)定劑，應保存在2-8C。封好的載片可于4C長期保存。實驗討論方法評價間接免疫熒光技術(shù)是檢測ANA最常用的方法。該方法簡便、敏感，且可根據(jù)核染色形態(tài)確定核抗原的類型。鼠肝印片細胞分布不均勻，多有重疊，沖洗時易丟失。Hep-2細胞具有核大、有絲分裂旺盛、核內(nèi)細胞器較明顯、具備人源性抗原的特征，對診斷和鑒別不同類型的自身免病十分有利。檢測抗核抗體(ANA)的實驗方案ANA簡介抗核抗體(antinuclearantibodies，ANAs)經(jīng)典定義：針對細胞核成分的一大組抗體譜?？购丝贵w新概念(FANA)傳統(tǒng)定義：顧名思義是指抗細胞核抗原成分的自身抗體的總稱狹義定義現(xiàn)代定義：是指抗細胞內(nèi)所有

8、抗原成分的自身抗體的總稱。對ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸（nucleicacid）和核蛋白（nucleoprotein）抗體的總稱廣義定義靶抗原分布：細胞核細胞核、細胞漿、細胞骨架、細胞分裂周期抗核抗體檢測方法檢測細胞內(nèi)抗原自身抗體“金標準”一IIFANA檢測方法進展：僅限于IIF改良法（底物選擇、制備方法）試圖將ELISA發(fā)推廣為最基本的篩選方法未獲成功復制細胞抗原全部成分極其困難抗原存在的相對濃度、自然抗原決定簇的二級結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)熒光染色模型可初步判斷相應抗體性質(zhì)范圍或確定抗體特異性IIF法：HEp-2細胞底物（90%以上實驗室采用）#完整的ANAs抗原譜（細胞核、漿、骨

9、架、周期）#可預測分析ANA靶抗原范圍#經(jīng)驗性強ELISA法：采用高度純化抗原或全細胞抗原#抗原譜有限（十余種）#假陰性結(jié)果#操作簡單快速其他方法：金標法、比濁法ANA靶抗原多核苷酸：雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA組蛋白：Hl,H2A,H2B,H3,H4,H2A-H2B復合物核漿的核糖核蛋白:U1-nRNP、Sm、SS-A(Ro)、SS-B(La)、Ku、Mi-1、Mi-2、核點、增殖性細胞核抗原核仁抗原：Scl-70、U3-nRNP/原纖維蛋白、RNA多聚酶I、PM-Scl(PM-1)、7-2-RNP(To)、4-6-S-RNA、核仁形成中心(NOR)核膜抗原：板層素(層粘連蛋白)著絲點：著

10、絲點蛋白ANA檢出率與年齡和性別有關(guān)與個體的免疫穩(wěn)定性相關(guān)使用足夠敏感的方法，每個人都可檢測出一些ANA。天然ANA生理性自身免疫維持機體內(nèi)環(huán)境的生理穩(wěn)定。滴度較低，親和力弱，大多為IgM型。ANA檢測方法初篩抗核抗體：IIF最佳基質(zhì)：聯(lián)合生物薄片（HEp-2細胞/猴肝冰凍組織）區(qū)分抗核抗體的靶抗原：ELISA、印跡法和免疫印跡法ANA初篩IFT：HEp-2細胞/靈長類肝臟完整的抗原譜（細胞核及細胞漿）可預測靶抗原協(xié)助檢測其它項目（如ANCA、ENA）ELISA：采用高度純化的抗原初篩ANA抗原譜有限操作簡單快速采用滴定平板技術(shù)進行間接免疫熒光實驗為了使實驗操作標準化，歐蒙開發(fā)了滴定平板技術(shù)：

11、滴加標本或標記抗體至加樣板的反應區(qū)，然后將生物薄片載片蓋在加樣板表面的凹槽里，這時，載片上的所有生物薄片均與液滴接觸，反應同時開始。系統(tǒng)的幾何結(jié)構(gòu)決定了液滴的位置和高度。因為液體被局限在一封閉的空間里，所以不再需要傳統(tǒng)的“濕盒”。并且可在一致的反應條件下同時溫育任何數(shù)量的標本。準備：檢查加樣板是否反應區(qū)親水而周邊疏水如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時可使用家用洗滌劑或ExtranMA01（默克公司），再用水徹底沖洗。需要消毒時，可于3%的SekuseptExtra（漢高公司）中浸泡1小時。只有當載片平衡到室溫后方可打開袋子。不要觸及生物薄片。按照要求用記號筆對玻片進行標記。稀釋：按照試劑盒使用說

12、明稀釋血清標本。每次實驗均需加入陽性和陰性對照。對照血清使用前必須混勻。加樣：在加樣板的每個反應區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測標本后才開始溫育（一次最多200份）。使用聚苯乙烯加樣板。加樣體積：10M/反應區(qū)（3x3mm）25Ml/反應區(qū)（5x5mm）70Ml/反應區(qū)（7x9mm）溫育：將載片蓋在加樣板對應的凹槽里，反應即開始。確保每個標本均能夠與生物薄片相接觸，而標本之間不相互接觸。室溫溫育30分鐘。清洗：用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。沖洗1秒鐘小杯內(nèi)浸洗5分鐘加樣：將熒光標記的抗人免疫球蛋白（酶

13、結(jié)合物）加入潔凈加樣板的每個反應區(qū)。完全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育（最多可加50個載片）。使用連續(xù)加樣器。加樣前應使用加樣器混勻。為節(jié)約時間，可在第一步溫育的同時滴加酶結(jié)合物至另一個加樣板的反應區(qū)中。加樣體積：10M/反應區(qū)（3x3mm）20Ml/反應區(qū)（5x5mm）60Ml/反應區(qū)（7x9mm）溫育：從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應區(qū)的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。從現(xiàn)在開始，注意避免陽光直射載片。室溫溫育30分鐘。清洗：用燒杯

14、盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘?？稍诿?50ml磷酸鹽緩沖液中加10滴（150M）伊文氏藍進行復染。沖洗1秒鐘小杯內(nèi)浸洗5分鐘封片：在蓋玻片上滴加甘油/PBS。使用聚苯乙烯封片板。從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應區(qū)間隙。將載片的生物薄片朝下置于準備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位置，正確放置。然后再進行下一個載片的操作。封片體積：10M/反應區(qū)（3x3mm）10M/反應區(qū)（5x5mm）20Ml/反應區(qū)（7x9mm）結(jié)果判斷：熒光顯微鏡下

15、觀察熒光。具體操作熒光工作臺的布置清洗載片的擦拭封片可篩查上百種不同的抗ANA的結(jié)果間接免疫熒光法的獨特優(yōu)勢（一種基質(zhì)體）用HEp-2細胞檢測自身抗體ANA熒光模型核均質(zhì)型核仁型核顆粒型胞漿型ANA確認實驗（1）IFT:-HEp-2細胞/靈長類肝臟：特殊的熒光模型如著絲點、核膜型、核糖體P蛋白、肌動蛋白ELISA:-ANA分項（含ENA譜）：包被高度純化抗原斑點法/印跡法-ENA譜:采用各種高度純化的抗原ELISA：抗ENA譜印跡法：抗ENA譜印跡法：抗ENA譜免疫印跡法ANA確認實驗（2）Westernblot:HEp-2細胞提取物定性適宜特別需要（如區(qū)分靶抗原Ro52或Ro60）檢測目前無

16、法純化的靶抗原的抗體（如PM-Scl、Ku）結(jié)論初篩實驗：免疫熒光技術(shù)（HEp-2細胞/靈長類肝臟）ELISA（純化的多種核抗原）確認實驗：ELISA印跡法斑點法WesternblotANA譜與相關(guān)疾病相關(guān)疾病的ANA譜ANA的各種熒光模型、靶抗原及相關(guān)性高滴度的ANA僅出現(xiàn)在自身免疫性疾病中自身免疫性疾病ANA陽性率(%)系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動期95-100非活動期80-100藥物誘導的紅斑狼瘡混合性結(jié)締組織100病類風濕性關(guān)節(jié)100炎20-40SSA20-60SSB10-20Ku5-1020-40心磷脂、b2-GPl抗細胞抗體熒光模型(immunofluorescentpattern)常見的熒

17、光染色模型有6種：核均質(zhì)型(homogeneouspattern，H)核顆粒型(Granuloguspattern，S)核仁型(nucleouspattern，N)核膜型(membranouspattern，M)著絲點型(centromertpattern，ACA)胞漿型(cytoplasmicpattern，ACYA)HEp-2細胞/靈長類肝臟：核均質(zhì)型ssDNA/dsDNA靶抗原：單鏈、非天然DNA(嘌吟和嘧啶鹼基對)雙鏈、天然DNA(脫氧核糖核酸結(jié)構(gòu))相關(guān)性:ssDNA類風濕SLE干燥綜合征皮肌炎類風濕性關(guān)節(jié)炎獻血員SLE%30%90%抗dsDNA:綠蠅短膜蟲組蛋白靶抗原：組蛋白Hl、H

18、2A、H2B、H3、H4（主要抗原H1和H2B）功能：形成核小體相關(guān)性：藥物誘導性LE:100%（唯一的標志抗體）SLE：40%-80%其它風濕性疾?。荷僖奌Ep-2細胞/靈長類肝臟：抗RNP/SmUl-nRNP靶抗原：與Ul-nRNA連接的3個蛋白分子（70K、A和C蛋白）功能：切割pre-mRNA相關(guān)性：MCTD:95%100%SLE:15%-40%抗Sm抗體靶抗原：與U1-、U2-、U4-、U5-或U6-nRNA連接的6種不同蛋白分子（coreproteinsB,B,D,E,F,G）功能：切割pre-mRNA相關(guān)性：SLE:5%30%HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗核糖體P蛋白抗核糖體P蛋

19、白抗體抗原：核糖體的亞單位（60S）,3個蛋白分子組成：P0、P1、P2（38、19、17kDa）。在碳末端具有相似的免疫反應表位。功能：蛋白合成易位過程中的輔蛋白相關(guān)性：SLE：5%15%原發(fā)性干燥綜合征的抗體譜靶抗原陽性率（%）SSA4095SSB40954095ssDNAHEp2細胞/靈長類肝臟：抗SSA/SSB抗SSA抗體靶抗原：與Yl,Y3,Y4或Y5型RNA連接的2個蛋白（52kDa和60kDa）功能：調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)譯活性相關(guān)性：干燥綜合征：40%95%SLE:20%60%抗SSB抗體靶抗原：與小分子RNA（U6RNA,pretRNA）結(jié)合的磷脂蛋白（48kDa）功能：RNA多聚

20、酶III的輔蛋白相關(guān)性：干燥綜合征：40%95%SLE:10%20%進行性系統(tǒng)性硬化征的抗體譜靶抗原性率（）著絲占八、80-95Scl-7025-75ssDNA30-60原纖維蛋白5-10RNA聚合酶4PM-Scl（重疊綜合征）3NOR-90（核仁形成區(qū)）少見Ku（多肌炎型重疊綜合征）1-7HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗著絲點抗體抗著絲點抗體靶抗原：連接動粒（著絲點）上的4個蛋白分子：A-、B-、C-、D-蛋白，分子量（17、80、140、50kDa）主要的靶抗原：著絲點B蛋白（與IIFT相關(guān)性：100%）功能：與紡錘體纖維連接相關(guān)性：硬皮?。?8%局限性硬化征（CREST綜合征）：80%-9

21、5%HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗Scl-70抗Scl-70抗體靶抗原：DNA拓撲異構(gòu)酶I（100kDa）功能：DNA復制和翻譯過程的輔蛋白相關(guān)性：硬皮?。?5%75%HEp-2/靈長類肝臟：抗PM-Scl抗PM-Scl抗體靶抗原：多個蛋白分子的復合物主要的靶抗原100kDa（與DNA拓撲異構(gòu)酶I不同）功能：未知相關(guān)性：硬皮?。?%-5%肌炎：8%重疊綜合征：24%HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗RNA多聚酶RNA多聚酶I、II和III靶抗原：多個蛋白亞單位組成的核仁酶復合物功能：多聚酶I:轉(zhuǎn)錄rRNA基因多聚酶II:轉(zhuǎn)錄mRNA基因多聚酶III:轉(zhuǎn)錄tRNA基因相關(guān)性：硬皮病:4%HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗原纖維蛋白抗原纖維蛋白（U3-nRNP）抗體靶抗原：與基礎蛋白（34kDa）連接的U3-nRNA和其它5個蛋白功能：分離pre-rRNA相關(guān)性：皮肌炎：5%-10%HEp-2細胞/靈長類肝臟：抗NORHEp-2細胞/靈長類肝臟：抗Ku多肌炎和皮肌炎的抗體譜靶抗原性率（%）ssDNA40-50Jo-125-35TOC o 1-5 h zPM-Scl（重疊綜合征）8