1、藥品微生物檢驗發(fā)展與機遇胡昌勤2015年8月15日，西安中國食品藥品檢定研究院National Institutes for Food and Drug Control目錄1歷史回顧22015版修訂中的相關(guān)問題發(fā)展方向3ol歷史回顧 (1953-2015）1藥品微生物標準 新中國第一部藥典(1953年頒布)收載了無菌檢查法。 我國藥品微生物限度檢查工作始于1972年。 1978年頒發(fā)了第一個“藥品衛(wèi)生標準”。 1995年版中國藥典首次收載了微生物限度檢查法，2000年版收載了微生物限度標準。 從第八界藥典委員會（2005版中國藥典）開始設(shè)立微生物專業(yè)委員會National Institutes

2、 for Food and Drug Control藥品微生物檢驗控制(2015版） 藥品中污染菌的檢出與鑒定- 無菌與有菌（無菌檢查法）- 致病菌與非致病菌（微生物計數(shù)法、控制菌檢查法） 藥品中污染菌的殺滅與控制- 滅菌法- 抑菌效力檢查法 藥品中污染菌的質(zhì)控限度（微生物限度標準） 相關(guān)的指導(dǎo)原則（6個指導(dǎo)原則）National Institutes for Food and Drug Control歷版藥典的主要進展 2005 版- 將按劑型制定限度修訂為按給藥途徑制定限度- 強調(diào)微生物檢驗的“方法驗證”- 無菌檢查培養(yǎng)時間與國外接軌 2010 版- 質(zhì)量標準體系基本與國外接軌- 強調(diào)對微

3、生物檢驗過程的驗證及過程控制- 部分品種特別是抗生素品種的無菌檢查法由附錄走入各論National Institutes for Food and Drug Control歷版藥典的主要進展(續(xù)） 2015年版- 實現(xiàn)了三部藥典標準的統(tǒng)一- 形成了一個比較完備的藥品微生物檢驗標準體系，具有以下兩個顯著特征： 全面與國際標準接軌； 推動了藥品微生物控制由終產(chǎn)品檢驗向過程控制轉(zhuǎn)變。- 強化了對藥品微生物檢驗中試驗操作關(guān)鍵點的過程控制National Institutes for Food and Drug Control藥品微生物檢驗關(guān)鍵點控制無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則對照培養(yǎng)基藥品微生物實驗

4、室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則無菌性檢查靈敏度檢查環(huán)境保證培養(yǎng)基保證藥品潔凈SOP操作有效的方法方法驗證實驗室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則有效的結(jié)果結(jié)果判斷可靠的結(jié)論微生物鑒定指導(dǎo)原則非無菌藥品微生物限度檢測指導(dǎo)原則National Institutes for Food and Drug Control2015版中國藥典的修訂目標：中藥標準要引領(lǐng)國際發(fā)展，化學(xué)藥品與國際標準接軌?？傮w思路 切實解決好我國藥典與ICH協(xié)調(diào)案的統(tǒng)一協(xié)調(diào)問題，使協(xié)調(diào)工作既達到協(xié)調(diào)一致的目的又符合我國國情。National Institutes for Food and Drug Control20

5、15版中國藥典的修訂實施細則 檢驗方法與國外藥典保持一致，質(zhì)控指標在保證安全性的基礎(chǔ)上符合國內(nèi)現(xiàn)狀 已有的指導(dǎo)原則實用化，通過科研解決指導(dǎo)原則實用化問題。 增加新的指導(dǎo)原則，特別是對與企業(yè)過程控制相關(guān)的指導(dǎo)原則National Institutes for Food and Drug Control2015版修訂中的相關(guān)問題2 微生物檢驗新理念 微生物檢驗環(huán)境控制 抑菌劑效力檢查法 眼膏、軟膏劑的微生物控制National Institutes for Food and Drug Control一、微生物檢驗新理念1. 風(fēng)險管理、風(fēng)險調(diào)查/評估 實驗環(huán)境、器材、方法的要求大幅度提高 各種SOP

6、越來越細化2. 檢驗理念的轉(zhuǎn)變 檢驗方法個性化 微生物鑒定由形態(tài)、生化鑒定向分子生物學(xué)鑒定發(fā)展National Institutes for Food and Drug Control1. 風(fēng)險管理、風(fēng)險調(diào)查/評估藥品微生物檢驗的風(fēng)險管理整改藥品微生物實驗室溯源分析環(huán)境/過程微生物的監(jiān)測與控制藥品的微生物檢測產(chǎn)品污染實驗污染環(huán)境/過程細菌與藥品細菌的比較結(jié)論重試污染源排除National Institutes for Food and Drug Control中檢院無菌室萬級區(qū)域浮游菌分布圖1816 2012年141210813號 無 菌 室15號 無 菌 室16號 無 菌 室64201月 份

7、3月 份5月 份7月 份9月 份 11月 份20182013年16141210813號 無 菌 室15號 無 菌 室16號 無 菌 室浮游菌標準：A級（100級）：1 CFU/m3B級（1000級）：10 CFU/m364C級（10000級）：100 CFU/m3 201月 份3月 份5月 份7月 份9月 份 11月 份National Institutes for Food and Drug Control近6年無菌室萬級浮游菌高限圖90807060504030201007月8月9月2007200820092010201120122013National Institutes for Foo

8、d and Drug Control潔凈室使用次數(shù)與浮游菌數(shù)關(guān)系National Institutes for Food and Drug Control環(huán)境微生物歸屬藥品微生物控制風(fēng)險管理風(fēng)險調(diào)查/評估微生物實驗室技術(shù)能力National Institutes for Food and Drug Control一、微生物檢驗新理念1. 風(fēng)險管理、風(fēng)險調(diào)查/評估 實驗環(huán)境、器材、方法的要求大幅度提高 各種SOP越來越細化2. 檢驗理念的轉(zhuǎn)變 檢驗方法個性化 微生物鑒定由形態(tài)、生化鑒定向分子生物學(xué)鑒定發(fā)展National Institutes for Food and Drug Control2

9、. 檢驗理念的轉(zhuǎn)變 實驗者由嚴格按照標準檢驗，向按統(tǒng)一原則，選擇適宜的方法轉(zhuǎn)變 藥品因素 環(huán)境影響 培養(yǎng)觀察 抽樣檢查 破壞試驗 結(jié)果判斷 OOS調(diào)查方法驗證過程控制SOP溯源調(diào)查National Institutes for Food and Drug Control2. 檢驗理念的轉(zhuǎn)變2015版中國藥典致病菌鑒定策略的轉(zhuǎn)變 利用規(guī)定的選擇培養(yǎng)基初篩； 自己選擇確證方法 ； 建議采用分子遺傳學(xué)方法，以最新版的伯杰氏細菌學(xué)鑒定手冊為金標準（微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則 ）。National Institutes for Food and Drug Control2010版中國藥典沙門菌（Sal

10、monella） 的鑒別1. 取培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時（必要時延長至4048小時）。若平板上無菌落生長，或生長的菌落不同于表6所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。表 6 沙門菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基膽鹽硫乳瓊脂菌落形態(tài)無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時為暗色沙門、志賀菌屬瓊脂曙紅

11、亞甲藍瓊脂麥康凱瓊脂National Institutes for Food and Drug Control2. 若平板上生長的菌落與表6所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選23個菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。3. 否則，應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進行適宜的生化試驗和血清凝集試驗，確認是否為沙門菌。 利用多種選擇培養(yǎng)基（特定的營養(yǎng)條件和生態(tài)學(xué)環(huán)境），通過菌落形態(tài)、代謝物顯色反應(yīng)等，采用排除法鑒別。National Institutes for Food an

12、d Drug Control2015版中國藥典沙門菌（Salmonella） 的鑒別選擇和分離培養(yǎng) 取預(yù)培養(yǎng)物0.1mL接種至10mL RVS增菌肉湯中，3035培養(yǎng)1824小時。取少量RVS沙門菌增菌肉湯培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上，3035培養(yǎng)1848小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上生長良好，菌落為紅色、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時，或采用其它適宜方法進一步鑒定。結(jié)果判斷 若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層有黑色

13、，應(yīng)進一步進行適宜的鑒定試驗, 確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。National Institutes for Food and Drug Control二、微生物檢驗實驗環(huán)境的控制無菌檢查實驗環(huán)境的修訂2010年版2015年版（原修訂稿）無菌檢查：無菌檢查：應(yīng)在潔凈度10000級背景下 應(yīng)在潔凈度B級背景下的局部的局部100級單向流空氣區(qū)域 A級單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離內(nèi)或隔離系統(tǒng)進行系統(tǒng)中進行。修訂依據(jù)及意義：2010版GMP附錄一無菌藥品和附錄三生物制品中

14、均規(guī)定，非最終滅菌產(chǎn)品各工序關(guān)鍵操作環(huán)境應(yīng)為B級背景下的A級。無菌檢查的潔凈環(huán)境不得低于生產(chǎn)關(guān)鍵區(qū)的潔凈環(huán)境要求！National Institutes for Food and Drug ControlNational Institutes for Food and Drug Control微生物限度檢查實驗環(huán)境的修訂2010年版2015年版（原修訂稿）應(yīng)在潔凈度10000級背景下的 應(yīng)在受控潔凈環(huán)境下（不低局部100級單向流空氣區(qū)域內(nèi) 于D級）的局部不低于B級單進行。向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。National Institutes for Food and Drug ControlNationa

15、l Institutes for Food and Drug Control三、抑菌劑效力檢查法抑菌效力考查時間點及要求標準EP-AEP-B6h24h7days14days28days細菌下降至 細菌下降至少2 lg 少3 lg細菌不生長；真菌無增加；真菌下降2 lg/細菌下降至 細菌下降至少3 真菌下降至少1 細菌菌數(shù)不增加；lg/少1 lglg真菌菌數(shù)不增加。細菌下降至少 細菌下降至少1.0log； 3.0log；真菌不增加。 真菌不增加。ChP(2010)細菌比14d不增加；真菌不增加。/細菌下降至少 細菌下降至少1.0log； 3.0log；真菌不增加。 真菌不增加。細菌比14d不增加

16、；真菌不增加。USPJP/細菌0.1%接種量；真菌不增加。細菌比14d不增加；真菌不增加。/抑菌劑添加的基本原則有效性安全性最低有效合理處方National Institutes for Food and Drug Control滴眼劑專項-抑菌劑合理性評價 羥苯乙酯：12家 羥苯甲酯+羥苯乙酯: 1家22個氯霉素滴眼液企業(yè)抑菌使用劑情況 醋酸苯汞：4家 硫柳汞：2家 硝酸苯汞：1家 苯扎溴銨：1家National Institutes for Food and Drug Control滴眼劑專項-抑菌劑合理性評價 不同企業(yè)的處方中抑菌劑含量差異較大；如羥苯酯類抑菌劑的濃度范圍為200 g/m

17、L -700g/mL。氯霉素滴眼劑中抑菌劑羥苯乙酯的含量National Institutes for Food and Drug Control數(shù)據(jù)來源：中國食品藥品檢定研究院滴眼劑專項-抑菌劑合理性評價尼泊金酯 不同抑菌劑的抑菌有機汞效力：有機汞類 苯扎溴銨和 羥苯乙酯 目前市售氯霉素滴眼液中抑菌劑使用過量。 有機汞類抑菌劑是否適合在滴眼劑中應(yīng)用應(yīng)進一步評估。尼泊金酯有機汞ional Institutes for Food and Drug Control不同微生物在不同處方的氧氟沙星滴眼液中的變化大腸埃希菌的對數(shù)下降值金黃色葡萄球菌對數(shù)下降值銅綠假單胞菌對數(shù)下降值654321065432

18、1065432100時6時24時7天14天 28天0時6時24時7天14天 28天0時6時24時7天14天 28天黑曲霉菌對數(shù)下降值白色念珠菌對數(shù)下降值苯扎溴銨 5.6苯扎氯銨 5.6羥苯乙酯 5.6543210543210羥苯甲酯、丙酯5.6三氯叔丁醇 5.6硫柳汞 5.6空白 5.60時7天14天28天0時7天14天28天National Institutes for Food and Drug Control結(jié)論：不含抑菌劑的氧氟沙星滴眼液即可滿足藥典規(guī)定的抑菌效力檢查原則，目前氧氟沙星滴眼液普遍存在防腐劑濫用現(xiàn)象。National Institutes for Food and Dru

19、g Control微生物專業(yè)委員會2014年第二次會議（2014,6,25-27日）National Institutes for Food and Drug ControlNational Institutes for Food and Drug Control微生物專業(yè)委員會2014年第三次會議（2014,8,18-19日）National Institutes for Food and Drug ControlNational Institutes for Food and Drug Control四、眼膏、軟膏劑的微生物控制National Institutes for Food an

20、d Drug Control微生物專業(yè)委員會2013年第一次會議（2013,4,22-24）微生物專業(yè)委員會2013年第一次會議（2013,4,22-24日）National Institutes for Food and Drug Control眼用制劑最終意見: 全部眼用制劑均要求為無菌制劑！National Institutes for Food and Drug Control軟膏劑最終意見：1. “嚴重?zé)齻驀乐貏?chuàng)傷”必須無菌；2. 非無菌產(chǎn)品，企業(yè)在說明書中應(yīng)注明“本品為非無菌條件下生產(chǎn)”；3. 產(chǎn)品使用風(fēng)險由醫(yī)生評估。National Institutes for Food an

21、d Drug Control發(fā)展方向3藥品中污染菌的檢出與鑒定單憑藥典附錄，解決不了藥物多適用最優(yōu)樣性和藥物制劑多樣性問題；針對每一種藥物/劑型、每一種藥物建立最優(yōu)檢測方法是未來藥品微生物質(zhì)控的方向。藥品的多樣性藥物制劑的多樣性National Institutes for Food and Drug Control藥品中污染菌的殺滅與控制 防腐劑的控制-眼用制劑-糖漿劑、顆粒劑、干混懸劑等-部分注射劑 生物指示劑的控制 藥品水活度與微生物生長的關(guān)系研究National Institutes for Food and Drug Control水分與固體藥物的相互作用 當吸附水的量不斷增加后，可

22、在 水分在固體表面的吸附作用通常是可逆的；水分子的結(jié)合強度與水分子和固體表面之間的距離成反比；與固體表面氫鍵直接結(jié)合的單分子層結(jié)合的最緊密，不容易被微生物直接利用。固體表面形成多層結(jié)構(gòu)，其后的吸附水具有自由度較大，且較易重新解吸附成為自由水，可直接被微生物所利用。National Institutes for Food and Drug Control能否利用水活度的概念來控制藥品，特別是中藥中微生物的增長？ 分析中藥藥材/飲片水活度與微生物數(shù)量的關(guān)系，探討利用水活度控制中藥藥材/飲片中微生物數(shù)量增長的可行性，為中藥藥材/飲片的儲運方式提出合理性指導(dǎo)是一項非常重要的課題。National In

23、stitutes for Food and Drug Control藥品中污染菌的質(zhì)控限度質(zhì)控限度的個性化，即根據(jù)具體藥物的特點（藥學(xué)特點、工藝特點）制定限度。中藥標準要引領(lǐng)國際發(fā)展如何在中藥的發(fā)展過程中形成獨特的微生物限度標準，是目前我們面臨的最大挑戰(zhàn)！National Institutes for Food and Drug Control中藥污染菌的控制 能否針對口服中成藥品種的特點，根據(jù)其原材料、工藝及適應(yīng)癥，探討通過嚴格控制產(chǎn)品中的致病菌，而非產(chǎn)品中的總菌落數(shù)控制產(chǎn)品質(zhì)量的可能性？ 目的：減少企業(yè)為符合標準而采用過度的輻射滅菌行為。National Institutes for Fo

24、od and Drug Control相關(guān)標準及指導(dǎo)原則USP35部分章節(jié)Antimicrobial Effectiveness Testing中國藥典2015年版抑菌效力檢查法Biological Indicators-Resistance Performance Tests生物指示劑抗性檢查法Microbiological Examination of Nonsterile Products: MicrobialEnumeration Tests非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for SpecifiedMicroorganisms非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法非無菌藥品微生物限度標準Microbiological Attributes of Nonsterile Pha