1、STR-PCR半定量檢測(cè)嵌合體要領(lǐng)在非清髓異基因造血干細(xì)胞移植中的【摘要】目的應(yīng)用STR-PR半定量嵌合體檢測(cè)要領(lǐng)監(jiān)測(cè)非清髓異基因造血干細(xì)胞移植nn-yelablativeallgenEisteelltansplantatin，NAST后嵌合體。要領(lǐng)接納短串聯(lián)重復(fù)序列-聚合酶鏈反響STR-PR結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色以及凝膠成像闡發(fā)技能對(duì)28例擔(dān)當(dāng)NAST的患者舉行嵌合體監(jiān)測(cè)。效果27例患者形成造血細(xì)胞嵌合體，完全嵌合pletehieris，22例，混淆嵌合ixedhieris，5例；此中低比例嵌合llevelfixedhieris，L3例，高比例嵌合highlevelfixedhier

2、is，H2例。不變植入的患者+7天即達(dá)H，3例患者復(fù)發(fā)前檢測(cè)到供體細(xì)胞嵌合率dnrell，D落落，1例在狀態(tài)下復(fù)發(fā)，1例L產(chǎn)生早期移植排擠，恒久存活者均保持不變。嵌合體監(jiān)測(cè)下早期擔(dān)當(dāng)臨床干預(yù)治療的患者轉(zhuǎn)化為并延伸了無(wú)病保存期。結(jié)論STR-PR是一種簡(jiǎn)樸、敏感、經(jīng)濟(jì)的監(jiān)測(cè)非清髓移植后嵌合體的要領(lǐng)。熊輝霞1977，女，漢族，青海籍，主治醫(yī)師，碩士【關(guān)鍵詞】短串聯(lián)重復(fù)序列非清髓造血干細(xì)胞移植造血嵌合體KeyrdsshrttanderepeatsNn-yelablativesteelltransplantatinNeatpietihieris非清髓異基因造血干細(xì)胞移植NAST由于減量的放、化療預(yù)處置懲

3、罰加上強(qiáng)效的免疫按捺，移植后多形成供、受體細(xì)胞差異比例的混淆嵌合體，并呈動(dòng)態(tài)變革1,2。嵌合體監(jiān)測(cè)對(duì)闡發(fā)植入狀態(tài)，斷定疾病復(fù)發(fā)及引導(dǎo)移植后續(xù)治療具有緊張意義。短串聯(lián)重復(fù)序列STR是如今檢測(cè)嵌合體最常用的遺傳標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟，我們接納STR-PR半定量要領(lǐng)對(duì)28例擔(dān)當(dāng)NAST的患者舉行了嵌合體的檢測(cè)，現(xiàn)陳訴如下。1資料與要領(lǐng)1.1病例資料不雅察工具為2022年至2022年在東南大學(xué)隸屬中大病院血液科擔(dān)當(dāng)NAST的患者28例，男19例，女9例，年事15歲58歲，中位年事37歲。此中慢性粒細(xì)胞白血病L19例，慢性淋巴細(xì)胞白血病(LL)1例，急性非淋巴細(xì)胞白血病(AL)3例，骨髓增生非常綜合征(DS)4例

4、，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)1例。同胞供者24例，無(wú)血緣干系供者2例,HLA配型均為全相合；單倍型親緣供者2例，均為DR位點(diǎn)不合。供、受者性別相合18例，性別不合10例。AB血型相合21例，血型不合7例。1.2要領(lǐng)術(shù)前網(wǎng)羅供者和受者外周血2l，術(shù)后+7天、+14天、+21天、+30天網(wǎng)羅患者外周血，今后據(jù)患者隨訪(fǎng)時(shí)間網(wǎng)羅外周血每月1次或每3月1次。行供體淋巴細(xì)胞輸注dnrlyphyteinfusin，DLI治療后每15天網(wǎng)羅受者外周血1次，直至可評(píng)價(jià)的盡頭。移植后早期造血按捺期每次抽血5l，今后每次2l，AD抗凝，于采血后24h內(nèi)用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，提取白細(xì)胞，用helex-100法快速

5、提取基因組DNA，編號(hào)后置-20冰箱保存。本研究選擇STR位點(diǎn)的原那么是：均為四堿基重復(fù)序列錯(cuò)配較少；雜合度較高有較高的個(gè)別識(shí)別本領(lǐng)；等位基因個(gè)數(shù)適中，均勻610個(gè)易于分型；等位基因頻率在研究人群所屬地域漫衍較好。按文獻(xiàn)3,4選擇D5S818、D13S317、D3S1358、D8S1179、D7S820、D16S539、FGA、vA8個(gè)位點(diǎn)舉行檢測(cè)。先對(duì)供、受者術(shù)前標(biāo)本在上述8個(gè)位點(diǎn)舉行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物行非一連非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色顯影，按照等位基因途徑Ladder比較閱讀列位點(diǎn)的基因型,尋出各組供、受體可區(qū)分互相的有信息位點(diǎn)，按Thiede等5陳訴的要領(lǐng)舉行分類(lèi)，選擇出類(lèi)和類(lèi)位

6、點(diǎn)，術(shù)后標(biāo)本僅在類(lèi)和類(lèi)位點(diǎn)擴(kuò)增，凝膠用UVP成像闡發(fā)體系舉行灰度掃描后用Gel-Pr4.0軟件闡發(fā)，選擇相應(yīng)的公式以整合光密度ID值盤(pán)算供體細(xì)胞嵌合率D。完全嵌合體：D95%；混淆嵌合體：5%D95%；高比例嵌合體H：D50%；低比例嵌合體L：D50%。2效果移植1個(gè)月后，28例患者中僅1例DS-RA患者未檢測(cè)到嵌合體，造血始終未規(guī)復(fù)，AN0.1109/L，骨髓增生非常減低，證實(shí)移植失敗，于移植后45天死于嚴(yán)峻熏染。余27例患者均形成差異比例的供、受者造血細(xì)胞嵌合體，此中22例形成；5例形成；2例形成高比例混淆嵌合H；3例低比例混淆嵌合L。全部不變植入的患者在+7天時(shí)的均勻嵌合率是74.71%

7、，此時(shí)尚處于造血按捺期，+14天多數(shù)病例達(dá)，均勻嵌合率是95.74%。移植后隨訪(fǎng)1.5月27月，均勻11個(gè)月，22例患者中3例患者復(fù)發(fā)前檢測(cè)到D落落，1例在狀態(tài)下復(fù)發(fā)，恒久存活者均保持不變。5例患者中，1例L的LL患者早期出現(xiàn)移植排擠，+1月時(shí)STR-PR查抄僅在vA、D7S820、D5S818位點(diǎn)檢測(cè)到少量的供者型遺傳標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟D為27%，但血通例查抄提示造血規(guī)復(fù)，思量為早期移植排擠，自身造血規(guī)復(fù)，經(jīng)2次DLI后漸漸到達(dá)，并保持不變見(jiàn)圖1；另2例L患者早期復(fù)發(fā)，1例殞命，1例經(jīng)二次尺度移植后得到。2例H患者中的1例為L(zhǎng)，移植后1月即為D為54%，實(shí)時(shí)予DLI1次，DLI后+1.5月時(shí)已有治

8、療反響，D上升到80%，出院后患者未能繼承監(jiān)測(cè)嵌合體，+4月時(shí)出現(xiàn)遺傳學(xué)復(fù)發(fā)Ph陽(yáng)性染色體占90%，再次入院，予DLI1次，療效不佳，敏捷出現(xiàn)血液學(xué)復(fù)發(fā)，嵌合體檢測(cè)為完全受者型見(jiàn)圖2。另1例H患者+1月后舉行性落落，脾腫大，骨髓增生顯著活潑，診斷為脾成效亢進(jìn)，STR-PR查抄一連，DLI后未見(jiàn)D上升，+4月時(shí)行脾切除治療，+8月時(shí)轉(zhuǎn)為，并保持不變。3討論STR是一類(lèi)呈高度多態(tài)性的遺傳標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟，STR-PR技能敏捷、快速，是如今最常用的檢測(cè)嵌合體的要領(lǐng)之一7。國(guó)表里有多家移植單元接納熒光標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的多重PR結(jié)合DNA測(cè)序儀和基因掃描軟件步伐檢測(cè)嵌合體，固然具有主動(dòng)化程度高、無(wú)交織污染、省時(shí)

9、快速等長(zhǎng)處，但由于多個(gè)位點(diǎn)在同一反響管內(nèi)擴(kuò)增，其敏感性閾值較單一位點(diǎn)STR-PR要領(lǐng)的敏感性低，而且對(duì)儀器裝備要求高，恒久監(jiān)測(cè)用度昂貴，海內(nèi)難以普及。我們接納STR-PR結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色以及凝膠成像闡發(fā)技能檢測(cè)嵌合體的要領(lǐng)，起首挑選出能區(qū)別供、受體的有信息的位點(diǎn)，并進(jìn)一步尋出敏感性較高的闡發(fā)位點(diǎn)，在移植后嵌合體的恒久監(jiān)測(cè)中，我們只需選擇對(duì)供受者得當(dāng)?shù)纳贁?shù)位點(diǎn)舉行檢測(cè)即可反響充足的臨床信息，而且不需特別的試劑儀器，輕便易行。同時(shí)我們還創(chuàng)造，微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇非常緊張，并非全部的信息位點(diǎn)都得當(dāng)于嵌合體的定量檢測(cè)，有些位點(diǎn)在定性闡發(fā)時(shí)成心義，但在定量闡發(fā)時(shí)意義有限。嵌合體檢測(cè)的目的重要是

10、在以供者細(xì)胞為條件的條件下創(chuàng)造受者細(xì)胞，影響定量闡發(fā)效果的一個(gè)緊張因素是等位基因的長(zhǎng)度。由于PR時(shí)存在以下兩種征象影響擴(kuò)增服從的同等性：1短片斷優(yōu)先擴(kuò)增；2平臺(tái)效應(yīng)。因此，在選擇闡發(fā)位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)滿(mǎn)意受者等位基因長(zhǎng)度小于供者等位基因長(zhǎng)度。同時(shí)我們進(jìn)一步創(chuàng)造，假設(shè)目的基因是純合子，那么檢測(cè)的敏感性更高。但在現(xiàn)實(shí)應(yīng)用中，假設(shè)患者和供者的血緣干系非常近，有大概尋不到切合上述條件的STR位點(diǎn)，就不得不選擇一些敏感性較次的位點(diǎn)。我們的研究創(chuàng)造植入樂(lè)成的患者在+14天多數(shù)達(dá)，在之后的隨訪(fǎng)中，凡恒久存活的病例都能保持不變，5例均不不變，有D進(jìn)一步落落導(dǎo)致移植排擠和復(fù)發(fā)的傾向。此效果提示早期供體植入率是影響NAST可否產(chǎn)生移植排擠的緊張因素，+100天內(nèi)更應(yīng)增強(qiáng)嵌合體監(jiān)測(cè)并實(shí)時(shí)接納防范方法。STR-PR技能可在嚴(yán)峻粒細(xì)胞缺乏階段實(shí)行，嵌合體檢測(cè)固然不克不及直接檢測(cè)出殘留的白血病細(xì)胞，但由于受體細(xì)胞比例增長(zhǎng)與移植排擠和復(fù)發(fā)的傷害性高度相干8,9，因此可通過(guò)定量檢測(cè)供體細(xì)胞嵌合率，來(lái)斷定患者體內(nèi)殘留的受體細(xì)胞程度。DLI是移植后臨床干預(yù)治療的緊張構(gòu)成部門(mén)，其誘導(dǎo)的移植物抗白血病效應(yīng)graftversusleukeiaeffet，GVL在腫瘤細(xì)胞負(fù)荷低時(shí)易發(fā)揮根治性作用，掌握DLI的機(jī)